Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
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Gli autori desiderano riconoscere Luiza I. Hernandez (Università di Linkaping) per la sua attenta revisione del manoscritto e preziosi consigli. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Knut and Alice Wallenberg e dalla Swedish Government Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials presso l'Università di Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU n. 2009-00971).

1. Progettazione e preparazione della libreria Oligonucleotide
<ol><li>Progettazione della libreria<ol>
<li>Sulla base dei seguenti criteri, progettare una libreria di sonde oligonucleotide dissedate tra 8 e 12-mer lunghe per evitare la formazione secondaria della struttura, con uguale lunghezza per tutte le sonde.<ol>
<li>Includere almeno un DNA e una sequenza casuale di RNA contenente una combinazione di adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T)/uracil (U) (sondedi DNA e RNA nella tabella 1...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. 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I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Le alterazioni dell'attività di nuclease sono state associate a un'ampia varietà di fenotipi della malattia, tra cui diversi tipi di cancro e infezioni batteriche. Queste alterazioni sono proposte come l'agente causale di una condizione14, mentre in altri casi sono la conseguenza di un evento fisiologico dannoso20 o agente patogeno16,26. Non sorprende che i tentativi di utilizzare nucleasi e attività di nucleasi ...

Le nucleasi sono una classe di enzimi in grado di fendere i legami di fosforestro che formano la struttura della spina dorsale delle molecole di acido nucleico. La grande diversità di nucleasi rende la loro classificazione piuttosto difficile. Tuttavia, ci sono alcuni criteri comuni utilizzati per descrivere le nucleasi, come la preferenza del substrato (acido deossiribonucleico (DNA) o acido ribonucleico (RNA), sito di scissione (endonucleases o esonucleasi), o dipendenza da ioni onani metallici, tra gli altri1. Le nucleasi sono enzimi catalitici altamente conservati che hanno ruoli fondamentali in entrambi gli organismi procariotici ed eucarioti e sono stati utilizzati, e continuano ad essere utilizzati, come strumenti di editing genico2. Sono anche attori fondamentali nella manutenzione e replicazione del DNA, contribuendo a mantenere la stabilità del genoma e partecipando ai processi di proof-reading3. Nei batteri, ad esempio, le nucleasi sono state identificate come importanti fattori di virulenza, in grado di promuovere la sopravvivenza batterica riducendo l'efficacia del sistema immunitario dell'ospite4,5,6,7 ,8. Nei mammiferi, le nucleasi sono state suggerite per essere implicate nell'apoptosi9, biogenesi mitocondriale e manutenzione10 e mediazione delle risposte immunitarie innate antibatteriche e antivirali11. Non sorprende che le alterazioni dell'attività di nucleamento, sia in miglioramento che in mancanza, siano state implicate in una vasta gamma di malattie umane. Queste malattie vanno da un'ampia varietà di tumori12,13 a ipertrofia cardiaca10 o malattie autoimmuni14. Pertanto, le nucleasi sono diventate candidati interessanti come biomarcatori per un gruppo eterogeneo di condizioni umane. Infatti, le nucleasi hanno già mostrato il loro potenziale come strumenti diagnostici di successo per il rilevamento di infezioni causate da specifici agenti batterici, come Staphylococcus aureus o Escherichia coli15, 16.In molti tipi di cancro, l'espressione della proteina ribonuclease nuclease nuclease stafilocca del dominio di nuclease 1 (SND1) è indicativa di prognosi infausta17. Nei pazienti affetti da cancro al pancreas, sono stati riportati18 livelli elevati di siero ribonuclease I (RNase I) e proposti di essere associati a fenotipi cellulari cancerosi19. In condizioni cardiache ischemiche, come l'infarto miocardico o l'angina pectoris instabile, deoxyribonuclease I (DNase I) i livelli del siero sono stati indicati come un valido marcatore diagnostico20,21.
È stato ipotizzato che il progetto globale dell'attività nuclease potrebbe essere diverso negli stati sani e malati. Infatti, recenti rapporti hanno utilizzato differenze nell'attività nuclease per distinguere tra fenotipi sani e cancerosi22 o per identificare le infezioni batteriche patogene in modo specifico per specie15,23. Questi risultati hanno aperto una nuova strada per l'uso di nucleasi come biomarcatori della malattia. Pertanto, esiste la necessità di sviluppo di un metodo di screening completo in grado di identificare sistematicamente le differenze associate alle malattie nell'attività nucleana, che possono essere di fondamentale importanza nello sviluppo di nuovi strumenti diagnostici.
In questo articolo, introduciamo e descriviamo un nuovo approccio di screening in vitro (Figura 1) per identificare sonde sensibili e specifiche in grado di discriminare l'attività nucleasea in sano e malsano, o un'attività specifica di un tipo di cellula o batteri. Approfittando della modularità degli acidi nucleici, abbiamo progettato una libreria iniziale di sonde oligonucleotidi fluorescenti quesinella costituita da un insieme completo di sequenze e chimiche diverse, entrambe parametri importanti per la progettazione della biblioteca. Queste sonde oligonucleotide sono affiancate da un fluoroforo (fluorescein amidite, FAM) e da un quencher (quencher di marea 2, TQ2) rispettivamente alle estremità 5' e 3'(tabella 1). Utilizzando questo saggio fluorometrico basato sul trasferimento di energia a risonanza fluorescente (FRET) per misurare la cinetica della degradazione enzima, siamo stati in grado di identificare le sonde candidate con il potenziale di discriminare i modelli differenziali di attività nucleana associati a stati sani o malati. Abbiamo progettato un processo iterativo, in cui vengono create nuove librerie sulla base delle migliori sonde candidate, che consente l'identificazione di sonde candidate sempre più specifiche nelle successive fasi di screening. Inoltre, questo approccio sfrutta la natura catalitica delle nucleasi per aumentare la sensibilità. Ciò si ottiene sfruttando la natura attivabile delle sonde reporter e la capacità delle nuclesie di elaborare continuamente le molecole di substrato, entrambi rappresentando vantaggi chiave rispetto agli anticorpi alternativi o ai metodi di screening a base di piccole molecole.
Questo approccio offre uno strumento di screening altamente modulare, flessibile e facile da implementare per l'identificazione di specifiche sonde di acido nucleico in grado di discriminare gli stati sani e le malattie, e un'eccellente piattaforma per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici che possono essere adattati per future applicazioni cliniche. Come tale, questo approccio è stato utilizzato per identificare l'attività di nuclease derivata da Salmonella Typhimurium (qui chiamata Salmonella) per l'identificazione specifica di questo batterio. Nel seguente protocollo, riportiamo un metodo per lo screening dell'attività nucleale batterica utilizzando l'analisi cinetica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Le nucleasi sono una classe di enzimi che scompongono gli acidi nucleici catalizzare l'idrolisi dei legami di fosforestro che legano gli zuccheri ribosio. Le nucleasi mostrano una varietà di ruoli fisiologici vitali negli organismi procariotici ed eucarioti, che vanno dal mantenimento della stabilità del genoma alla protezione contro gli agenti patogeni. L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni patologiche, tra cui infezioni batteriche e cancro. A tal fine, l'attività di nucleasi ha mostrato un grande potenziale per essere sfruttata come un biomarcatore specifico. Tuttavia, un metodo di screening robusto e riproducibile basato su questa attività rimane altamente auspicabile.
Qui, introduciamo un metodo che consente lo screening per l'attività nuclease utilizzando sonde di acido nucleico come substrati, con l'ambito di differenziare tra condizioni patologiche e sane. Questo metodo offre la possibilità di progettare nuove librerie di probe, con crescente specificità, in modo iterativo. Pertanto, sono necessari più cicli di screening per affinare il design delle sonde con caratteristiche migliorate, sfruttando la disponibilità di acidi nucleici modificati chimicamente. Il notevole potenziale della tecnologia proposta risiede nella sua flessibilità, alta riproducibilità e versatilità per lo screening dell'attività di nucleasi associata alle condizioni della malattia. Si prevede che questa tecnologia consentirà lo sviluppo di promettenti strumenti diagnostici con un grande potenziale nella clinica.

La figura 1 mostra il flusso di lavoro di questa metodologia, suddivisa in due cicli di screening. Nel primo ciclo di screening, abbiamo utilizzato 5 sonde di DNA (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C e DNA Poly G) e anche 5 sonde di RNA (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C e RNA Poly G). I dati grezzi di questo ciclo di screening sono riportati nella tabella supplementari 1. Nel secondo round, le sonde modificate chimicamente sono state sintetizzate sostituendo la seq...

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni umane, alla base del suo potenziale come biomarcatore. La metodologia di screening modulare e facile da implementare presentata in questo documento consente di selezionare specifiche sonde di acido nucleico per sfruttare l'attività nuclease come biomarcatore della malattia.

Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Questo protocollo fornisce una potente alternativa per lo screening dell'attività della nucleasi come biomarcatore della malattia, con una metodologia facile da implementare anche per i ricercatori che non sono così specializzati nelle sonde di acido nucleico. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di selezionare sonde di acido nucleico in grado di identificare attività nucleasi conosciute e sconosciute, sfruttando l'interazione dinamica sonda-nucleasi. Altri vantaggi di questa metodologia sono la sua flessibilità, elevata riproducibilità e facilità d'uso.La dimostrazione sarà eseguita da Khadija, studentessa di Master, e Baris, un postdoc del nostro laboratorio. Quando si progetta una libreria oligonucleotide, includere almeno un DNA e una sequenza casuale di RNA contenente una combinazione di adenina, guanina, citosina e tiamina o uracile. Per preparare le sonde oligonucleotidi, spingi giù le sonde oligonucleotidiche liofilizzate e diluire ogni sonda nel tampone Tris-EDTA a una concentrazione di 500 picomolare per microlitro per prevenire la degradazione della nucleasi.Per la coltura batterica su supporto solido, arrotolare una singola perla di vetro poroso dalla conservazione criogenica direttamente su un piatto di coltura contenente TSA integrato con sangue di pecora defibrinato per striare singole colonie batteriche. Quindi posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per la coltura batterica in mezzo liquido, trasferire una singola colonia da una coltura media solida a 50 millilitri di TSB per l'incubazione a 37 gradi Celsius per 24 ore a 200 rotazioni al minuto.Il giorno dopo, diluire la coltura a un rapporto uno a 500 in TSB fresco e incubare i batteri per altre 24 ore a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto in un incubatore di scuotimenti. Per impostare un saggio di attività della nucleasi, prima preripidi un fluorometro a 37 gradi Celsius e aggiungi con cura 96 microlitri di TSB sterile o supernatante da una coltura media liquida Salmonella o E.Coli a un tubo di microcentrifugo privo di nucleasi da 1,5 millilitri per sonda. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di lavoro a sonda a ciascun tubo e utilizzare una pipetta per mescolare accuratamente ogni contenuto del tubo fino a ottenere soluzioni omogenee, facendo attenzione ad evitare bolle.Successivamente, caricare con cura 95 microlitri di ogni soluzione vicino alla parete di singoli pozzi di un fondo nero, piastra di pozzo 96 non trattata, facendo attenzione ad evitare bolle. Una volta aggiunte tutte le soluzioni, coprire la piastra e ispezionare visivamente il coperchio alla ricerca di marcature a penna o polvere che possono introdurre artefatti di misurazione. Per impostare il software per la misurazione dell'attività nucleasi, aprire un programma software di acquisizione adatto.Selezionare Leggi ora dalla finestra Gestione attività e quindi Nuovo per creare il protocollo di misurazione cinetica. Fare clic su Imposta temperatura per selezionare 37 gradi Celsius e confermare e salvare le impostazioni facendo clic su OK. Fate clic su Inizia cinetica (Start Kinetics). Nella finestra popup selezionare due ore nella casella di input Tempo di esecuzione e due minuti nella casella di input intervallo prima di fare clic su OK per confermare e salvare le impostazioni.Fare clic su Leggi. Nella finestra popup, selezionate Intensità fluorescenza come metodo di rilevamento, Cinetica endpoint come tipo di lettura e filtri come tipo di ottica. Quindi fare clic su OK. Nella finestra popup selezionare Verde dal set di filtri e fare clic su OK. Nella finestra Procedura selezionare Usa coperchio e fare clic su Convalida.Verrà visualizzata una finestra popup che conferma che il protocollo creato è valido. Nel menu Protocollo selezionare Procedura. Nella finestra Procedura definire i pozzi da misurare e immettere il nome dell'esperimento nella casella di input Nome file.Quindi caricare la piastra nel lettore di lastre, facendo attenzione che la piastra sia nell'orientamento giusto e fare clic sul pulsante Leggi nuovo per iniziare l'acquisizione. Per l'analisi dei dati, aprire i dati nel software di analisi appropriato e selezionare uno dei pozzi misurati nella piastra di una finestra. Fate clic su Seleziona pozzi (Select Wells) e includete tutti i pozzi misurati nella finestra di dialogo Selezione pozzi (Well Selection Dialog) prima di fare clic su OK. Quindi selezionare Dati nella lastra una finestra per visualizzare i risultati tabulati e fare clic su QuickExport per esportare i dati in un foglio di calcolo.In un foglio di calcolo etichettare le colonne di dati in base alle esigenze per ogni campione e sonda e tracciare le unità di fluorescenza relative rispetto al tempo in cui i dati generano grafici cinetici. In questo esperimento rappresentativo, dopo il primo ciclo di screening, i supernanti della coltura di Salmonella hanno riportato una chiara preferenza per le sonde di RNA rispetto alle sonde del DNA. Sulla base dell'identificazione dell'RNA come tipo di acido nucleico preferito dalle nucleasi della Salmonella, una nuova libreria solo RNA è progettata per essere utilizzata nel secondo ciclo di screening.Al contrario, E.Coli nei controlli dei mezzi di coltura dimostrò una capacità molto limitata di degradare le sonde di RNA. Dopo un secondo ciclo di screening utilizzando nucleotidi modificati chimicamente volti ad aumentare la specificità delle sonde di RNA, l'RNA pirimidina 2'O-metile e l'RNA purine 2'O-metile potrebbero essere identificati sulla base delle loro modifiche chimiche come il comportamento cinetico più performante rispetto all'RNA pirimidina 2'fluoro e RNA purine 2'fluoro rispettivamente. Questi risultati suggeriscono che la Salmonella ha un'importante attività di RNAse con preferenza chimica differenziale del substrato che può essere utilizzata per selezionare sonde in grado di riconoscere specificamente questo batterio.Questa procedura consente la selezione di sonde in grado di identificare le attività nucleasi associate a condizioni di malattia, come il cancro o l'infezione batterica, consentendo lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici clinici.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Un sensore polianilina a base di acidi nucleici

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Ricerca

Biochimica

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Preparazione e<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilizzo di una sonda Activity-based per<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidasi

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Espressione e purificazione di Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Diossigenasi

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Stima del contenuto di Lignina da biomassa vegetale mediante acido tioglicolico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Effettuare misurazioni FRET a singola molecola precise e accurate utilizzando l'smfBox open source

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Identificazione dei G-quadruplex in un modello di DNA utilizzando la mappatura chimica

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Autore in primo piano: Caratterizzazione del DNA G-quadruplex mediante mappatura chimica basata su bis-3-cloropiperidina 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Mappatura chimica delle strutture del DNA G-quadruplex mediante bis-3-cloroperidine

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...