Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Luiza I. Hernandez (Linköping universitet) for henne nøye revisjon av manuskriptet og verdifulle råd. Dette arbeidet ble støttet av The Knut og Alice Wallenberg Foundation og det svenske Statens strategiske forskningsområde i materialvitenskap på Avansert Funksjonsmateriale ved Linköping universitet (fakultet Grant SFO-mat-LiU no. 2009-00971).

1. oligonukleotid bibliotek design og forberedelse
<ol><li>Bibliotek design<ol>
<li>Basert på følgende kriterier utformer et bibliotek av slukket fluorescerende oligonukleotid sonder mellom 8 og 12-mer lang for å unngå sekundær struktur dannelse, med lik lengde for alle sonder.<ol>
<li>Ta med minst én DNA og én RNA tilfeldig sekvens som inneholder en kombinasjon av adenine (A), Guanin (G), cytosin (C) og thymine (T)/uracil (U) (DNA og RNA-sonder i tabell 1). Merk: DNA-og RNA-sekvensene beskre...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Endringer av nuklease aktivitet har vært forbundet med en rekke sykdoms fenotyper, inkludert ulike typer kreft og bakterielle infeksjoner. Disse endringene er foreslått å være den utløsende Agent for en tilstand14, mens i andre tilfeller er de konsekvensen av en ugunstig fysiologisk hendelse20 eller sykdomsfremkallende agent16,26. Ikke overraskende, forsøk på å bruke nukleaser og nuklease aktivitet som en di...

Nukleaser er en klasse av enzymer som er i stand til å spalte de phosphodiester obligasjoner som danner ryggraden struktur av nukleinsyre syre molekyler. Det store mangfoldet av nukleaser gjør deres klassifisering ganske vanskelig. Det er imidlertid noen vanlige kriterier som brukes for å beskrive nukleaser, slik som substrat preferanse (deoksyribonukleinsyre syre (DNA) eller ribonukleinsyre acid (RNA)), kløft sted (endonucleases eller exonucleases), eller metall ion avhengighet, blant andre1. Nukleaser er svært bevarte katalysatorer som har grunnleggende roller i både, prokaryote og eukaryote organismer og har blitt brukt, og fortsetter å bli brukt, som Gen redigeringsverktøy2. De er også grunnleggende aktører i DNA vedlikehold og replikering, bidrar til å holde Genova stabilitet og delta i bevis-lesing prosesser3. I bakterier, for eksempel, nukleaser har blitt identifisert som viktige virulens faktorer, i stand til å fremme bakteriell overlevelse ved å redusere effekten av vertens immunsystem4,5,6,7 ,8. I pattedyr, har nukleaser blitt foreslått å være innblandet i apoptose9, mitokondrie kognitiv og vedlikehold10 og formidling av antibakterielle og antivirale medfødte immunresponser11. Ikke overraskende, nuklease aktivitet endringer, om forbedring eller mangel på, har vært innblandet i et bredt spekter av menneskelige sykdommer. Disse sykdommene spenner fra et bredt utvalg av kreft12,13 til hjerte-hypertrofi10 eller autoimmune sykdommer14. Derfor har nukleaser blitt interessante kandidater som biomarkører for en heterogen gruppe menneskelige forhold. Faktisk har nukleaser allerede vist sitt potensial som vellykkede diagnostiske verktøy for påvisning av infeksjoner forårsaket av bestemte bakterielle midler, slik som Staphylococcus aureus eller Escherichia coli15, 16. i mange krefttyper, uttrykk for stafylokokk nuklease domene-inneholdende protein 1 (SND1) ribonuklease er et tegn på dårlig prognose17. I bukspyttkjertelkreft pasienter, forhøyede ribonuklease I (RNase I) serum nivåer har blitt rapportert18 og foreslått å være assosiert med kreftcelle fenotyper19. I iskemisk hjerte forhold, som hjerteinfarkt eller ustabil angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serum nivåer har vist å være en gyldig diagnostisk markør20,21.
Det har vært hypotetisk gjennomsnitt at den globale blåkopi av nuklease aktivitet kan være forskjellig i sunne og sykdomstilstander. Faktisk har nylige rapporter brukt forskjeller i nuklease aktivitet for å skille mellom sunn og kreft fenotyper22 eller for å identifisere patogene bakterielle infeksjoner i en art-spesifikk måte15,23. Disse funnene har åpnet en ny vei for bruk av nukleaser som biomarkører av sykdom. Derfor finnes det en nødvendighet for utvikling av en omfattende screening metode i stand til å systematisk identifisere sykdom knyttet forskjeller i nuklease aktivitet, som kan være av avgjørende betydning i utviklingen av nye diagnostiske verktøy.
Heri, introduserer vi og beskriver en ny in vitro screening tilnærming (figur 1) for å identifisere sensitive og spesifikke sonder som kan diskriminerende mellom nuklease aktivitet i sunn og usunn, eller aktivitet som er spesifikke for en type celle eller bakterier. Dra nytte av den modulære av nukleinsyre syrer, designet vi en første bibliotek av slukket fluorescerende oligonukleotid sonder som består av et omfattende sett av ulike sekvenser og kjemikalier, både er viktige parametre for biblioteket design. Disse oligonukleotid sonder er flankert av en fluoroforen (fluorescein amidite, FAM) og en tørste (tidevann tørste 2, TQ2) ved henholdsvis 5 ' og 3 ' ender (tabell 1). Ved å bruke denne fluorescerende resonans energi overføring (bånd) basert fluorometric analysen for å måle Kinetics av enzymatisk degradering, var vi i stand til å identifisere kandidat sonder med potensial til å diskriminere differensial mønstre av nuklease aktivitet assosiert med sunne eller sykdomstilstander. Vi utformet en gjentakende prosess, der nye biblioteker opprettes basert på de beste kandidat sonder, som gjør det mulig å identifisere stadig mer spesifikke kandidat sonder i påfølgende screening-trinn. Videre tar denne tilnærmingen nytte av katalysatoren natur nukleaser å øke følsomheten. Dette oppnås ved å dra nytte av activatable natur reporter sonder og evnen til nukleaser å kontinuerlig behandle substrat molekyler, begge representerer viktige fordeler fremfor alternative antistoff eller små molekyl-baserte screening metoder.
Denne tilnærmingen tilbyr en svært modulær, fleksibel og enkel å implementere screening verktøy for identifisering av spesifikke nukleinsyre syre sonder i stand til å diskriminerende mellom sunne og sykdomstilstander, og en utmerket plattform for utvikling av nye diagnostiske verktøy som kan tilpasses for fremtidige kliniske anvendelser. Som sådan, denne tilnærmingen ble brukt til å identifisere nuklease aktivitet avledet fra Salmonella tyfimurium (heretter referert til som Salmonella) for den spesifikke identifisering av denne bakterien. Inne det fulgte protokollen, vi rapportere opp på en metoden å skjermen for bakteriell nuklease aktivitet benytter kinetisk analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nukleaser er en klasse av enzymer som bryter ned nukleinsyre syrer ved katalyserende hydrolyse av phosphodiester obligasjoner som knytter ribose sukker. Nukleaser viser en rekke vitale fysiologiske roller i prokaryote og eukaryote organismer, alt fra å opprettholde Genova stabilitet til å gi beskyttelse mot patogener. Endrede nuklease aktivitet har vært forbundet med flere patologiske tilstander, inkludert bakterielle infeksjoner og kreft. For dette formål har nuklease aktivitet vist stort potensiale til å utnyttes som en spesifikk biomarkør. Imidlertid er en robust og reproduserbar screening metode basert på denne aktiviteten svært ønskelig.
Heri introduserer vi en metode som muliggjør screening for nuklease aktivitet ved hjelp av nukleinsyre syre sonder som underlag, med omfanget av differensiering mellom patologiske og sunne forhold. Denne metoden gir mulighet for å designe nye sonde biblioteker, med økende spesifisitet, i en gjentakende måte. Dermed flere runder med screening er nødvendig for å avgrense sonder ' design med forbedrede funksjoner, utnytter tilgjengeligheten av kjemisk modifiserte nukleinsyre syrer. Det betydelige potensialet i den foreslåtte teknologien ligger i sin fleksibilitet, høy reproduserbarhet og allsidighet for screening av nuklease aktivitet forbundet med sykdomstilstander. Det er forventet at denne teknologien vil tillate utvikling av lovende diagnostiske verktøy med et stort potensial i klinikken.

Figur 1 viser arbeidsflyten av denne metodikken, som er delt inn i to screening runder. I den første runden av screening, brukte vi 5 DNA-sonder (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C og DNA Poly G) og også 5 RNA-sonder (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C og RNA Poly G). Rådata i denne screening runde kan bli funnet i supplerende tabell 1. I den andre runden, kjemisk modifiserte sonder ble syntetisert ved å erstatte RNA sekvensen med kjemisk modifisert nucleosides ...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Endret nuklease aktivitet har vært forbundet med ulike menneskelige forhold, underliggende dens potensial som en biomarkør. Den modulære og lett å implementere screening metodikk som presenteres i dette papiret gjør det mulig å velge bestemte nukleinsyre syre sonder for å utnytte nuklease aktivitet som en biomarkør av sykdom.

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Denne protokollen gir et kraftig alternativ for screening nuklease aktivitet som biomarkør av sykdom, med en lett-å-implementere metodikk selv for forskere som ikke er så spesialisert på nukleinsyre sonder. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å velge nukleinsyrepromer som kan identifisere både kjente og ukjente nukleaseaktiviteter, og dra nytte av sonden-nuklease dynamisk interaksjon. Andre fordeler med denne metodikken er dens fleksibilitet, høy reproduserbarhet og brukervennlighet.Demonstrasjonen vil bli utført av Khadija, en Masters student, og Baris, en postdoc fra vårt laboratorium. Ved utdesign av et oligonukleotidbibliotek, inkluderer minst ett DNA og en RNA tilfeldig sekvens som inneholder en kombinasjon av adenin, guanin, cytosin og tiamin eller uracil. For å forberede oligonukleotidsondene, spinn ned de lyofiliserte oligonukleotidsondene og fortynne hver sonde i Tris-EDTA-bufferen ved en 500 picomolar per mikroliterkonsentrasjon for å forhindre kjerneforringelse.For bakteriell kultur på solid medium, rull en enkelt porøs glassperle fra kryogen lagring direkte på en kulturrett som inneholder TSA supplert med beruset saublod for å streke ut individuelle bakterielle kolonier. Plasser deretter platen ved 37 grader Celsius i 24 timer. For bakteriell kultur i flytende medium, overfør en enkelt koloni fra en solid medium kultur til 50 milliliter TSB for inkubasjon ved 37 grader Celsius i 24 timer ved 200 rotasjoner per minutt.Neste dag, fortynne kulturen på en en til 500 ratio i frisk TSB og inkubere bakteriene i ytterligere 24 timer ved 37 grader Celsius og 200 rotasjoner per minutt i en risting inkubator. For å sette opp en kjerneaktivitetsanalyse, først forvarm et fluorometer til 37 grader Celsius og legg forsiktig til 96 mikroliter sterilt TSB eller supernatant fra en Salmonella eller E.Coli flytende medium kultur til en 1,5 milliliter kjernefri mikrocentrifugerør per sonde. Tilsett fire mikroliter sondearbeidsløsning til hvert rør og bruk en pipette til å blande innholdet i hvert rør grundig til homogene løsninger oppnås, og vær forsiktig for å unngå bobler.Deretter legger du forsiktig 95 mikroliter av hver løsning nær veggen av individuelle brønner av en svart bunn, ikke-behandlet 96 brønnplate, og tar vare på å unngå bobler. Når alle løsningene er lagt til, dekk platen og inspiser lokket visuelt for pennemarkeringer eller støv som kan introdusere måleartefakter. Hvis du vil konfigurere programvaren for måling av kjerneaktivitet, åpner du et passende oppkjøpsprogram.Velg Les nå i Oppgavebehandling-vinduet, og velg Ny for å opprette den kinetiske måleprotokollen. Klikk Angi temperatur for å velge 37 grader Celsius og bekreft og lagre innstillingene ved å klikke OK. Klikk Start kinetikk. I popup-vinduet velger du to timer i inndataboksen Kjøretid og to minutter i inndataboksen for intervall før du klikker OK for å bekrefte og lagre innstillingene.Klikk på Les. I popup-vinduet velger du Fluorescence-intensitet som deteksjonsmetode, endepunkt kinetisk som lesetype og filtre som optikktype. Klikk deretter OK. Velg Grønn fra filtersettet i popup-vinduet, og klikk på OK. Velg Bruk lokk i Prosedyre-vinduet, og klikk på Valider.Et popup-vindu vises som bekrefter at den opprettede protokollen er gyldig. Velg Prosedyre under Protokoll-menyen. I Prosedyre-vinduet definerer du brønnene som skal måles, og skriver inn navnet på eksperimentet i inndataboksen Filnavn.Legg deretter platen inn i plateleseren, og ta vare på at platen er i riktig retning og klikker på Les ny-knappen for å starte oppkjøpet. For dataanalyse åpner du dataene i riktig analyseprogramvare, og velger en av de målte brønnene i plate ett vindu. Klikk velg brønner og ta med alle de målte brønnene i vinduet Brønnvalg før du klikker OK. Velg deretter Data i ett platevindu for å visualisere de tabulerte resultatene, og klikk på QuickExport for å eksportere dataene til et regneark.Merk datakolonnene slik det passer for hvert eksempel og hver sonde, i et regneark, og plott de relative fluorescensenhetene kontra tid for dataene for å generere kinetiske grafer. I dette representative eksperimentet, etter den første runden med screening, rapporterte Salmonella-kulturens supernatanter en klar preferanse for RNA-sonder over DNA-sondene. Basert på identifisering av RNA som foretrukket nukleinsyretype av Salmonella-nukleaser, er et nytt RNA-bibliotek designet for bruk i andre runde av screening.I motsetning viste E.Coli i kulturmediumkontroller en svært begrenset evne til å forringe RNA-sonder. Etter en andre runde med screening ved hjelp av kjemisk modifiserte nukleotider med sikte på å øke spesifisiteten til RNA-sondene, kunne RNA pyrimidin 2'O-metyl identifiseres på grunnlag av deres kjemiske modifikasjoner som viser den beste kinetiske oppførselen sammenlignet med henholdsvis RNA pyrimidin 2'fluor og RNA purine 2'fluoro. Disse resultatene tyder på at Salmonella har en viktig RNAse aktivitet med differensial substrat kjemi preferanse som kan brukes til å velge sonder som er i stand til å spesifikt gjenkjenne denne bakterien.Denne prosedyren gjør det mulig å velge sonder som er i stand til å identifisere kjerneaktiviteter forbundet med sykdomstilstander, som kreft eller bakteriell infeksjon, slik at utviklingen av nye kliniske diagnostiske verktøy.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

En Polyanilin-baserte sensor av nukleinsyrer

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

forberedelse og<em&gt; I Vivo</em&gt; Bruk av en aktivitetsbasert Probe for<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Foreta presise og nøyaktige FRET-målinger med ett molekyl ved hjelp av åpen kildekode-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Bestemme den termodynamiske og kinetiske assosiasjonen til en DNA-aptamer og tetracyklin ved bruk av isotermisk titreringskalorimetri

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Identifisere G-quadruplexes i en DNA-mal ved hjelp av kjemisk kartlegging

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Forfatter Spotlight: Karakterisering av DNA G-Quadruplex ved Bis-3-kloropiperidinbasert kjemisk kartlegging 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Kjemisk kartlegging av G-quadruplex DNA-strukturer av Bis-3-kloropiperidiner

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...