Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
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저자는 루이자 I. 에르난데스 (링셰핑 대학)가 원고와 귀중한 조언을 신중하게 수정한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 Knut와 앨리스 Wallenberg 재단과 링셰핑 대학에서 고급 기능성 재료에 재료 과학에 스웨덴 정부 전략 연구 영역에 의해 지원되었다 (교수 그랜트 SFO-Mat-LiU 번호 2009-00971).

1. 올리고뉴클레오티드 라이브러리 설계 및 준비
<ol><li>도서관 디자인<ol>
<li>다음 기준에 기초하여 모든 프로브에 대해 동일한 길이의 이차 구조 형성을 피하기 위해 8~12-mer 길이의 담금질 형광 올리고뉴클레오티드 프로브 라이브러리를 설계합니다.<ol>
<li>아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민(T)/우라실(U)의 조합을 포함하는 적어도 하나의 DNA 및 하나의 RNA 랜덤 서열을포함한다(표 1의 DNA ?...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. 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뉴클레아제 활성의 변경은 다양한 유형의 암 및 세균 감염을 포함한 다양한 질병 표현형과 연관되어 왔다. 이러한 변화는 조건14의원인인 것으로 제안되며, 다른 경우에는 해로운 생리적사건(20) 또는 병원성제제(16,26)의결과이다. 당연히, 진단 바이오마커로서 뉴클레아제 및 뉴클레아제 활성을 사용하려는 시도는 상?...

뉴클레아제는 핵산 분자의 백본 구조를 형성하는 인산염 결합을 분리할 수 있는 효소의 부류입니다. 뉴클레아제의 광대 한 다양성은 그들의 분류를 오히려 어렵게 만듭니다. 그러나, 기질 선호도(deoxyribonucleic acid (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)), 절단 부위 (엔도누클레스 또는 외핵약), 또는 금속 이온 의존성, 다른 사람의 사이에서 뉴클레아제를 기술하는 데 사용되는 몇 가지 일반적인 기준이있다 1. 핵활성제는 원핵생물및 진핵생물 모두에서 근본적인 역할을 가지며, 유전자 편집도구로서계속 사용되고 있는 고도로 보존된 촉매 효소이다 2. 그(것)들은 또한 DNA 정비 및 복제에 있는 기본적인 배우입니다, 게놈 안정성을 지키는 것을 돕고 증명 독서 프로세스에참여3. 박테리아에서, 예를 들어, 뉴클레아제는 숙주의 면역 계통의 효능을 감소시킴으로써 세균 생존을 촉진할 수 있는 중요한 독성 인자로 확인되었다4,5,6,7 ,8. 포유동물에서, 뉴클레아제는 세포자멸9,미토콘드리아 생물발생 및유지보수(10) 및 항균 및 항바이러스 선천적 면역 반응의 중재에 연루되는 것으로 제안되었다11. 당연히, 뉴클레아제 활성 변경, 향상 또는 부족 여부, 인간의 질병의 넓은 배열에 연루 되었습니다. 이들 질환은 다양한 암12,13, 심장 비대10 또는 자가면역질환(14)에이르기까지 다양합니다. 따라서, 뉴클레아제는 인간 조건의 이기종 그룹에 대한 바이오마커로서 흥미로운 후보가 되었다. 사실, 뉴클레아제는 이미 황색포도상구균 또는 대장균15와같은 특정 세균성 에이전트에 기인한 감염의 검출을 위한 성공적인 진단 공구로 그들의 잠재력을 보여주었습니다15, 16.많은 암 유형에서, 포도상 구균 뉴클레아제 도메인-함유 단백질 1(SND1) 리보뉴클레아제의 발현은 예후불량을 나타낸다17. 췌장암 환자에서, 높은 리보누클러스 I(RNase I) 혈청 수준은18로 보고되고 암세포 표현형19와연관될 것으로 제안되었다. 허혈성 심장 조건에서, 예컨대 심근경색 또는 불안정한 협심증, 디옥시리보누클리스 I(DNase I) 혈청 수준은 유효한 진단마커(20,21)로나타났다.
뉴클레아제 활성의 글로벌 청사진이 건강하고 질병 상태에서 다를 수 있다는 가설이 있습니다. 실제로, 최근 보고는 뉴클레아제 활성의 차이를 사용하여 건강한표현형(22)을 구별하거나 종별 방식으로 병원성 세균 감염을 식별하기 위해15,23을사용하였다. 이 사실 인정은 질병의 biomarkers로 뉴클레아제의 사용을 위한 새로운 길을 열었습니다. 따라서, 뉴클레아제 활성의 질병 관련 차이를 체계적으로 식별할 수 있는 포괄적인 스크리닝 방법의 개발이 필요하게 되는데, 이는 새로운 진단 도구의 개발에 매우 중요할 수 있다.
본 명세서에서, 우리는 건강하고 건강에 해로운, 또는 세포 또는 박테리아의 종류에 특이적인 활성에서 뉴클레아제 활성 을 구별할 수 있는 민감하고 특이적인 프로브를 식별하기 위해 새로운 시험관내 스크리닝접근법(도 1)을소개하고 기술한다. 핵산의 모듈성을 활용하여, 우리는 서로 다른 서열과 화학의 포괄적인 세트로 구성된 담금질 형광 올리고뉴클레오티드 프로브의 초기 라이브러리를 설계, 둘 다 라이브러리 설계를위한 중요한 매개 변수인. 이들 올리고뉴클레오티드 프로브는 각각 5' 및 3' 말단에서 플루오로포르(플루오레세인 아미드, FAM) 및 퀘이커(tide quencher 2, TQ2)에 의해 측면에있다(표 1). 이 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기반형광 분석법을 사용하여 효소 분해의 역학을 측정함으로써, 우리는 뉴클레아제 활성의 차동 패턴을 구별 할 수있는 후보 프로브를 식별 할 수있었습니다. 건강 또는 질병 상태와 관련이 있습니다. 우리는 후속 선별 단계에서 더욱 구체적인 후보 프로브를 식별할 수 있는 최상의 후보 프로브를 기반으로 새로운 라이브러리를 만드는 반복 프로세스를 설계했습니다. 더욱이, 이 접근은 감도를 증가시키기 위하여 뉴클레아제의 촉매 특성을 이용합니다. 이는 리포터 프로브의 활성 특성과 뉴클레아제의 기질 분자를 지속적으로 처리하는 능력을 활용함으로써 달성되며, 대체 항체 또는 소분자 기반 스크리닝 방법에 비해 주요 이점을 나타냅니다.
이 접근법은 건강 상태와 질병 상태를 구별할 수 있는 특정 핵산 프로브의 식별을 위한 고도로 모듈화되고 유연하며 구현하기 쉬운 스크리닝 도구를 제공하며, 새로운 개발을 위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 향후 임상 응용 분야에 맞게 조정할 수 있는 진단 도구입니다. 이와 같이, 이러한 접근법은 살모넬라 티피무리움(이하 살모넬라균)으로부터유래된 뉴클레아제 활성을 이 박테리아의 특이적 식별을 위해 식별하는데 사용되었다. 다음 프로토콜에서, 우리는 운동 분석을 사용하여 세균성 뉴클레아제 활성을 스크리는 방법에 대해 보고한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

뉴클레아제는 리보오스 설탕을 연결하는 인산 분해 결합의 가수분해를 촉매하여 핵산을 분해하는 효소의 한 부입니다. 핵약은 원핵 생물과 진핵 생물에서 다양한 중요한 생리적 역할을 나타내며, 게놈 안정성 유지에서 병원균에 대한 보호 제공에 이르기까지 다양합니다. 변경된 뉴클레아제 활동은 세균성 감염 및 암을 포함하여 몇몇 병리학적인 조건과 연관되었습니다. 이를 위해, 뉴클레아제 활성은 특정 바이오마커로서 악용될 수 있는 큰 잠재력을 보여주었다. 그러나, 이 활성에 기초한 견고하고 재현 가능한 스크리닝 방법은 매우 바람직하다.
본 명세서에서, 우리는 병리학적 및 건강한 상태 사이의 분화의 범위와 함께, 기질로서 핵산 프로브를 사용하여 뉴클레아제 활성을 스크리닝가능하게 하는 방법을 소개한다. 이 방법을 사용하면 반복적인 방식으로 특이성이 증가하면서 새로운 프로브 라이브러리를 설계할 수 있습니다. 따라서 화학적으로 변형된 핵산의 가용성을 활용하여 향상된 기능으로 프로브의 설계를 구체화하기 위해 여러 라운드의 스크리닝이 필요합니다. 제안된 기술의 상당한 잠재력은 질병 상태와 관련된 핵활성의 스크리닝을 위한 유연성, 높은 재현성 및 다기능성에 있다. 이 기술은 클리닉에서 큰 잠재력을 가진 유망한 진단 도구의 개발을 허용 할 것으로 예상된다.

그림 1은 두 개의 스크리닝 라운드로 나누어진 이 방법론의 작업 흐름을 보여줍니다. 스크리닝의 첫 번째 라운드에서, 우리는 5 개의 DNA 프로브 (DNA, DNA 폴리 A, DNA 폴리 T, DNA 폴리 C 및 DNA 폴리 G)와 5 RNA 프로브 (RNA, RNA 폴리 A, RNA 폴리 U RNA 폴리 C 및 RNA 폴리 G)를 사용했습니다. 이 스크리닝 라운드의 원시 데이터는 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다. 두 번째 라운드에?...

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

변경된 뉴클레아제 활성은 바이오마커로서의 잠재력을 기점으로 다른 인간 조건과 연관되어 있다. 이 논문에 제시된 모듈식 및 구현 방법론은 뉴클레아제 활성을 질병의 바이오마커로 활용하기 위한 특정 핵산 프로브를 선택할 수 있게 한다.

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

이 프로토콜은 핵산 프로브에 전문화되지 않은 연구자에게도 구현하기 쉬운 방법론으로 질병의 바이오 마커로서 핵 활성을 선별하기위한 강력한 대안을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 프로브-뉴클레아제 동적 상호 작용을 활용하여 알려진 핵및 알려지지 않은 핵활동을 모두 식별할 수 있는 핵산 프로브를 선택하는 능력입니다. 이 방법론의 다른 장점은 유연성, 높은 재현성 및 사용 용이성입니다.이 시위는 석사 과정 학생인 카디야와 우리 실험실의 포스트독인 바리스가 진행합니다. 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 설계할 때, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티아민 또는 우라실의 조합을 포함하는 적어도 하나의 DNA와 하나의 RNA 무작위 서열을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 준비하려면, 리오필화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 스핀다운하고 뉴클레아제 분해를 방지하기 위해 마이크로리터 농도당 500 피코몰라에서 트리스-EDTA 버퍼에서 각 프로브를 희석시한다.고체 배지의 세균 배양을 위해 극저온 저장에서 단 하나의 다공성 유리 구드를 탈제된 양혈으로 보충된 TSA가 함유된 하나의 배양 접시에 직접 굴려 개별 세균성 식민지를 줄입니다. 그런 다음 접시를 섭씨 37도에서 24시간 동안 놓습니다. 액체 배지의 세균 배양을 위해, 분당 200 회전에서 24 시간 동안 37섭씨37도에서 배양하기 위해 단단한 중간 배양에서 50 밀리리터로 단일 식민지를 전송합니다.다음 날, 신선한 TSB에서 1 ~500 비율로 문화를 희석하고 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도및 분당 200 회전에서 24 시간 동안 박테리아를 배양합니다. 뉴클레아제 활성 분석기를 설정하려면 먼저 형광계를 섭씨 37도로 미리 데우고 살모넬라 또는 E.Coli 액체 배지 배양에서 멸균 TSB 또는 슈퍼나탄트 96 마이크로리터를 프로브 당 1.5 밀리리터 프리 미세센티오프 튜브에 조심스럽게 추가합니다. 각 튜브에 4개의 마이크로리터의 프로브 작동 솔루션을 추가하고 파이펫을 사용하여 균일한 솔루션이 달성될 때까지 각 튜브 내용을 철저히 혼합하여 거품을 방지합니다.다음으로, 각 용액의 95 마이크로리터를 검은 바닥의 개별 우물 벽에 가깝게 조심스럽게 적재하고, 처리되지 않은 96웰 플레이트는 거품을 피하기 위해 주의를 기울입니다. 모든 솔루션이 추가되면 플레이트를 덮고 뚜껑을 시각적으로 검사하여 측정 아티팩트를 도입할 수 있는 펜 표시 또는 먼지를 검사합니다. 핵활성 측정을 위한 소프트웨어를 설정하려면 적합한 획득 소프트웨어 프로그램을 엽니다.작업 관리자 창에서 지금 읽기를 선택하고 새 를 선택하여 운동 측정 프로토콜을 만듭니다. 온도 설정을 클릭하여 섭씨 37도를 선택하고 확인을 클릭하여 설정을 확인하고 저장합니다. 운동 시작을 클릭합니다. 팝업 창에서 런타임 입력 상자에서 2시간, 간격 입력 상자에서 2분을 선택한 후 확인을 클릭하여 설정을 확인하고 저장합니다.읽기를 클릭합니다. 팝업 창에서 형광 강도를 감지 방법으로 선택, 끝점 역학읽기 유형및 광학 유형으로 필터. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 팝업 창에서 필터 집합에서 녹색을 선택하고 확인을 클릭합니다. 프로시저 창에서 뚜껑 사용(사용)을 선택하고 유효성 검사를 클릭합니다.생성된 프로토콜이 유효한지 확인하는 팝업 창이 나타납니다. 프로토콜 메뉴에서 프로시저를 선택합니다. 프로시저 창에서 측정할 우물을 정의하고 파일 이름 입력 상자에 실험 이름을 입력합니다.그런 다음 플레이트를 플레이트 판독기로 로드하여 플레이트가 올바른 방향에 있는지 주의를 기울이고 새 읽기 버튼을 클릭하여 인수를 시작합니다. 데이터 분석을 위해 적절한 분석 소프트웨어에서 데이터를 열고 플레이트 한 창에서 측정된 우물 중 하나를 선택합니다. 웰 선택(Wells)을 클릭하고 확인을 클릭하기 전에 웰 선택 대화 창에 측정된 모든 우물을 포함합니다. 그런 다음 플레이트 한 창에서 데이터를 선택하여 표고된 결과를 시각화하고 QuickExport를 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.스프레드시트에서 데이터 열을 각 샘플 및 프로브에 적합한 것으로 표시하고 상대형 형광 단위와 데이터가 운동 그래프를 생성하는 시간을 플롯합니다. 이 대표적인 실험에서, 첫 번째 검진 후, 살모넬라 배양 슈퍼나티츠는 DNA 프로브를 통해 RNA 프로브에 대한 명확한 선호도를 보고했다. 살모넬라 뉴클레아제에 의한 바람직한 핵산 유형으로서 RNA의 식별에 기초하여, 새로운 RNA 전용 라이브러리는 2차 스크리닝에서 사용될 수 있도록 설계된다.대조적으로, 배양 배지 제어에서 E.Coli는 RNA 프로브를 저하시키는 매우 제한된 능력을 입증했습니다. RNA 프로브의 특이성을 높이기 위한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 이용한 두 번째 스크리닝 후, RNA pyrimidine 2'O-메틸 및 RNA 퓨린 2'O-메틸은 RNA pyrimidine 2'fluoor 및 RNA 플루어와 비교하여 가장 성과가 좋은 운동 적 행동을 나타내는 화학적 변형을 기반으로 식별될 수 있다. 이러한 결과는 살모넬라가 이 박테리아를 특별히 인식할 수 있는 프로브를 선택하는 데 사용될 수 있는 차분기질 화학 선호도를 가진 중요한 RNAe 활동을 가지고 있음을 시사한다.이 절차는 새로운 임상 진단 공구의 발달을 허용하는 암 또는 세균성 감염과 같은 질병 조건과 관련되었던 핵활성을 확인할 수 있는 프로브의 선택을 가능하게 합니다.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

핵산 폴리아닐린 계 센서

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

연구

생화학

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

준비 및<em&gt; 생체</em&gt; 액티비티 기반 프로브의 사용을위한<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine 산 아미 다제

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

뉴클레아제 없는 산소 제거제 프로토카테의 발현 및 정제 3,4-디옥시게나아제

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

티오글리콜산(TGA)을 이용한 식물바이오매스 리그닌 함량 추정

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Chemical Mapping을 사용하여 DNA 템플릿에서 G-Quadruplexes 식별

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

저자 스포트라이트: Bis-3-Chloropiperidine 기반 화학 매핑에 의한 DNA G-Quadruplex 특성화 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In Vitro (시험관) Bis-3-Chloropiperidines에 의한 G-Quadruplex DNA 구조의 화학적 매핑

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...