Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить Луису И. Эрнандес (Университет Линчепинга) за ее тщательный пересмотр рукописи и ценные советы. Эта работа была поддержана Фондом Кнута и Алисы Валленберг и Шведским правительством по стратегическим исследованиям в области материаловедения по перспективным функциональным материалам в Университете Линчепинга (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No 2009-00971).

1. Дизайн и подготовка библиотеки олигонуклеотида
<ol><li>Дизайн библиотеки<ol>
<li>Основываясь на следующих критериях дизайн библиотеки утоленных флуоресцентных олигонуклеотидных зондов между 8 и 12-Mer долго, чтобы избежать вторичного формирования структуры, с одинаковой длиной для всех зо...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Изменения активности нуклеаны были связаны с широким спектром фенотипов заболеваний, в ключая различные виды рака и бактериальных инфекций. Эти изменения предлагается быть возбудителем состояния14, в то время как в других случаях они являются следствием пагубного физиоло...

Nucleases являются класс ферментов, способных расщепления фосфодиестерных связей, которые образуют основную структуру нуклеиновой кислоты молекул. Огромное разнообразие нуклеаз делает их классификацию довольно трудно. Тем не менее, Есть некоторые общие критерии, используемые для описания нуклеазы, такие как предпочтения субстрата (дезоксибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК)), расщепление сайта (эндонуклезаили или exonucleases), или ионной зависимости металла, среди других1. Nucleases являются высоко сохранены каталитические ферменты, которые имеют основные роли в обоих, прокариотических и эукариотических организмов и были использованы, и продолжают использоваться, как инструменты редактирования генов2. Они также являются основополагающими действующими лицами в поддержании ДНК и репликации, помогая сохранить стабильность генома и участвуя в процессах проверки чтения3. В бактериях, например, нуклеазы были определены в качестве важных факторов вирулентности, способных способствовать выживаемости бактерий за счет снижения эффективности иммунной системы хозяина4,5,6,7 ,8. У млекопитающих, нуклеазы были предложены быть вовлечены в апоптоз9, митохондриальный биогенез и содержание10 и посредничество антибактериальных и противовирусных врожденных иммунных ответов11. Неудивительно, что изменения активности нуклеаза, будь то повышение или отсутствие, были вовлечены в широкий спектр заболеваний человека. Эти заболевания варьируются от широкого спектра раковых заболеваний12,13 до сердечной гипертрофии10 или аутоиммунных заболеваний14. Таким образом, нуклеазы стали интересными кандидатами в качестве биомаркеров для неоднородной группы человеческих условий. В самом деле, nucleases уже показали свой потенциал в качестве успешных диагностических инструментов для выявления инфекций, вызванных конкретными бактериальными агентами, такими как золотистый стафилококк или Escherichia coli15, 16. Во многих типах рака, выражение стафилококковой нуклеи домен-содержащих белков 1 (SND1) рибонуклеазы свидетельствует о плохой прогноз17. У больных раком поджелудочной железы, повышенный рибонуклеаI (RNase I) сыворотки были зарегистрированы18 и предлагается быть связаны с раковыми фенотипами клеток19. В ишемических условиях сердца, таких как инфаркт миокарда или нестабильный стенокардия pectoris, дезоксирибонуклея I (DNase I) уровни сыворотки были показаны, чтобы быть действительным диагностическим маркером20,21.
Было высказывано что глобальный план деятельности nuclease может быть по-разному в здоровых и положениях заболевания. В самом деле, последние доклады использовали различия в активности нуклеаза различать здоровые и раковые фенотипы22 или для выявления патогенных бактериальных инфекций в видов-специфических образом15,23. Эти выводы открыли новый путь для использования нуклеаз в качестве биомаркеров болезни. Поэтому существует необходимость в разработке комплексного метода скрининга, способного систематически выявлять связанные с заболеваниями различия в деятельности нуклеаза, которые могут иметь ключевое значение при разработке новых диагностических средств.
В этом виде мы вводим и описываем новый подход к скринингу in vitro(рисунок 1)для выявления чувствительных и специфических зондов, способных дискриминировать деятельность нуклеазы в здоровой и нездоровой, или деятельность, характерную для типа клеток или бактерий. Воспользовавшись модульностью нуклеиевых кислот, мы разработали начальную библиотеку утоленных флуоресцентных олигонуклеотидных зондов, состоящих из всеобъемлющего набора различных последовательностей и химии, оба являющиеся важными параметрами для оформления библиотеки. Эти олигонуклеотидные зонды окружены флюорофором (флуоресцеин амидитом, FAM) и утоляжем (tide quencher 2, T'2) на 5' и 3' заканчивается соответственно (Таблица 1). С помощью этого флуоресцентного резонанса передачи энергии (FRET) на основе флюорометрического исследования для измерения кинетики ферментативной деградации, мы смогли определить кандидат зондов с потенциалом для дискриминации дифференциальных моделей нуклеаза деятельности связанных со здоровыми или болезнями. Мы разработали итеративный процесс, в котором создаются новые библиотеки на основе лучших зондов-кандидатов, что позволяет идентифицировать все более конкретные кандидаты зондов в последующих шагах скрининга. Кроме того, этот подход использует каталитический характер нуклеаз для повышения чувствительности. Это достигается за счет использования активируемого характера репортер зондов и способность nucleases постоянно обрабатывать молекулы субстрата, как представляющие ключевые преимущества по сравнению с альтернативными антителами или малых молекул на основе методов скрининга.
Этот подход предлагает весьма модульный, гибкий и простой в реализации инструмент скрининга для идентификации конкретных зондов нуклеиновой кислоты, способных различать здоровые и болезни, и отличную платформу для разработки новых диагностические инструменты, которые могут быть адаптированы для будущих клинических применений. Таким образом, этот подход был использован для выявления нуклеаза деятельности, полученных от Salmonella Typhimurium (здесь называют salmonella) для конкретной идентификации этой бактерии. В следующем протоколе мы сообщаем о методе проверки на бактериальную активность нуклеаза с помощью кинетической экспертизы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nucleases являются класс ферментов, которые расщепляют нуклеиновые кислоты путем катализирования гидролиза фосфодидерных связей, которые связывают рибоза сахара. Nucleases отображают различные жизненно важные физиологические роли в прокариотических и эукариотических организмов, начиная от поддержания стабильности генома для обеспечения защиты от патогенных микроорганизмов. Измененная активность нуклеаза была связана с несколькими патологическими состояниями, включая бактериальные инфекции и рак. С этой целью деятельность по нуклеаде показала большой потенциал для использования в качестве конкретного биомаркера. Однако надежный и воспроизводимый метод скрининга, основанный на этой деятельности, остается весьма желательным.
В этой связи мы внедряем метод, позволяющий проводить скрининг на нуклеализную деятельность с использованием зондов нуклеиновой кислоты в качестве субстратов с разновидностью между патологическими и здоровыми состояниями. Этот метод предлагает возможность проектирования новых библиотек зонда, с увеличением специфичности, в итеративной манере. Таким образом, несколько раундов скрининга необходимы для уточнения конструкции зондов с расширенными функциями, пользуясь наличием химически модифицированных нуклеиновых кислот. Значительный потенциал предлагаемой технологии заключается в ее гибкости, высокой воспроизводимости и универсальности скрининга активности нуклеаза, связанной с заболеваниями. Ожидается, что эта технология позволит разработать перспективные диагностические инструменты с большим потенциалом в клинике.

На рисунке 1 показан рабочий поток этой методологии, которая делится на два раунда отбора. В первом раунде скрининга, мы использовали 5 ДНК зондов (ДНК, ДНК Поли A, ДНК Поли T, ДНК Поли C и ДНК Поли G), а также 5 РНК зондов (РНК, РНК Поли A, РНК Поли U РНК Поли C и РНК Поли G). Необработ?...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Измененная деятельность нуклеаза была связана с различными человеческими условиями, лежащими в основе ее потенциала в качестве биомаркера. Модульная и простая в ней методология скрининга, представленная в настоящем документе, позволяет подбирать специфические нуклеиновые кислотные зонды для использования нуклеаза в качестве биомаркера заболевания.

Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Этот протокол обеспечивает мощную альтернативу для скрининга активности нуклеазы в качестве биомаркера болезни, с простой в реализации методологии даже для исследователей, которые не так специализируются на нуклеиновой кислоты зондов. Основным преимуществом этого метода является возможность выбора зондов нуклеиновой кислоты, которые могут идентифицировать как известные, так и неизвестные действия нуклеазы, пользуясь динамическим взаимодействием зонда и нуклеазы. Другими преимуществами этой методологии являются ее гибкость, высокая воспроизводимость и простота использования.Демонстрацию пробудут Хадиджа, студентка магистратуры, и Барис, постдок из нашей лаборатории. При проектировании библиотеки олигонуклеотида, включают по крайней мере одну ДНК и один РНК случайной последовательности, содержащей сочетание аденина, гуанина, цитозина и тиамина или uracil. Чтобы подготовить олигонуклеотидные зонды, вращай лиофилизированные олигонуклеотидные зонды и разбавляй каждый зонд в буфере Трис-ЭДТА при концентрации пикомоляра 500 на микролитер для предотвращения деградации нуклеазы.Для бактериальной культуры на твердой среде, рулон одного пористого стеклянного шарика из криогенного хранения непосредственно на одну культуру блюдо, содержащее TSA дополнены дефибрилированной крови овец, чтобы полоса из отдельных бактериальных колоний. Затем поместите пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. Для бактериальной культуры в жидкой среде, передача одной колонии от твердой средней культуры до 50 миллилитров TSB для инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов при 200 вращениях в минуту.На следующий день разбавить культуру в соотношении от одного до 500 в свежем TSB и инкубировать бактерии в течение дополнительных 24 часов при 37 градусах по Цельсию и 200 вращений в минуту в трясущимся инкубаторе. Чтобы настроить анализ активности нуклеазы, сначала предварительно разогрейте флюорометр до 37 градусов по Цельсию и аккуратно добавьте 96 микролитров стерильного TSB или супернатанта из жидкой средней культуры Salmonella или E.Coli в одну 1,5-миллилитровую трубку микроцентрифуга на зонд. Добавьте четыре микролитров зонда рабочего решения для каждой трубки и использовать пипетку, чтобы тщательно смешивать содержимое каждой трубки до тех пор, пока однородные решения не будут достигнуты, заботясь, чтобы избежать пузырьков.Далее тщательно загрузите 95 микролитров каждого раствора вблизи стенки отдельных колодцев черного дна, необработав 96 колодцев, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков. Когда все решения были добавлены, покройте пластину и визуально осмотрите крышку для маркировки пера или пыли, которые могут ввести измерения артефактов. Чтобы настроить программное обеспечение для измерения активности нуклеазы, откройте подходящую программу приобретения.Выберите Read Now из окна Task Manager и выберите New для создания кинетического протокола измерения. Нажмите Установите температуру, чтобы выбрать 37 градусов по Цельсию и подтвердить и сохранить настройки, нажав OK. Нажмите Начало Кинетики. Во всплывающем окне выберите два часа в поле ввода Run Time и две минуты в поле ввода интервала перед нажатием OK для подтверждения и сохранения настроек.Нажмите Читать. Во всплывающем окне выберите интенсивность флуоресценции в качестве метода обнаружения, Endpoint Kinetic как тип чтения и фильтры в качестве типа оптики. Тогда нажмите OK. Во всплывающем окне выберите Green из набора фильтров и нажмите OK. В окне Процедуры выберите крышку use и нажмите Validate.Появится всплывающее окно, подтверждающее, что созданный протокол действителен. В меню Протокола выберите Процедуру. В окне Процедуры определите скважины, которые будут измерены, и введите название эксперимента в поле ввода имени файла.Затем загрузите пластину в считыватель пластин, заботясь о том, чтобы пластина была в правильном направлении, и нажмите кнопку Read New, чтобы начать приобретение. Для анализа данных откройте данные в соответствующем программном обеспечении анализа и выберите одну из измеренных скважин в окне пластины. Нажмите Выберите Уэллс и включите все измеренные скважины в окно Well Selection Dialog перед нажатием OK. Затем выберите данные в окне одного листа, чтобы визуализировать результаты таблицы и нажмите кнопку «Быстрыйэкспорт», чтобы экспортировать данные в электронную таблицу.В электронной таблице отмекать столбцы данных по мере необходимости для каждого образца и зонда, а также построить относительные единицы флуоресценции по сравнению со временем для данных для создания кинетических графиков. В этом репрезентативном эксперименте, после первого раунда скрининга, супернатанты культуры сальмонеллы сообщили о явном предпочтении РНК-зондов над зондами ДНК. На основе определения РНК в качестве предпочтительного типа нуклеиновой кислоты ядрами сальмонеллы, новая библиотека только для РНК предназначена для использования во втором раунде скрининга.В отличие от этого, E.Coli в культуре среднего контроля продемонстрировали очень ограниченную способность деградировать РНК-зондов. После второго раунда скрининга с использованием химически модифицированных нуклеотидов, направленных на повышение специфичности РНК-зондов, РНК пиримидин 2'O-метил и РНК пурин 2'O-метил могут быть определены на основе их химических модификаций как выставление наиболее эффективных кинетического поведения по сравнению с РНК пиримидин 2'fluoro и РНК purine 2'fluoro соответственно. Эти результаты показывают, что salmonella имеет важную активность РНКС с дифференциальным предпочтением химии субстрата, которые могут быть использованы для выбора зондов, способных специально распознать эту бактерию.Эта процедура позволяет от выбора зондов, которые способны определить нуклеазы деятельности, связанные с заболеваниями, такими как рак или бактериальная инфекция, что позволяет разработать новые клинические диагностические инструменты.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Полианилиновой на основе датчика нуклеиновых кислот

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

подготовки и<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование тестовое активность на основе для<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Кислота амидазные

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Выражение и очищение Nuclease-бесплатный кислород Scavenger Протокатечуат 3,4-Диоксигеназы

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Оценка содержания лигнина в растительной биомассе с использованием тиогликолиновой кислоты (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Проведение точных и точных одномолекулярных измерений FRET с помощью smfBox с открытым исходным кодом

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Определение термодинамической и кинетической ассоциации аптамера ДНК и тетрациклина с использованием изотермической титрационной калориметрии

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Идентификация G-квадруплексов в ДНК-матрице с помощью химического картирования

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

В центре внимания автора: Характеристика G-квадруплекса ДНК с помощью химического картирования на основе бис-3-хлорпиперидина 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In Vitro Химическое картирование структур ДНК G-квадруплекса бис-3-хлорпиперидинами

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...