Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Luiza I. Hernandez (Linköping universitet) for henne nøye revisjon av manuskriptet og verdifulle råd. Dette arbeidet ble støttet av The Knut og Alice Wallenberg Foundation og det svenske Statens strategiske forskningsområde i materialvitenskap på Avansert Funksjonsmateriale ved Linköping universitet (fakultet Grant SFO-mat-LiU no. 2009-00971).

1. oligonukleotid bibliotek design og forberedelse
<ol><li>Bibliotek design<ol>
<li>Basert på følgende kriterier utformer et bibliotek av slukket fluorescerende oligonukleotid sonder mellom 8 og 12-mer lang for å unngå sekundær struktur dannelse, med lik lengde for alle sonder.<ol>
<li>Ta med minst én DNA og én RNA tilfeldig sekvens som inneholder en kombinasjon av adenine (A), Guanin (G), cytosin (C) og thymine (T)/uracil (U) (DNA og RNA-sonder i tabell 1). Merk: DNA-og RNA-sekvensene beskre...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Endringer av nuklease aktivitet har vært forbundet med en rekke sykdoms fenotyper, inkludert ulike typer kreft og bakterielle infeksjoner. Disse endringene er foreslått å være den utløsende Agent for en tilstand14, mens i andre tilfeller er de konsekvensen av en ugunstig fysiologisk hendelse20 eller sykdomsfremkallende agent16,26. Ikke overraskende, forsøk på å bruke nukleaser og nuklease aktivitet som en di...

Nukleaser er en klasse av enzymer som er i stand til å spalte de phosphodiester obligasjoner som danner ryggraden struktur av nukleinsyre syre molekyler. Det store mangfoldet av nukleaser gjør deres klassifisering ganske vanskelig. Det er imidlertid noen vanlige kriterier som brukes for å beskrive nukleaser, slik som substrat preferanse (deoksyribonukleinsyre syre (DNA) eller ribonukleinsyre acid (RNA)), kløft sted (endonucleases eller exonucleases), eller metall ion avhengighet, blant andre1. Nukleaser er svært bevarte katalysatorer som har grunnleggende roller i både, prokaryote og eukaryote organismer og har blitt brukt, og fortsetter å bli brukt, som Gen redigeringsverktøy2. De er også grunnleggende aktører i DNA vedlikehold og replikering, bidrar til å holde Genova stabilitet og delta i bevis-lesing prosesser3. I bakterier, for eksempel, nukleaser har blitt identifisert som viktige virulens faktorer, i stand til å fremme bakteriell overlevelse ved å redusere effekten av vertens immunsystem4,5,6,7 ,8. I pattedyr, har nukleaser blitt foreslått å være innblandet i apoptose9, mitokondrie kognitiv og vedlikehold10 og formidling av antibakterielle og antivirale medfødte immunresponser11. Ikke overraskende, nuklease aktivitet endringer, om forbedring eller mangel på, har vært innblandet i et bredt spekter av menneskelige sykdommer. Disse sykdommene spenner fra et bredt utvalg av kreft12,13 til hjerte-hypertrofi10 eller autoimmune sykdommer14. Derfor har nukleaser blitt interessante kandidater som biomarkører for en heterogen gruppe menneskelige forhold. Faktisk har nukleaser allerede vist sitt potensial som vellykkede diagnostiske verktøy for påvisning av infeksjoner forårsaket av bestemte bakterielle midler, slik som Staphylococcus aureus eller Escherichia coli15, 16. i mange krefttyper, uttrykk for stafylokokk nuklease domene-inneholdende protein 1 (SND1) ribonuklease er et tegn på dårlig prognose17. I bukspyttkjertelkreft pasienter, forhøyede ribonuklease I (RNase I) serum nivåer har blitt rapportert18 og foreslått å være assosiert med kreftcelle fenotyper19. I iskemisk hjerte forhold, som hjerteinfarkt eller ustabil angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serum nivåer har vist å være en gyldig diagnostisk markør20,21.
Det har vært hypotetisk gjennomsnitt at den globale blåkopi av nuklease aktivitet kan være forskjellig i sunne og sykdomstilstander. Faktisk har nylige rapporter brukt forskjeller i nuklease aktivitet for å skille mellom sunn og kreft fenotyper22 eller for å identifisere patogene bakterielle infeksjoner i en art-spesifikk måte15,23. Disse funnene har åpnet en ny vei for bruk av nukleaser som biomarkører av sykdom. Derfor finnes det en nødvendighet for utvikling av en omfattende screening metode i stand til å systematisk identifisere sykdom knyttet forskjeller i nuklease aktivitet, som kan være av avgjørende betydning i utviklingen av nye diagnostiske verktøy.
Heri, introduserer vi og beskriver en ny in vitro screening tilnærming (figur 1) for å identifisere sensitive og spesifikke sonder som kan diskriminerende mellom nuklease aktivitet i sunn og usunn, eller aktivitet som er spesifikke for en type celle eller bakterier. Dra nytte av den modulære av nukleinsyre syrer, designet vi en første bibliotek av slukket fluorescerende oligonukleotid sonder som består av et omfattende sett av ulike sekvenser og kjemikalier, både er viktige parametre for biblioteket design. Disse oligonukleotid sonder er flankert av en fluoroforen (fluorescein amidite, FAM) og en tørste (tidevann tørste 2, TQ2) ved henholdsvis 5 ' og 3 ' ender (tabell 1). Ved å bruke denne fluorescerende resonans energi overføring (bånd) basert fluorometric analysen for å måle Kinetics av enzymatisk degradering, var vi i stand til å identifisere kandidat sonder med potensial til å diskriminere differensial mønstre av nuklease aktivitet assosiert med sunne eller sykdomstilstander. Vi utformet en gjentakende prosess, der nye biblioteker opprettes basert på de beste kandidat sonder, som gjør det mulig å identifisere stadig mer spesifikke kandidat sonder i påfølgende screening-trinn. Videre tar denne tilnærmingen nytte av katalysatoren natur nukleaser å øke følsomheten. Dette oppnås ved å dra nytte av activatable natur reporter sonder og evnen til nukleaser å kontinuerlig behandle substrat molekyler, begge representerer viktige fordeler fremfor alternative antistoff eller små molekyl-baserte screening metoder.
Denne tilnærmingen tilbyr en svært modulær, fleksibel og enkel å implementere screening verktøy for identifisering av spesifikke nukleinsyre syre sonder i stand til å diskriminerende mellom sunne og sykdomstilstander, og en utmerket plattform for utvikling av nye diagnostiske verktøy som kan tilpasses for fremtidige kliniske anvendelser. Som sådan, denne tilnærmingen ble brukt til å identifisere nuklease aktivitet avledet fra Salmonella tyfimurium (heretter referert til som Salmonella) for den spesifikke identifisering av denne bakterien. Inne det fulgte protokollen, vi rapportere opp på en metoden å skjermen for bakteriell nuklease aktivitet benytter kinetisk analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nukleaser er en klasse av enzymer som bryter ned nukleinsyre syrer ved katalyserende hydrolyse av phosphodiester obligasjoner som knytter ribose sukker. Nukleaser viser en rekke vitale fysiologiske roller i prokaryote og eukaryote organismer, alt fra å opprettholde Genova stabilitet til å gi beskyttelse mot patogener. Endrede nuklease aktivitet har vært forbundet med flere patologiske tilstander, inkludert bakterielle infeksjoner og kreft. For dette formål har nuklease aktivitet vist stort potensiale til å utnyttes som en spesifikk biomarkør. Imidlertid er en robust og reproduserbar screening metode basert på denne aktiviteten svært ønskelig.
Heri introduserer vi en metode som muliggjør screening for nuklease aktivitet ved hjelp av nukleinsyre syre sonder som underlag, med omfanget av differensiering mellom patologiske og sunne forhold. Denne metoden gir mulighet for å designe nye sonde biblioteker, med økende spesifisitet, i en gjentakende måte. Dermed flere runder med screening er nødvendig for å avgrense sonder ' design med forbedrede funksjoner, utnytter tilgjengeligheten av kjemisk modifiserte nukleinsyre syrer. Det betydelige potensialet i den foreslåtte teknologien ligger i sin fleksibilitet, høy reproduserbarhet og allsidighet for screening av nuklease aktivitet forbundet med sykdomstilstander. Det er forventet at denne teknologien vil tillate utvikling av lovende diagnostiske verktøy med et stort potensial i klinikken.

Figur 1 viser arbeidsflyten av denne metodikken, som er delt inn i to screening runder. I den første runden av screening, brukte vi 5 DNA-sonder (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C og DNA Poly G) og også 5 RNA-sonder (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C og RNA Poly G). Rådata i denne screening runde kan bli funnet i supplerende tabell 1. I den andre runden, kjemisk modifiserte sonder ble syntetisert ved å erstatte RNA sekvensen med kjemisk modifisert nucleosides ...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Endret nuklease aktivitet har vært forbundet med ulike menneskelige forhold, underliggende dens potensial som en biomarkør. Den modulære og lett å implementere screening metodikk som presenteres i dette papiret gjør det mulig å velge bestemte nukleinsyre syre sonder for å utnytte nuklease aktivitet som en biomarkør av sykdom.

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Denne protokollen gir et kraftig alternativ for screening nuklease aktivitet som biomarkør av sykdom, med en lett-å-implementere metodikk selv for forskere som ikke er så spesialisert på nukleinsyre sonder. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å velge nukleinsyrepromer som kan identifisere både kjente og ukjente nukleaseaktiviteter, og dra nytte av sonden-nuklease dynamisk interaksjon. Andre fordeler med denne metodikken er dens fleksibilitet, høy reproduserbarhet og brukervennlighet.Demonstrasjonen vil bli utført av Khadija, en Masters student, og Baris, en postdoc fra vårt laboratorium. Ved utdesign av et oligonukleotidbibliotek, inkluderer minst ett DNA og en RNA tilfeldig sekvens som inneholder en kombinasjon av adenin, guanin, cytosin og tiamin eller uracil. For å forberede oligonukleotidsondene, spinn ned de lyofiliserte oligonukleotidsondene og fortynne hver sonde i Tris-EDTA-bufferen ved en 500 picomolar per mikroliterkonsentrasjon for å forhindre kjerneforringelse.For bakteriell kultur på solid medium, rull en enkelt porøs glassperle fra kryogen lagring direkte på en kulturrett som inneholder TSA supplert med beruset saublod for å streke ut individuelle bakterielle kolonier. Plasser deretter platen ved 37 grader Celsius i 24 timer. For bakteriell kultur i flytende medium, overfør en enkelt koloni fra en solid medium kultur til 50 milliliter TSB for inkubasjon ved 37 grader Celsius i 24 timer ved 200 rotasjoner per minutt.Neste dag, fortynne kulturen på en en til 500 ratio i frisk TSB og inkubere bakteriene i ytterligere 24 timer ved 37 grader Celsius og 200 rotasjoner per minutt i en risting inkubator. For å sette opp en kjerneaktivitetsanalyse, først forvarm et fluorometer til 37 grader Celsius og legg forsiktig til 96 mikroliter sterilt TSB eller supernatant fra en Salmonella eller E.Coli flytende medium kultur til en 1,5 milliliter kjernefri mikrocentrifugerør per sonde. Tilsett fire mikroliter sondearbeidsløsning til hvert rør og bruk en pipette til å blande innholdet i hvert rør grundig til homogene løsninger oppnås, og vær forsiktig for å unngå bobler.Deretter legger du forsiktig 95 mikroliter av hver løsning nær veggen av individuelle brønner av en svart bunn, ikke-behandlet 96 brønnplate, og tar vare på å unngå bobler. Når alle løsningene er lagt til, dekk platen og inspiser lokket visuelt for pennemarkeringer eller støv som kan introdusere måleartefakter. Hvis du vil konfigurere programvaren for måling av kjerneaktivitet, åpner du et passende oppkjøpsprogram.Velg Les nå i Oppgavebehandling-vinduet, og velg Ny for å opprette den kinetiske måleprotokollen. Klikk Angi temperatur for å velge 37 grader Celsius og bekreft og lagre innstillingene ved å klikke OK. Klikk Start kinetikk. I popup-vinduet velger du to timer i inndataboksen Kjøretid og to minutter i inndataboksen for intervall før du klikker OK for å bekrefte og lagre innstillingene.Klikk på Les. I popup-vinduet velger du Fluorescence-intensitet som deteksjonsmetode, endepunkt kinetisk som lesetype og filtre som optikktype. Klikk deretter OK. Velg Grønn fra filtersettet i popup-vinduet, og klikk på OK. Velg Bruk lokk i Prosedyre-vinduet, og klikk på Valider.Et popup-vindu vises som bekrefter at den opprettede protokollen er gyldig. Velg Prosedyre under Protokoll-menyen. I Prosedyre-vinduet definerer du brønnene som skal måles, og skriver inn navnet på eksperimentet i inndataboksen Filnavn.Legg deretter platen inn i plateleseren, og ta vare på at platen er i riktig retning og klikker på Les ny-knappen for å starte oppkjøpet. For dataanalyse åpner du dataene i riktig analyseprogramvare, og velger en av de målte brønnene i plate ett vindu. Klikk velg brønner og ta med alle de målte brønnene i vinduet Brønnvalg før du klikker OK. Velg deretter Data i ett platevindu for å visualisere de tabulerte resultatene, og klikk på QuickExport for å eksportere dataene til et regneark.Merk datakolonnene slik det passer for hvert eksempel og hver sonde, i et regneark, og plott de relative fluorescensenhetene kontra tid for dataene for å generere kinetiske grafer. I dette representative eksperimentet, etter den første runden med screening, rapporterte Salmonella-kulturens supernatanter en klar preferanse for RNA-sonder over DNA-sondene. Basert på identifisering av RNA som foretrukket nukleinsyretype av Salmonella-nukleaser, er et nytt RNA-bibliotek designet for bruk i andre runde av screening.I motsetning viste E.Coli i kulturmediumkontroller en svært begrenset evne til å forringe RNA-sonder. Etter en andre runde med screening ved hjelp av kjemisk modifiserte nukleotider med sikte på å øke spesifisiteten til RNA-sondene, kunne RNA pyrimidin 2'O-metyl identifiseres på grunnlag av deres kjemiske modifikasjoner som viser den beste kinetiske oppførselen sammenlignet med henholdsvis RNA pyrimidin 2'fluor og RNA purine 2'fluoro. Disse resultatene tyder på at Salmonella har en viktig RNAse aktivitet med differensial substrat kjemi preferanse som kan brukes til å velge sonder som er i stand til å spesifikt gjenkjenne denne bakterien.Denne prosedyren gjør det mulig å velge sonder som er i stand til å identifisere kjerneaktiviteter forbundet med sykdomstilstander, som kreft eller bakteriell infeksjon, slik at utviklingen av nye kliniske diagnostiske verktøy.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

En Polyanilin-baserte sensor av nukleinsyrer

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

forberedelse og<em&gt; I Vivo</em&gt; Bruk av en aktivitetsbasert Probe for<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rensing og kinetisk analyse via oksygen elektrode for å studere DesB Dioxygenase aktivitet og hemming

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Identifisere amino acid Overproducers bruke rare-Codon-Rich markører

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening for fytoøstrogener ved hjelp av en cellebasert østrogenreseptor β Reporter Analyse

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatisering av proteinkrystaller med I3C ved hjelp av tilfeldig mikroseede matrix screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Foreta presise og nøyaktige FRET-målinger med ett molekyl ved hjelp av åpen kildekode-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Bestemme den termodynamiske og kinetiske assosiasjonen til en DNA-aptamer og tetracyklin ved bruk av isotermisk titreringskalorimetri

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...