Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
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著者たちは、原稿の慎重な改訂と貴重なアドバイスについて、ルイザ・I・ヘルナンデス(リンシェーピング大学)を認めたい。この研究は、クヌート・アンド・アリス・ワレンバーグ財団とスウェーデン政府のリンシェーピング大学先端機能材料に関する材料科学戦略研究領域(教員助成金SFO-Mat-LiU No. 2009-00971)によって支援されました。

1. オリゴヌクレオチドライブラリーの設計と調製
<ol><li>図書館設計<ol>
<li>以下の基準に基づいて、全てのプローブに対して同じ長さで、二次構造形成を回避するために、8〜12-mer長さの間の急行蛍光オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーを設計する。<ol>
<li>アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびチミン(T)/ウラシル(U)(DNAおよびRNAプローブを表1に含む)の組み合わせを含む少?...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. 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ヌクレアーゼ活性の変化は、異なるタイプの癌および細菌感染を含む多種多様な疾患表現型に関連している。これらの改変は、条件14の原因物質であることが提案されるが、他の場合には有害な生理学的事象20または病原性薬剤16、26の結果である。当然のことながら、診断バイオマーカーとしてヌクレアーゼおよ...

ヌクレアーゼは、核酸分子の骨格構造を形成するホスホジエステル結合を切断することができる酵素のクラスです。ヌクレアーゼの膨大な多様性は、その分類をかなり困難にします。しかしながら、基質嗜好(デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA))、切断部位(エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ)、または金属イオン依存性、とりわけ1のようなヌクレアーゼを記述するために使用されるいくつかの一般的な基準がある。ヌクレアーゼは、原核生物と真核生物の両方で基本的な役割を果たす高度に保存された触媒酵素であり、遺伝子編集ツール2として使用され続けている。また、DNAの維持と複製の基本的なアクターであり、ゲノムの安定性を維持し、校正プロセス3に参加するのに役立ちます。細菌において、例えば、ヌクレアーゼは重要な毒性因子として同定されており、宿主の免疫系4、5、6、7の有効性を低下させることにより細菌生存率を促進することができる、8.哺乳動物において、ヌクレアーゼは、アポトーシス9、ミトコンドリア生体形成および維持10および抗菌および抗ウイルス性自然免疫応答11の調停に関与することが示唆されている。当然のことながら、ヌクレアーゼ活性変化は、増強または欠如のいずれであっても、広範囲のヒト疾患に関与している。これらの疾患は、多種多様な癌12、13から心臓肥大10または自己免疫疾患14まで及んでいる。したがって、ヌクレアーゼは、ヒト状態の異種群のバイオマーカーとして興味深い候補となっている。実際、ヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌や大腸菌15などの特定の細菌剤によって引き起こされる感染症の検出に成功した診断ツールとしての可能性を既に示しています。16.多くの癌タイプにおいて、ブドウ球菌ヌクレアーゼドメイン含有タンパク質1(SND1)リボヌクレアーゼの発現は予後不良を示す17.膵臓癌患者において、リボヌクレアーゼI(RNaseI)血清レベルの上昇が報告されており、癌細胞表現型19に関連することが提案されている。心筋梗塞や不安定狭心症などの虚血性心状態において、デオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI)血清レベルは、有効な診断マーカー20、21であることが示されている。
ヌクレアーゼ活性の世界的な青写真は、健康と疾患の状態で異なる可能性があると仮定されています。実際、最近の報告では、ヌクレアーゼ活性の違いを用いて、健康な表現型と癌性表現型22を区別したり、種特異的な方法で病原性細菌感染を同定したりしている。これらの知見は、ヌクレアーゼを疾患のバイオマーカーとして使用するための新しい道を開いた。従って、ヌクレアーゼ活性における疾患関連の相違を系統的に同定できる総合的なスクリーニング法の開発には必要性があり、これは新しい診断ツールの開発において重要な役割を有する可能性がある。
本明細書では、健康および不健康、または細胞または細菌の種類に特異的な活性を区別することができる感受性および特異的プローブを同定するための新しいin vitroスクリーニングアプローチ(図1)を導入し、説明する。核酸のモジュール性を利用して、異なる配列と化学の包括的なセットからなるクエンチされた蛍光オリゴヌクレオチドプローブの初期ライブラリを設計し、ライブラリ設計の重要なパラメータとして設計しました。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、フルオロフォア(フルオレセインアミド、FAM)とクエンチャー(タイドクエンチャー2、TQ2)によってそれぞれ5'と3'末端に隣接している(表1)。この蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの蛍光測定アッセイを用いて酵素分解の動態を測定することで、ヌクレアーゼ活性の微分パターンを区別する可能性のある候補プローブを同定することができた。健康または病気の状態に関連付けられています。.最適な候補プローブに基づいて新しいライブラリが作成される反復プロセスを設計し、その後のスクリーニングステップでより具体的な候補プローブを識別できるようにしました。さらに、このアプローチは、感受性を高めるためにヌクレアーゼの触媒性を利用する。これは、レポータープローブの活性化可能な性質と、代替抗体または低分子ベースのスクリーニング方法に対する重要な利点を表す、基質分子を継続的に処理するヌクレアーゼの能力を利用することによって達成される。
このアプローチは、健康と疾患の状態を区別することができる特定の核酸プローブを識別するための非常にモジュール的で柔軟で簡単なスクリーニングツールを提供し、新しい開発のための優れたプラットフォームを提供します将来の臨床適用のために適応することができる診断用具。このように、このアプローチは、この細菌の特異的同定のためにサルモネラ・チピムリウム(本明細書ではサルモネラ菌と呼ばれる)に由来するヌクレアーゼ活性を同定するために用いられた。以下のプロトコルでは、運動分析を用いて細菌ヌクレアーゼ活性をスクリーニングする方法について報告する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

ヌクレアーゼは、リボース糖を連結するホスホジエステル結合の加水分解を触媒することによって核酸を分解する酵素のクラスです。ヌクレアーゼは、ゲノム安定性の維持から病原体に対する保護の提供に至るまで、原核生物および真核生物において様々な重要な生理学的役割を果たします。変化したヌクレアーゼ活性は、細菌感染および癌を含むいくつかの病理学的状態に関連している。この結果、ヌクレアーゼ活性は、特定のバイオマーカーとして利用される大きな可能性を示している。しかしながら、この活性に基づく堅牢で再現性の高いスクリーニング方法は依然として極有である。
本明細書では、核酸プローブを基質として用いたヌクレアーゼ活性のスクリーニングを可能にする方法を紹介し、病理学的状態と健全な状態を区別する範囲を有する。この方法は、特異性を高め、反復的な方法で新しいプローブライブラリを設計する可能性を提供します。したがって、化学的に修飾された核酸の入手可能性を利用して、プローブの設計を強化された機能で改良するためには、複数のスクリーニングが必要です。提案された技術のかなりの可能性は、その柔軟性、高い再現性、および疾患状態に関連するヌクレアーゼ活性のスクリーニングのための汎用性にあります。この技術は、クリニックで大きな可能性を秘めた有望な診断ツールの開発を可能にすることが期待されます。

図 1は、この方法論の作業フローを 2 つのスクリーニングラウンドに分けて示しています。スクリーニングの第1ラウンドでは、5つのDNAプローブ(DNA、DNAポリA、DNAポリT、DNAポリCおよびDNAポリG)と5つのRNAプローブ(RNA、RNAポリA、RNAポリURNAポリCおよびRNAポリG)を使用しました。このスクリーニングラウンドの生データは補足表1に記載されている。第2ラウンドで?...

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

変化したヌクレアーゼ活性は、バイオマーカーとしての可能性の根底にある異なるヒト条件に関連している。本論文で提示されるモジュラーで実施しやすいスクリーニング方法論により、疾患のバイオマーカーとしてヌクレアーゼ活性を利用するための特異的核酸プローブを選択することができる。

核酸プローブを用いたヌクレアーゼ活性の運動スクリーニング

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

このプロトコルは、核酸プローブに特化していない研究者にとっても、ヌクレアーゼ活性を疾患のバイオマーカーとしてスクリーニングするための強力な代替手段を提供します。この技術の主な利点は、プローブヌクレアーゼの動的相互作用を利用して、既知および未知のヌクレアーゼの活動の両方を同定できる核酸プローブを選択できることである。この方法論の他の利点は、その柔軟性、高い再現性と使いやすさです。デモンストレーションは、修士課程のカディヤと、研究室のポスドクであるバリスが行います。オリゴヌクレオチドライブラリーを設計する場合、アデニン、グアニン、シトシンおよびチアミンまたはウラシルの組み合わせを含む少なくとも1つのDNAおよび1つのRNAランダム配列が含まれる。オリゴヌクレオチドプローブを調製するには、凍結乾燥したオリゴヌクレオチドプローブをスピンダウンし、トリスEDTAバッファー内の各プローブをマイクロリットル当たり500ピコモラーで希釈し、ヌクレアーゼの分解を防ぎます。固体培地上の細菌培養の場合、極低温貯蔵から単一の多孔質ガラスビーズを、脱脂羊の血液を補ったTSAを含む1つの培養皿に直接ロールし、個々の細菌コロニーをストリークアウトする。その後、プレートを摂氏37度に24時間置きます。液体培地中の細菌培養の場合、固体培地からTSBの50ミリリットルに単一コロニーを移し、毎分200回転で24時間摂氏37度でインキュベーションを行う。翌日、新鮮なTSBで1〜500比で培養を希釈し、37°Cで24時間、1分あたり200回転の細菌を振度インキュベーターでインキュベートします。ヌクレアーゼ活性アッセイを設定するには、最初にフルオメーターを摂氏37度に予熱し、サルモネラまたは大腸菌液体培地培養物から96マイクロリットルの無菌TSBまたは上清をプローブあたり1つの1.5ミリリットル核アーゼフリーマイクロ遠心分離チューブに慎重に加える。各チューブに4マイクロリットルのプローブ作業溶液を加え、ピペットを使用して、均質な溶液が達成されるまで各チューブの内容物を完全に混合し、気泡を避けるように注意してください。次に、各溶液の95マイクロリットルを黒底の個々の井戸の壁近くに慎重にロードし、非処理された96ウェルプレート、気泡を避けるように注意を払う。すべてのソリューションが追加されたら、プレートを覆い、測定アーティファクトを発生する可能性のあるペンマーキングやほこりがないか蓋を視覚的に検査します。ヌクレアーゼ活性測定用のソフトウェアをセットアップするには、適切な取得ソフトウェアプログラムを開きます。[タスクマネージャ]ウィンドウから[今すぐ読み取り]を選択し、[新規]を選択して、キネティック測定プロトコルを作成します。[温度の設定] をクリックして摂氏 37 度を選択し、[OK] をクリックして設定を確認して保存します。[キネティクスの開始] をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、[実行時間] 入力ボックスで 2 時間、間隔入力ボックスで 2 分を選択してから、[OK] をクリックして設定を確認して保存します。[読み取り] をクリックします。ポップアップウィンドウで、検出方法として蛍光強度を選択し、読み取りタイプとしてエンドポイントキネティックを、光学タイプとしてフィルタを選択します。次に、[OK] をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、[フィルター セット] から [緑] を選択し、[OK] をクリックします。[手順] ウィンドウで、[ふたを使用] を選択し、[検証] をクリックします。作成したプロトコルが有効であることを確認するポップアップ ウィンドウが表示されます。[プロトコル] メニューの [プロシージャ] を選択します。「手順」ウィンドウで、測定するウェルを定義し、「ファイル名」入力ボックスに実験の名前を入力します。次にプレートをプレートリーダーにロードし、プレートが正しい向きであることを確認し、[新しい読み取り]ボタンをクリックして取得を開始します。データ解析では、適切な解析ソフトウェアでデータを開き、プレート 1 つのウィンドウで測定されたウェルの 1 つを選択します。[ウェルを選択]をクリックし、[ウェル選択ダイアログ]ウィンドウに測定されたウェルをすべて含めた後で、[OK]をクリックします。次に、プレート 1 ウィンドウで [データ] を選択して集計結果を視覚化し、[クイック エクスポート] をクリックしてデータをスプレッドシートにエクスポートします。スプレッドシートでは、各サンプルとプローブに適したデータ列にラベルを付け、データがキネティックグラフを生成する時間と相対的な蛍光単位をプロットします。この代表的な実験では、スクリーニングの最初のラウンドの後、サルモネラ培養上清はDNAプローブよりもRNAプローブの明確な好みを報告した。サルモネラヌクレアーゼによる好ましい核酸型としてのRNAの同定に基づいて、新しいRNAのみのライブラリーがスクリーニングの第2ラウンドで使用されるように設計されている。対照的に、培養培地コントロールにおける大腸菌は、RNAプローブを分解する非常に限られた能力を示した。RNAプローブの特異性を高めることを目的とした化学修飾ヌクレオチドを用いた2回目のスクリーニングの後、RNAピリミジン2'O-メチルおよびRNAプリン2'O-メチルは、RNAピリミジン2'フルオロおよびRNAプリン2'フルオロと比較して最も優れた運動行動を示すとして、その化学的修飾に基づいて同定することができた。これらの結果は、サルモネラ菌が、この細菌を特異的に認識することができるプローブを選択するために使用できる、差動基質化学好みで重要なRNAAse活性を有することを示唆している。この手順により、がんや細菌感染などの疾患状態に関連するヌクレアーゼ活性を同定できるプローブの選択が可能となり、新しい臨床診断ツールの開発が可能になります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

核酸のポリアニリンベースのセンサ

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

調製と<em&gt;インビボ</em&gt;アクティビティベースのプローブの使用のために<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine酸アミダーゼ

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

希少コドンリッチマーカーを用いてアミノ酸過剰生産者を同定

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

ランダムマイクロシードマトリックススクリーニングによるI3Cによるタンパク質結晶の誘導体化

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

チオグリコール酸(TGA)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

オープンソースsmfBoxを使用して、正確で正確な単一分子フレット測定を行う

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...