Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר בלוסה הרננדז (אוניברסיטת ליניפינג) על התיקון הקפדני של כתב היד והעצות החשובות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן קנוט ואליס ולנברג ובאזור המחקר האסטרטגי של הממשלה השבדית במדעי החומרים על חומרים פונקציונליים מתקדמים באוניברסיטת Linköping (גרנט הפקולטה SFO-Mat-ליו No. 2009-00971).

1. העיצוב וההכנה של הספרייה לאוסיונומן
<ol><li>עיצוב ספריה<ol>
<li>בהתבסס על הקריטריונים הבאים לעצב ספרייה של פלורסנט המאובתים בדיקה בדיקה בין 8 ו 12-מר ארוך כדי למנוע היווצרות מבנה משני, עם אורך שווה עבור כל הבדיקות.<ol>
<li>כלול לפחות דנ א אחד ורצף RNA אחד אקראי המכיל שילוב של אדנין (א), גואנין (G), ציטוס?...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

שינויים של פעילות נוקלאז היו קשורים עם מגוון רחב של פנוטיפים למחלות, כולל סוגים שונים של סרטן וזיהומים חיידקיים. שינויים אלה מוצעים להיות סוכן סיבתי של מצב14, ואילו במקרים אחרים הם תוצאה של האירוע הפיזיולוגי המזיק20 או סוכן פתוגניים16,26<...

הנוקלאוסים הם מחלקה של אנזימים המסוגלים לעזוב את איגרות הזרחן היוצרות את המבנה העמוד השדרה של מולקולות חומצות גרעין. הגיוון העצום של הנוקלאוסים הופך את הסיווג שלהם לקשה למדי. עם זאת, ישנם מספר קריטריונים נפוצים המשמשים לתיאור נוקלאוסים, כגון העדפה מצע (חומצה deoxyribonucleic (DNA) או חומצה ריבונוקלאית (RNA)), אתר המחשוף (לאנונוקלאוסים או אקסקליסים), או תלות יון מתכת, בין השאר1. הנוקלאוסים הם בעלי שימור מאוד אנזימים קטליטי שיש להם תפקידים בסיסיים הן, prokaryotic ואורגניזמים איקריוטית ושימשו, ולהמשיך לשמש, כמו כלים לעריכת גנים2. הם גם שחקנים בסיסיים בתחזוקת DNA ושכפול, עוזר לשמור על יציבות הגנום והשתתפות בתהליכי קריאה-הוכחה3. בחיידקים, למשל, הנוקלאוסים זוהו כגורמים חשובים התקפה אלימה, מסוגל לקדם הישרדות חיידקית על ידי הפחתת היעילות של המערכת החיסונית של המחשב המארח4,5,6,7 ,8. ב יונקים, הנוקלאוסים הציעו להיות מעורב ב אפופטוזיס9, ביוגנזה מיטוכונדריאלי ותחזוקה10 וגישור של התגובות החיסונית אנטיבקטריאלי ו אנטי ויראליות מולדים11. לא באופן מפתיע, שינויים בפעילות נוקלאז, אם שיפור או חוסר, היו מעורבים במגוון רחב של מחלות אנושיות. מחלות אלה נעות בין מגוון רחב של סרטן12,13 כדי היפרפרס לב10 או מחלות אוטואימוניות14. לכן, הנוקלאוסים הפכו למועמדים מעניינים כסמנים לקבוצה הטרוגנית של התנאים האנושיים. למעשה, הנוקלאוסים כבר הראו את הפוטנציאל שלהם ככלי אבחון מוצלח לאיתור זיהומים הנגרמים על ידי סוכני בקטריאלי ספציפיים, כגון האורהולוקוקוס אוes, האנציצ'יה קולי15, 16. בסוגים רבים של סרטן, הביטוי של הדומיין נוקלאז המכילים חלבון 1 (SND1) ריבונוקלאז מעיד על פרוגנוזה גרועה17. בחולי סרטן הלבלב, ריבונוקלאז מוגבה (rnase i) רמות סרום דווחו18 הציע להיות משויך עם פנוטיפים תאים סרטניים19. בתנאי לב האיסכמי, כגון אוטם שריר הלב או בלתי יציבה ומלא יציבות, deoxyribonuclease אני (dnase i) רמות סרום הוכחו להיות סמן אבחון חוקי20,21.
זה כבר שיערו כי השרטוט הגלובלי של פעילות נוקלאז עשוי להיות שונה במצבי בריא ומחלות. למעשה, דיווחים אחרונים השתמשו הבדלים בפעילות נוקלאז להבדיל בין פנוטיפים בריאים סרטניים22 או לזהות זיהומים חיידקיים פתוגניים באופן ספציפי מינים15,23. ממצאים אלה נפתחו שדרה חדשה לשימוש נוקלאוסים כמו סמנים של המחלה. לכן, קיים צורך בפיתוח שיטת הקרנה מקיפה מסוגל לזהות בשיטתיות הבדלים הקשורים המחלה בפעילות נוקלאז, אשר עשויה להיות חשיבות מרכזית בפיתוח של כלי אבחון חדשים.
להלן, אנו מציגים ומתארים חדש בגישה לסינון חוץ גופית (איור 1) כדי לזהות בדיקה רגישה וספציפית מסוגל להפלות בין פעילות נוקלאז בריא ולא בריא, או פעילות ספציפית לסוג של תא או חיידקים. ניצול של המודולריות של חומצות גרעין, עיצבנו ספרייה הראשונית של פלורסנט מנוחלת בדיקה המורכב של מערכת מקיפה של רצפים וchemistries שונים, שניהם להיות פרמטרים חשובים עבור עיצוב הספרייה. הבדיקות הללו הינן מקיפים את משני הגלים האלה באמצעות פלואורוופפור (פלואורואסעין אמדיום, משפחתי) ומוצא (הגאות מקומד 2, TQ2) ב -5 ' ו -3 ' מסתיים בהתאמה (שולחן 1). באמצעות העברת האנרגיה הזאת תהודה פלורסנט (למדוד) המבוססת על בסיס פלואורומטרי כדי לאמוד את הקינטיקה של השפלה אנזימטית, היינו מסוגלים לזהות בדיקה המועמדים עם פוטנציאל להפלות דפוסי הדיפרנציאליות של פעילות נוקלאז קשורה למצבי בריאות או מחלות. עיצבנו תהליך איטראטיבי, שבו הספריות החדשות נוצרות על בסיס הבדיקות הטובות ביותר, המאפשר זיהוי של בדיקת מועמדים ספציפית יותר בשלבי ההקרנה הבאים. יתר על כן, גישה זו מנצלת את האופי הקטליטי של הנוקלאוסים כדי להגביר את הרגישות. הדבר מושג על ידי ניצול האופי הפעילות של בדיקת הכתב ואת היכולת של נוקלאוסים לעבד באופן רציף מולקולות מצע, הן המייצג יתרונות מרכזיים על נוגדנים חלופיים או מולקולה קטנה מבוססת שיטות הקרנה.
גישה זו מציעה מודולרי מאוד, גמיש וקל ליישם כלי הקרנה לזיהוי של חומצות גרעין ספציפיות מסוגל להפלות בין מדינות בריאות ומחלות, פלטפורמה מצוינת לפיתוח של חדש כלי אבחון שניתן להתאים ליישומים קליניים עתידיים. ככזה, גישה זו שימש כדי לזהות את הפעילות נוקלאז נגזר סלמונלה typhimurium (להלן המכונה סלמונלה) עבור זיהוי ספציפי של חיידקים זה. בפרוטוקול הבא, אנו מדווחים על שיטה למסך עבור פעילות נוקלאז חיידקי באמצעות ניתוח קינטי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

הנוקלאוסים הם מעמד של אנזימים הנשברים חומצות גרעין על ידי מזרז את ההידרוליזה של איגרות הזרחן המקשרות בין סוכרים מריבוז. הנוקלאוטיות מציגות מגוון תפקידים פיזיולוגיים חיוניים באורגניזמים prokaryotic ו איקריוטית, החל לשמור על יציבות הגנום כדי לספק הגנה מפני פתוגנים. השתנה פעילות נוקלאז כבר שויך עם מספר תנאים פתולוגיים כולל זיהומים חיידקיים וסרטן. למטרה זו, פעילות נוקלאז הראתה פוטנציאל גדול להיות מנוצלת כמו סמנים ספציפיים. עם זאת, שיטת סינון איתנה המבוססת על פעילות זו נותרה רצויה מאוד.
בזאת, אנו מציגים שיטה המאפשרת הקרנה לפעילות נוקלאז באמצעות חומצות גרעין בדיקה כמו מצעים, עם היקף ההבחנה בין תנאים פתולוגיים ובריאים. שיטה זו מציעה את האפשרות לעצב ספריות בדיקה חדשות, עם הגדלת הספציפיות, באופן איטרטיבי. כך, סיבובים מרובים של הקרנה נחוצים כדי לחדד את עיצוב הבדיקות עם תכונות משופרות, ניצול הזמינות של חומצות גרעין כימית שונה. הפוטנציאל הניכר של הטכנולוגיה המוצעת טמון בגמישות שלה, ביכולת הגבוהה ביותר, ורב-תכליתיות עבור הקרנת פעילות נוקלאז הקשורה לתנאי מחלה. צפוי כי טכנולוגיה זו תאפשר פיתוח של כלי אבחון מבטיח עם פוטנציאל גדול במרפאה.

איור 1 מציג את זרימת העבודה של מתודולוגיה זו, אשר מחולקת לשני סיבובים הקרנה. בסיבוב הראשון של ההקרנה, השתמשנו 5 בדיקות DNA (DNA, ה-dna פולי, DNA פולי, dna פולי ו-DNA פולי G) וכן גם 5 בדיקות RNA (RNA, RNA פולי A, RNA פולי rna ו-rna פולי). את הנתונים הגולמיים של סיבוב ההקרנה ניתן למצוא בטבלה השלמה 1.</str...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

פעילות נוקלאז שונה היתה קשורה לתנאים אנושיים שונים, המשמש כבסיס הפוטנציאל שלה כמו סמנים. מודולרי וקל ליישם את מתודולוגיית ההקרנה הציג בנייר זה מאפשר את הבחירה של חומצות גרעין ספציפיים בדיקה לרתימת פעילות נוקלאז כמו סמנים של מחלה.

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

פרוטוקול זה מספק חלופה רבת עוצמה לסינון פעילות גרעין כמו סמן ביולוגי של מחלה, עם מתודולוגיה קלה ליישום גם עבור חוקרים שאינם מתמחים כמו בדיקות חומצת גרעין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבחור בדיקות חומצת גרעין שיכול לזהות פעילויות גרעין ידועות ולא ידועות, תוך ניצול האינטראקציה הדינמית של גשושית-גרעין. יתרונות נוספים של מתודולוגיה זו הם גמישותה, יכולת הרבייה הגבוהה וקלות השימוש בה.ההפגנה תבוצע על ידי חדיג'ה, סטודנטית לתואר שני, ובאריס, פוסט-דוק מהמעבדה שלנו. בעת תכנון ספריית אוליגונוקלאוטיד, כוללים לפחות דנ"א אחד ורצף אקראי אחד של רנ"א המכיל שילוב של אדנין, גואנין, ציטוצין ותיאמין או אורסיל. כדי להכין את הבדיקות oligonucleotide, לסובב את גשושי oligonucleotide lyophilized לדלל כל בדיקה במאגר טריס-EDTA בריכוז 500 picomolar לכל microliter כדי למנוע השפלה נוקלאז.לתרבות חיידקים על מדיום מוצק, יש לגלגל חרוז זכוכית נקבובי יחיד מאחסון קריוגני ישירות על צלחת תרבות אחת המכילה TSA בתוספת דם כבשים מנופח כדי לפס החוצה מושבות חיידקיות בודדות. לאחר מכן מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לתרבות חיידקית במדיום נוזלי, מעבירים מושבה אחת מתרבות בינונית מוצקה ל-50 מיליליטר של TSB עבור דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ב-200 סיבובים לדקה.למחרת, לדלל את התרבות ביחס של 1 עד 500 TSB טריים ולהחרב את החיידקים במשך 24 שעות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סיבובים לדקה באינקובטור רועד. כדי להקים בדיקת פעילות גרעין, תחילה לחמם מראש פלואורומטר ל 37 מעלות צלזיוס בזהירות להוסיף 96 microliters של TSB סטרילי או supernatant מ סלמונלה או E.Coli נוזלי תרבות בינונית אחד 1.5 מיליליטר ללא נוקלאז צינור microcentrifuge לכל בדיקה. הוסף ארבעה microliters של פתרון עבודה בדיקה לכל צינור ולהשתמש פיפטה לערבב ביסודיות כל תוכן צינור עד פתרונות הומוגניים מושגים, דואג להימנע בועות.לאחר מכן, בזהירות לטעון 95 microliters של כל פתרון קרוב לקיר של בארות בודדות של תחתית שחורה, לא מטופלים 96 צלחת גם, דואג להימנע בועות. לאחר הוספת כל הפתרונות, כסו את הלוח ובדקו ויזואלית את המכסה לסימוני עט או אבק שעשויים להציג חפצי מדידה. כדי להגדיר את התוכנה למדידת פעילות גרעין, פתח תוכנת רכישה מתאימה.בחר קרא כעת מחלון מנהל המשימות ובחר חדש כדי ליצור את פרוטוקול המדידה הקינטית. לחץ על הגדר טמפרטורה כדי לבחור 37 מעלות צלזיוס ולאשר ולשמור את ההגדרות על ידי לחיצה על אישור. לחץ על התחל קינטיקה. בחלון המוקפץ, בחר שעתיים בתיבת הקלט זמן ריצה ושתי דקות בתיבת הקלט של מרווח הזמן לפני שתלחץ על אישור כדי לאשר ולשמור את ההגדרות.לחץ על קרא. בחלון הנפתח, בחר בעוצמת פלואורסצנטיות כשיטה לזיהוי, נקודת קצה קינטית כתב קריאה ומסננים כסוג אופטיקה. לאחר מכן לחץ על אישור. בחלון הנפתח, בחרו 'ירוק' מ'ערכת המסננים' ולחצו על הלחצן 'אשר'. בחלון פרוצדורה, בחר השתמש במכסה ולחץ על אמת.יופיע חלון מוקפץ המאשר שהפרוטוקול שנוצר חוקי. תחת תפריט פרוטוקול, בחר פרוצדורה. בחלון פרוצדורה, הגדר את הבאר שיש למדוד והזן את שם הניסוי בתיבת הקלט שם הקובץ.לאחר מכן לטעון את הלוח לתוך קורא הלוח, דואג כי הצלחת היא בכיוון הנכון ולחץ על כפתור קרא חדש כדי להתחיל את הרכישה. לניתוח נתונים, פתחו את הנתונים בתוכנת הניתוח המתאימה ובחרו אחת מה בארות הנמדדות בחלון הלוח אחד. לחצו על 'בחר בארות' וכלולו את כל הבארים שנמדדו בחלון הדו-שיח 'בחירת באר' לפני שתלחץ על 'אשר'. לאחר מכן בחרו 'נתונים' בחלון הלוח אחד כדי להמחיש את התוצאות בטבלה ולחצו על QuickExport כדי לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.בגיליון אלקטרוני, סמן את עמודות הנתונים בהתאם לצורך עבור כל דגימה ובדיקה, והתוות את יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות לעומת הזמן כדי שהנתונים ייצרו גרפים קינטיים. בניסוי מייצג זה, לאחר סבב ההקרנה הראשון, על-טבעי תרבות הסלמונלה דיווחו על העדפה ברורה לבדיקות RNA על פני בדיקות הדנ"א. בהתבסס על זיהוי של RNA כסוג חומצת הגרעין המועדף על ידי גרעיני סלמונלה, ספרייה חדשה RNA בלבד נועד לשמש בסיבוב השני של ההקרנה.לעומת זאת, E.Coli בתרבות פקדים בינוניים הפגינו יכולת מוגבלת מאוד להשפיל בדיקות RNA. לאחר סבב שני של הקרנה באמצעות נוקלאוטידים שעברו שינוי כימי שמטרתם להגדיל את הספציפיות של בדיקות ה-RNA, ניתן לזהות RNA pyrimidine 2'O-methyl ו- RNA purine 2'O-methyl על בסיס השינויים הכימיים שלהם כמציגים את ההתנהגות הקינטית בעלת הביצועים הטובים ביותר בהשוואה לפירמידין RNA 2'fluoro ו- RNA purine 2'fluoro בהתאמה. תוצאות אלה מצביעות על כך שלסלמונלה יש פעילות RNAse חשובה עם העדפת כימיית מצע דיפרנציאלית שניתן להשתמש בה לבחירת בדיקות המסוגלות לזהות באופן ספציפי חיידק זה.הליך זה מאפשר בחירת בדיקות שמצליחות לזהות פעילויות גרעין הקשורות לתנאי מחלה, כגון סרטן או זיהום חיידקי, ומאפשר פיתוח של כלי אבחון קליניים חדשניים.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

חיישן מבוסס-Polyaniline של חומצות גרעין

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

הערכת תכולת ביומסה ליגנין צמחית באמצעות חומצה תיוגליקולית (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

זיהוי G-Quadruplexes בתבנית DNA באמצעות מיפוי כימי

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

מחבר זרקור: אפיון DNA G-Quadruplex על ידי מיפוי כימי מבוסס Bis-3-Chloropiperidine 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...