Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
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लेखक पांडुलिपि और मूल्यवान सलाह के उसे सावधान संशोधन के लिए Luiza I. Hernandez (लिंकिंग विश्वविद्यालय) को स्वीकार करना चाहते हैं. इस काम Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन और लिंकिंग विश्वविद्यालय में उन्नत कार्यात्मक सामग्री पर सामग्री विज्ञान में स्वीडिश सरकार सामरिक अनुसंधान क्षेत्र द्वारा समर्थित किया गया था (फैकली अनुदान SFO-Mat-LiU नहीं 2009-00971).

1. ओलिगोन्यूक्लिओटाइड पुस्तकालय डिजाइन और तैयारी
<ol><li>लाइब्रेरी डिजाइन<ol>
<li>निम्नलिखित मानदंडों के आधार पर सभी जांच के लिए समान लंबाई के साथ, माध्यमिक संरचना गठन से बचने के लिए 8 और 12-मर लंबे समय के बीच शमन ...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

न्यूक्लीज गतिविधि के परिवर्तन कैंसर और जीवाणु संक्रमण के विभिन्न प्रकार सहित रोग phenotypes की एक विस्तृत विविधता के साथ जुड़ा हुआ है. ये परिवर्तन14शर्त के कारक एजेंट होने का प्रस्ताव है , जबकि अन्य म...

न्यूक्लीज, फॉस्फोडाइस्टर आबंधों को बंद करने में सक्षम एंजाइमों का एक वर्ग है जो न्यूक्लिक अम्ल अणुओं की रीढ़ की संरचना बनाते हैं। nucleases के विशाल विविधता उनके वर्गीकरण बल्कि मुश्किल बना देता है. हालांकि, वहाँ कुछ आम मापदंड nucleases का वर्णन करने के लिए उपयोग किया जाता है, इस तरह के सब्सट्रेट वरीयता के रूप में (deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) या ribonucleic एसिड (RNA)), दरार साइट (endonucleases या exonucleases), या धातु आयन निर्भरता, दूसरों के बीच1. न्यूक्लेस अत्यधिक संरक्षित उत्प्रेरक एंजाइम हैं जिनकी दोनों में मौलिक भूमिका होती है, प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक जीवों और उपयोग किया गया है, और जीन संपादन उपकरण2के रूप में उपयोग किया जा रहा है। वे भी डीएनए रखरखाव और प्रतिकृति में मौलिक अभिनेता हैं, जीनोम स्थिरता रखने के लिए और सबूत पढ़ने की प्रक्रिया में भाग लेने में मदद3. बैक्टीरिया में, उदाहरण के लिए, nucleases महत्वपूर्ण उग्र कारकों के रूप में पहचान की गई है, मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रभावकारिता को कम करने में सक्षम4,5,6,7 ,8. स्तनधारियों में, न्यूक्लिएस को एपोप्टोसिस9, माइटोकोंड्रियाल बायोजेनेसिस और रखरखाव10 और जीवाणुरोधी और एंटीवायरल जन्मजात प्रतिरक्षाप्रतिक्रियाओंकी मध्यस्थता में फंसाने का सुझाव दिया गया है। आश्चर्य की बात नहीं है, nuclease गतिविधि परिवर्तन, चाहे वृद्धि या की कमी, मानव रोगों की एक विस्तृत सरणी में फंसाया गया है. ये रोग विभिन्न प्रकार के कैंसरों से लेकर12,13 से हृदय अतिवृद्धि10 या ऑटोम्यून्यून रोग14तक होते हैं . इसलिए, nucleases मानव स्थितियों के एक विषम समूह के लिए biomarkers के रूप में दिलचस्प उम्मीदवार बन गए हैं. वास्तव में, nucleases पहले से ही विशिष्ट जीवाणु एजेंटों की वजह से संक्रमण का पता लगाने के लिए सफल नैदानिक उपकरण के रूप में अपनी क्षमता दिखाया है, जैसे Staphylococcus ऑरियस या Escherichia कोलाई15, 16.कई प्रकार के कैंसर में, स्टैफिलोकोकल न्यूक्लेस डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एसएनडी1) राइबोन्यूलेस की अभिव्यक्ति खराब पूर्वानुमान17का संकेत है। अग्नाशय के कैंसर के रोगियों में, ऊंचा ribonuclease मैं (RNase मैं) सीरम का स्तर सूचित किया गया है18 और कैंसर सेल phenotypes के साथ जुड़े होने का प्रस्ताव19. इस्कीमिक हृदय की स्थिति में, जैसे मायोकार्डियल इंफार्क्शन या अस्थिर एंजिना पिक्टोरिस, deoxyribonuclease I (DNase I) सीरम स्तर को एक वैध नैदानिक मार्कर20,21दिखाया गया है।
यह अनुमान लगाया गया है कि nuclease गतिविधि के वैश्विक खाका स्वस्थ और रोग राज्यों में अलग हो सकता है. वास्तव में, हाल की रिपोर्टों में न्यूक्लेस गतिविधि में अंतर का उपयोग स्वस्थ और कैंसर phenotypes22 के बीच अंतर करने के लिए या एक प्रजाति विशेष तरीके से रोगजनक जीवाणु संक्रमण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कियाहै 15,23. इन निष्कर्षों ने रोग के बायोमार्कर के रूप में न्यूक्लीज के उपयोग के लिए एक नया अवसर खोल दिया है। इसलिए, वहाँ एक व्यापक स्क्रीनिंग विधि के विकास के लिए एक आवश्यकता मौजूद है व्यवस्थित nuclease गतिविधि में रोग जुड़े मतभेदों की पहचान करने में सक्षम है, जो नए नैदानिक उपकरणों के विकास में महत्वपूर्ण महत्व का हो सकता है.
इसमें, हम एक नए इन विट्रो स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का परिचय और वर्णनकरतेहैं ( चित्र 1 ) संवेदनशील और विशिष्ट जांचों की पहचान करने के लिए जो स्वस्थ और अस्वस्थ, या किसी प्रकार के सेल या बैक्टीरिया के लिए विशिष्ट गतिविधि के बीच भेदभाव करने में सक्षम होते हैं। न्यूक्लिक एसिड की प्रतिरूपकता का लाभ उठाते हुए, हम विभिन्न दृश्यों और chemistries की एक व्यापक सेट से मिलकर बुझा फ्लोरोसेंट ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच के एक प्रारंभिक पुस्तकालय बनाया गया है, दोनों पुस्तकालय डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर जा रहा है. इन ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांचों को एक फ्लोरोफोर (फ्लोरेसीन ऐमिआइट, एएम) और एक क्वेन्चर (टाइड क्वेन्चर 2, TQ2) द्वारा क्रमशः 5' और 3' सिरा पर लगाया जाता है(तालिका 1)। एंजाइमी गिरावट की गतिकी को मापने के लिए इस फ्लोरोसेंट अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख का उपयोग करके, हम nuclease गतिविधि के अंतर पैटर्न भेदभाव करने की क्षमता के साथ उम्मीदवार जांच की पहचान करने में सक्षम थे स्वस्थ या रोग राज्यों के साथ जुड़े. हमने एक पुनरावर्ती प्रक्रिया तैयार की है, जिसमें सबसे अच्छे उम्मीदवार जांच के आधार पर नए पुस्तकालयों का निर्माण किया जाता है, जो बाद में स्क्रीनिंग चरणों में कभी अधिक विशिष्ट उम्मीदवार जांच की पहचान की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए nucleases के उत्प्रेरक प्रकृति का लाभ लेता है. यह रिपोर्टर जांच के सक्रिय प्रकृति का लाभ लेने और लगातार सब्सट्रेट अणुओं की प्रक्रिया करने के लिए nucleases की क्षमता का लाभ लेने के द्वारा हासिल की है, दोनों वैकल्पिक एंटीबॉडी या छोटे अणु आधारित स्क्रीनिंग तरीकों पर महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व.
यह दृष्टिकोण एक अत्यधिक मॉड्यूलर प्रदान करता है, लचीला और विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड की पहचान के लिए स्क्रीनिंग उपकरण को लागू करने के लिए आसान स्वस्थ और रोग राज्यों के बीच भेदभाव करने में सक्षम जांच, और नए के विकास के लिए एक उत्कृष्ट मंच नैदानिक उपकरण है कि भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रकार, इस दृष्टिकोण का उपयोग इस बैक्टीरिया की विशिष्ट पहचान के लिए साल्मोनेला टाइफिमुरियम (यहां साल्मोनेलाके रूप में संदर्भित) से व्युत्पन्न न्यूकेलेस गतिविधि की पहचान करने के लिए किया गया था। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम गतिज विश्लेषण का उपयोग करके जीवाणु न्यूक्लेस गतिविधि के लिए स्क्रीन करने के लिए एक विधि पर रिपोर्ट करते हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

न्यूक्लीज एंजाइमों का एक वर्ग है कि फॉस्फोडीस्टर बांड है कि राइबोस शर्करा को जोड़ने के hydrolysis उत्प्रेरित द्वारा न्यूक्लिक एसिड टूट रहे हैं. Nucleases प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक जीवों में महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिकाओं की एक किस्म प्रदर्शित करते हैं, जीनोम स्थिरता को बनाए रखने से लेकर रोगजनकों के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करने के लिए. परिवर्तित न्यूक्लीज गतिविधि जीवाणु संक्रमण और कैंसर सहित कई रोग की स्थिति के साथ जुड़ा हुआ है. यह अंत करने के लिए, nuclease गतिविधि महान क्षमता एक विशिष्ट biomarker के रूप में शोषण किया जा दिखाया गया है. हालांकि, इस गतिविधि के आधार पर एक मजबूत और पुन: उत्पादन योग्य स्क्रीनिंग विधि अत्यधिक वांछनीय बनी हुई है।
इसमें, हम एक विधि है कि nuclease गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है substrates के रूप में न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग शुरू, रोग और स्वस्थ स्थितियों के बीच differentiating के दायरे के साथ. इस विधि नए जांच पुस्तकालयों डिजाइन की संभावना प्रदान करता है, विशिष्टता में वृद्धि के साथ, एक पुनरावर्ती तरीके से. इस प्रकार, स्क्रीनिंग के कई दौर बढ़ाया सुविधाओं के साथ जांच डिजाइन को परिष्कृत करने के लिए आवश्यक हैं, रासायनिक संशोधित न्यूक्लिक एसिड की उपलब्धता का लाभ ले. प्रस्तावित प्रौद्योगिकी की काफी क्षमता रोग की स्थिति के साथ जुड़े nuclease गतिविधि की स्क्रीनिंग के लिए अपने लचीलेपन, उच्च reproducibility, और बहुमुखी प्रतिभा में निहित है. यह उम्मीद है कि इस तकनीक क्लिनिक में एक महान क्षमता के साथ होनहार नैदानिक उपकरणों के विकास की अनुमति देगा.

चित्र 1 इस पद्धति के कार्य प्रवाह को दर्शाता है, जिसे दो स्क्रीनिंग राउंड में विभाजित किया गया है। स्क्रीनिंग के पहले दौर में, हम 5 डीएनए जांच (डीएनए, डीएनए पाली ए, डीएनए पाली टी, डीएनए पाली सी और...

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

बदल nuclease गतिविधि विभिन्न मानव स्थितियों के साथ संबद्ध किया गया है, एक biomarker के रूप में अपनी क्षमता अंतर्निहित. मॉड्यूलर और इस पत्र में प्रस्तुत स्क्रीनिंग पद्धति को लागू करने के लिए आसान रोग के एक biomarker के रूप में nuclease गतिविधि का दोहन करने के लिए विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड जांच के चयन की अनुमति देता है.

न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग कर न्यूक्लीज गतिविधि का काइनेटिक स्क्रीनिंग

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

यह प्रोटोकॉल रोग के बायोमार्कर के रूप में नाभिक गतिविधि की स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली विकल्प प्रदान करता है, शोधकर्ताओं के लिए भी एक आसान-से-लागू करने की पद्धति के साथ जो न्यूक्लिक एसिड जांच में विशिष्ट नहीं हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ न्यूक्लिक एसिड जांच का चयन करने की क्षमता है जो जांच-नाभिक गतिशील बातचीत का लाभ उठाते हुए ज्ञात और अज्ञात नाभिक गतिविधियों दोनों की पहचान कर सकती है। इस पद्धति के अन्य फायदे इसकी लचीलापन, उच्च प्रजनन क्षमता और उपयोग में आसानी है।यह प्रदर्शन खदीजा, परास्नातक छात्र और हमारी प्रयोगशाला से पोस्टडॉक करने वाले बारिस द्वारा किया जाएगा । ओलिगोन्यूक्लियोटाइड लाइब्रेरी डिजाइन करते समय, कम से कम एक डीएनए और एक आरएनए यादृच्छिक अनुक्रम शामिल है जिसमें एडेनिन, ग्वानाइन, साइटोसाइन और थियामाइन या यूरासिल का संयोजन होता है। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच तैयार करने के लिए, लियोफिलाइज्ड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच को नीचे स्पिन करें और नाभिक क्षरण को रोकने के लिए 500 पिकोमोलर प्रति माइक्रोलीटर एकाग्रता पर ट्रिस-ईडीएडब्ल्यूटी बफर में प्रत्येक जांच को पतला करें।ठोस माध्यम पर जीवाणु संस्कृति के लिए, क्रायोजेनिक भंडारण से सीधे एक चीनी ग्लास मनका रोल करें जिसमें टीएसए को अलग-अलग बैक्टीरियल कॉलोनियों को बाहर निकालने के लिए डिफिब्रिनेड भेड़ रक्त के साथ पूरक किया जाता है। इसके बाद थाली को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। तरल माध्यम में बैक्टीरियल संस्कृति के लिए, एक ठोस माध्यम संस्कृति से एक कॉलोनी को 200 घूर्णन प्रति मिनट पर 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के लिए टीएसबी के 50 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें।अगले दिन, ताजा टीएसबी में एक से ५०० अनुपात में संस्कृति को पतला करें और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस और २०० घूर्णन प्रति मिनट पर अतिरिक्त 24 घंटे के लिए बैक्टीरिया को इनक्यूबेट करें । एक नाभिक गतिविधि परख स्थापित करने के लिए, पहले ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए एक फ्लोरोमीटर पूर्व गर्म और ध्यान से एक साल्मोनेला या ई. कोलाई तरल मध्यम संस्कृति से बाँझ TSB या सुपरनैटेंट के ९६ माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक १.५ मिलीलीटर नाभिक मुक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब प्रति जांच । प्रत्येक ट्यूब के लिए जांच काम समाधान के चार माइक्रोलीटर जोड़ें और एक पिपेट का उपयोग अच्छी तरह से प्रत्येक ट्यूब सामग्री मिश्रण जब तक समरूप समाधान प्राप्त कर रहे हैं, बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखते हुए ।इसके बाद, बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखते हुए, काले नीचे के व्यक्तिगत कुओं की दीवार के करीब प्रत्येक समाधान के 95 माइक्रोलीटर को सावधानी से लोड करें, गैर-इलाज 96 अच्छी तरह से प्लेट। जब सभी समाधान जोड़े गए हैं, तो प्लेट को कवर करें और नेत्रहीन पेन चिह्नों या धूल के लिए ढक्कन का निरीक्षण करें जो माप कलाकृतियों को पेश कर सकते हैं। नाभिक गतिविधि माप के लिए सॉफ्टवेयर स्थापित करने के लिए, एक उपयुक्त अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें।कार्य प्रबंधक विंडो से अब पढ़ें चुनें, और गतिज माप प्रोटोकॉल बनाने के लिए नए का चयन करें। 37 डिग्री सेल्सियस का चयन करने के लिए सेट टेम्परेचर पर क्लिक करें और ओके पर क्लिक करके सेटिंग्स की पुष्टि और बचत करें। क्लिक करें काइनेटिक्स शुरू करें। पॉप-अप विंडो में, सेटिंग्स की पुष्टि और सहेजने के लिए ओके पर क्लिक करने से पहले रन टाइम इनपुट बॉक्स में दो घंटे और इंटरवल इनपुट बॉक्स में दो मिनट का चयन करें।क्लिक करें पढ़ें। पॉप-अप विंडो में, फ्लोरेसेंस तीव्रता को डिटेक्शन मेथड के रूप में चुनें, एंडपॉइंट गतिज को रीड टाइप के रूप में और ऑप्टिक्स टाइप के रूप में फ़िल्टर करें। इसके बाद ओके पर क्लिक करें। पॉप-अप विंडो में, फ़िल्टर सेट से ग्रीन का चयन करें और ओके पर क्लिक करें। प्रक्रिया विंडो में, उपयोग ढक्कन का चयन करें और मान्य पर क्लिक करें।एक पॉप-अप विंडो इस बात की पुष्टि करते हुए दिखाई देगी कि बनाया गया प्रोटोकॉल मान्य है। प्रोटोकॉल मेनू के तहत, प्रक्रिया का चयन करें। प्रक्रिया खिड़की में, कुओं को मापा जा करने के लिए परिभाषित करें और फ़ाइल नाम इनपुट बॉक्स में प्रयोग का नाम दर्ज करें।फिर प्लेट रीडर में प्लेट लोड करें, ध्यान रखें कि प्लेट सही अभिविन्यास में है और अधिग्रहण शुरू करने के लिए रीड नया बटन क्लिक करें। डेटा विश्लेषण के लिए, उचित विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा खोलें, और प्लेट एक खिड़की में मापा कुओं में से एक का चयन करें । क्लिक करें कुओं का चयन करें और ठीक क्लिक करने से पहले अच्छी तरह से चयन संवाद खिड़की में मापा कुओं के सभी शामिल हैं । फिर सारणीबद्ध परिणामों की कल्पना करने के लिए प्लेट एक विंडो में डेटा का चयन करें और डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करने के लिए क्विकएक्सपोर्ट पर क्लिक करें।स्प्रेडशीट में, प्रत्येक नमूने और जांच के लिए उपयुक्त डेटा कॉलम लेबल करें, और काइनेटिक ग्राफ उत्पन्न करने के लिए डेटा के लिए समय बनाम सापेक्ष फ्लोरेसेंस इकाइयों को प्लॉट करें। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, स्क्रीनिंग के पहले दौर के बाद, साल्मोनेला संस्कृति supernatants डीएनए जांच पर आरएनए जांच के लिए एक स्पष्ट वरीयता की सूचना दी । साल्मोनेला न्यूक्लियस द्वारा पसंदीदा न्यूक्लिक एसिड प्रकार के रूप में आरएनए की पहचान के आधार पर, स्क्रीनिंग के दूसरे दौर में उपयोग करने के लिए एक नई आरएनए-केवल पुस्तकालय डिज़ाइन किया गया है।इसके विपरीत, संस्कृति मध्यम नियंत्रण में ई. कोलाई आरएनए जांच को नीचा दिखाने के लिए एक बहुत ही सीमित क्षमता का प्रदर्शन किया । आरएनए जांच की विशिष्टता बढ़ाने के उद्देश्य से रासायनिक रूप से संशोधित न्यूक्लियोटिड्स का उपयोग करके स्क्रीनिंग के दूसरे दौर के बाद, आरएनए पाइरिमिडीन 2'ओ-मिथाइल और आरएनए प्यूरिन 2'ओ-मिथाइल को उनके रासायनिक संशोधनों के आधार पर पहचाना जा सकता है, जब आरएनए पाइरिमिडीन 2'फ्लोरो और आरएनए प्यूरिन 2'फ्लोरो की तुलना में सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जा रहा है। इन परिणामों से पता चलता है कि साल्मोनेला में अंतर सब्सट्रेट रसायन शास्त्र वरीयता के साथ एक महत्वपूर्ण आरएनईई गतिविधि है जिसका उपयोग विशेष रूप से इस बैक्टीरिया को पहचानने में सक्षम जांच का चयन करने के लिए किया जा सकता है।यह प्रक्रिया उन जांचों के चयन में सक्षम बनाती है जो कैंसर या बैक्टीरियल संक्रमण जैसी रोग की स्थितियों से जुड़ी नाभिक गतिविधियों की पहचान करने में सक्षम हैं, जिससे उपन्यास नैदानिक नैदानिक उपकरणों के विकास की अनुमति मिलती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

न्यूक्लिक एसिड की एक polyaniline आधारित सेंसर

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

तैयारी और<em&gt; Vivo</em&gt; के लिए एक गतिविधि आधारित जांच के उपयोग<em&gt; एन</em&gt; -acylethanolamine एसिड Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobic प्रोटीन शुद्धि और काइनेटिक विश्लेषण DesB Dioxygenase गतिविधि और संकोच का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के माध्यम से

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

दुर्लभ-कोडोन-रिच मार्करों का उपयोग कर एमिनो एसिड ओवरप्रोड्यूसर की पहचान करना

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

न्यूक्लीज-फ्री ऑक्सीजन स्कैवेंडर प्रोटोकैकेट 3,4-डिऑक्सिकाज़ की अभिव्यक्ति और शुद्धि

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

एक सेल आधारित एस्ट्रोजन रिसेप्टर β रिपोर्टर परख का उपयोग कर फाइटोएस्ट्रोजेन के लिए स्क्रीनिंग

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

रैंडम माइक्रोसीेड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग का उपयोग करके I3C के साथ प्रोटीन क्रिस्टल का व्युत्पन्न

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) का उपयोग करके पौधे बायोमास लिग्निन सामग्री का अनुमान

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

ओपन-सोर्स smfBox का उपयोग कर सटीक और सटीक एकल-अणु FRET माप बनाना

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री का उपयोग करके डीएनए एपटामर और टेट्रासाइक्लिन के थर्मोडायनामिक और काइनेटिक एसोसिएशन का निर्धारण करना

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...