Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
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Los autores quisieran reconocer a Luiza I. Hernandez (Universidad de Link-ping) por su cuidadosa revisión del manuscrito y valiosos consejos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Knut y Alice Wallenberg y el área de investigación estratégica del gobierno sueco en ciencia de materiales sobre materiales funcionales avanzados en la Universidad de Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971).

1. Diseño y preparación de la biblioteca oligonucleótidos
<ol><li>Diseño de bibliotecas<ol>
<li>Basándose en los siguientes criterios, diseñe una biblioteca de sondas de oligonucleótidos fluorescentes alargadas de entre 8 y 12 mer de largo para evitar la formación de estructuras secundarias, con la misma longitud para todas las sondas.<ol>
<li>Incluir al menos un ADN y una secuencia aleatoria de ARN que contenga una combinación de adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T)/uracilo (U)(sondas</...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Las alteraciones de la actividad de nucleasa se han asociado con una amplia variedad de fenotipos de la enfermedad, incluyendo diferentes tipos de cáncer e infecciones bacterianas. Se propone que estas alteraciones sean el agente causal de una condición14,mientras que en otros casos son consecuencia de un evento fisiológico perjudicial20 o agente patógeno16,26. No es de extrañar que se hayan descrito los intent...

Las nucleasas son una clase de enzimas capaces de cortar los enlaces de fosfodiester que forman la estructura columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico. La gran diversidad de nucleasas hace que su clasificación sea bastante difícil. Sin embargo, existen algunos criterios comunes utilizados para describir las nucleasas, como la preferencia de sustrato (ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN)), el sitio de escote (endonucleasas o exonucleasas) o la dependencia de iones metálicos, entre otros1. Las nucleasas son enzimas catalíticas altamente conservadas que tienen funciones fundamentales en ambos organismos procariotas y eucariotas y se han utilizado, y siguen utilizándose, como herramientas de edición genética2. También son actores fundamentales en el mantenimiento y replicación del ADN, ayudando a mantener la estabilidad del genoma y participando en procesos de lectura de prueba3. En bacterias, por ejemplo, las nucleasas se han identificado como factores de virulencia importantes, capaces de promover la supervivencia bacteriana reduciendo la eficacia del sistema inmunitario del huésped4,5,6,7 ,8. En los mamíferos, se ha sugerido que las nucleasas están implicadas en la apoptosis9,la biogénesis mitocondrial y el mantenimiento10 y la mediación de las respuestas inmunitarias innatas antibacterianas y antivirales11. No es de extrañar que las alteraciones de la actividad de nucleasa, ya sea la mejora o la falta de, se hayan visto implicadas en una amplia gama de enfermedades humanas. Estas enfermedades van desde una amplia variedad de cánceres12,13 a hipertrofia cardíaca10 o enfermedades autoinmunes14. Por lo tanto, las nucleasas se han convertido en candidatos interesantes como biomarcadores para un grupo heterogéneo de condiciones humanas. De hecho, las nucleasas ya han demostrado su potencial como herramientas de diagnóstico exitosas para la detección de infecciones causadas por agentes bacterianos específicos, como Staphylococcus aureus o Escherichia coli15, 16. En muchos tipos de cáncer, la expresión de la proteína de nuleas estafilocócica 1 (SND1) ribonucleasa es indicativa de mal pronóstico17. En pacientes con cáncer de páncreas, se han notificado niveles séricos elevados de ribonucleasa I (RNase I)18 y se ha propuesto asociarse con fenotipos de células cancerosas19. En afecciones cardíacas isquémicas, como el infarto de miocardio o la angina pecírica inestable, los niveles séricos de desoxirrionucleasa I (DNase I) han demostrado ser un marcador diagnóstico válido20,21.
Se ha planteado la hipótesis de que el plan global de actividad de nucleasa puede ser diferente en estados sanos y de enfermedades. De hecho, informes recientes han utilizado diferencias en la actividad de nucleasa para distinguir entre fenotipos sanos y cancerosos22 o para identificar infecciones bacterianas patógenas de una manera específica de cada especie15,23. Estos hallazgos han abierto una nueva vía para el uso de nucleasas como biomarcadores de la enfermedad. Por lo tanto, existe la necesidad de que se elase un método de cribado integral que pueda identificar sistemáticamente las diferencias asociadas a la enfermedad en la actividad de nucleasa, que pueden ser de vital importancia en el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico.
En este documento, presentamos y describimos un nuevo enfoque de cribado in vitro(Figura 1) para identificar sondas sensibles y específicas capaces de discriminar entre la actividad de nucleasa en sano y insalubre, o la actividad específica de un tipo de célula o bacteria. Aprovechando la modularidad de los ácidos nucleicos, diseñamos una biblioteca inicial de sondas de oligonucleótidos fluorescentes apantallados que consiste en un conjunto completo de diferentes secuencias y químicas, siendo ambos parámetros importantes para el diseño de la biblioteca. Estas sondas de oligonucleótidos están flanqueadas por un fluoróforo (fluoresceína amidita, FAM) y un quencher (tide quencher 2, TQ2) en los extremos de 5' y 3' respectivamente(Tabla 1). Mediante el uso de este ensayo fluorométrico basado en transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para medir la cinética de la degradación enzimática, pudimos identificar las sondas candidatas con el potencial de discriminar patrones diferenciales de actividad de nucleasa asociados con estados sanos o de enfermedad. Diseñamos un proceso iterativo, en el que se crean nuevas bibliotecas basadas en las mejores sondas candidatas, que permite la identificación de sondas candidatas cada vez más específicas en pasos de selección posteriores. Además, este enfoque aprovecha la naturaleza catalítica de las nucleasas para aumentar la sensibilidad. Esto se logra aprovechando la naturaleza activadezal de las sondas de reportero y la capacidad de las nucleasas para procesar continuamente moléculas de sustrato, ambas representando ventajas clave sobre anticuerpos alternativos o pequeños métodos de cribado basados en moléculas.
Este enfoque ofrece una herramienta de cribado altamente modular, flexible y fácil de implementar para la identificación de sondas específicas de ácido nucleico capaces de discriminar entre estados sanos y enfermedades, y una excelente plataforma para el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico que se pueden adaptar para futuras aplicaciones clínicas. Como tal, este enfoque se utilizó para identificar la actividad de nucleasa derivada de Salmonella Typhimurium (en lo sucesivo, Salmonella)para la identificación específica de esta bacteria. En el siguiente protocolo, informamos sobre un método para detectar la actividad de nucleasas bacterianas mediante el análisis cinético.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Las nucleasas son una clase de enzimas que descomponen los ácidos nucleicos al catalizar la hidrólisis de los enlaces de fosfodiester que unen los azúcares ribosa. Las nucleasas muestran una variedad de funciones fisiológicas vitales en organismos procariotas y eucariotas, que van desde el mantenimiento de la estabilidad del genoma hasta la protección contra patógenos. La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con varias condiciones patológicas, incluyendo infecciones bacterianas y cáncer. Con este fin, la actividad de nucleasas ha demostrado un gran potencial para ser explotada como un biomarcador específico. Sin embargo, un método de cribado robusto y reproducible basado en esta actividad sigue siendo altamente deseable.
En este documento, introducimos un método que permite el cribado de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico como sustratos, con el alcance de la diferenciación entre condiciones patológicas y saludables. Este método ofrece la posibilidad de diseñar nuevas bibliotecas de sondeos, con una especificidad cada vez mayor, de forma iterativa. Por lo tanto, se realizan múltiples rondas de cribado para refinar el diseño de las sondas con características mejoradas, aprovechando la disponibilidad de ácidos nucleicos modificados químicamente. El considerable potencial de la tecnología propuesta reside en su flexibilidad, alta reproducibilidad y versatilidad para el cribado de la actividad de nucleasa asociada con las condiciones de la enfermedad. Se espera que esta tecnología permita el desarrollo de herramientas de diagnóstico prometedoras con un gran potencial en la clínica.

La Figura 1 muestra el flujo de trabajo de esta metodología, que se divide en dos rondas de cribado. En la primera ronda de cribado, utilizamos 5 sondas de ADN (ADN, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C y DNA Poly G) y también 5 sondas de ARN (ARN, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C y RNA Poly G). Los datos brutos de esta ronda de cribado se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1. En la segunda ronda, las sondas modificadas químicamente se sintetizaron reemplazando la ...

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con diferentes condiciones humanas, subyacentes a su potencial como biomarcador. La metodología de cribado modular y fácil de implementar presentada en este documento permite la selección de sondas específicas de ácido nucleico para aprovechar la actividad de nucleasa como biomarcador de enfermedades.

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Este protocolo proporciona una alternativa poderosa para el cribado de la actividad de la nucleasa como biomarcador de la enfermedad, con una metodología fácil de implementar incluso para investigadores que no están tan especializados en sondas de ácido nucleico. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de seleccionar sondas de ácido nucleico que pueden identificar actividades de nucleasa conocidas y desconocidas, aprovechando la interacción dinámica sonda-nucleasa. Otras ventajas de esta metodología son su flexibilidad, alta reproducibilidad y facilidad de uso.La demostración será realizada por Khadija, un estudiante de maestría, y Baris, un postdoctorado de nuestro laboratorio. Al diseñar una biblioteca de oligonucleótidos, incluya al menos un ADN y una secuencia aleatoria de ARN que contenga una combinación de adenina, guanina, citosina y tiamina o uracilo. Para preparar las sondas de oligonucleótidos, gire hacia abajo las sondas de oligonucleótidos liofilizados y diluya cada sonda en el tampón Tris-EDTA a una concentración de 500 picomolar por microlitro para evitar la degradación de la nucleasa.Para el cultivo bacteriano en medio sólido, enrolle un solo cordón de vidrio poroso de almacenamiento criogénico directamente sobre un plato de cultivo que contenga TSA complementado con sangre de oveja desfibrinada para rayar colonias bacterianas individuales. A continuación, coloque la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para el cultivo bacteriano en medio líquido, transfiera una sola colonia de un cultivo medio sólido a 50 mililitros de TSB para incubación a 37 grados centígrados durante 24 horas a 200 rotaciones por minuto.Al día siguiente, diluir el cultivo a una proporción de uno a 500 en TSB fresco e incubar las bacterias durante 24 horas adicionales a 37 grados centígrados y 200 rotaciones por minuto en una incubadora de temblores. Para configurar un ensayo de actividad de nucleasa, primero precalentar un fluorómetro a 37 grados Celsius y añadir cuidadosamente 96 microlitros de TSB estéril o sobrenadante de un cultivo medio líquido de Salmonella o E.coli a un tubo de microcentrífuga sin nuclelisilitro de 1,5 mililitros por sonda. Agregue cuatro microlitros de solución de trabajo de sonda a cada tubo y utilice una pipeta para mezclar a fondo cada contenido del tubo hasta que se logren soluciones homogéneas, teniendo cuidado de evitar burbujas.A continuación, cargue cuidadosamente 95 microlitros de cada solución cerca de la pared de pozos individuales de un fondo negro, placa de 96 pozos no tratada, teniendo cuidado de evitar burbujas. Una vez añadidas todas las soluciones, cubra la placa e inspeccione visualmente la tapa en busca de marcas de plumas o polvo que puedan introducir artefactos de medición. Para configurar el software para la medición de la actividad de la nucleasa, abra un programa de software de adquisición adecuado.Seleccione Leer ahora en la ventana Administrador de tareas y seleccione Nuevo para crear el protocolo de medición cinética. Haga clic en Establecer temperatura para seleccionar 37 grados centígrados y confirmar y guardar la configuración haciendo clic en Aceptar. Haga clic en Iniciar cinética. En la ventana emergente, seleccione dos horas en el cuadro de entrada Tiempo de ejecución y dos minutos en el cuadro de entrada de intervalo antes de hacer clic en Aceptar para confirmar y guardar la configuración.Haga clic en Leer. En la ventana emergente, seleccione Intensidad de fluorescencia como Método de detección, Punto final Kinético como Tipo de lectura y Filtros como Tipo de óptica. A continuación, haga clic en Aceptar. En la ventana emergente, seleccione Verde en el conjunto de filtros y haga clic en Aceptar. En la ventana Procedimiento, seleccione Usar tapa y haga clic en Validar.Aparecerá una ventana emergente que confirma que el protocolo creado es válido. En el menú Protocolo, seleccione Procedimiento. En la ventana Procedimiento, defina los pozos que se van a medir e introduzca el nombre del experimento en el cuadro de entrada Nombre de archivo.A continuación, cargue la placa en el lector de placas, teniendo cuidado de que la placa esté en la orientación correcta y haga clic en el botón Leer nuevo para comenzar la adquisición. Para el análisis de datos, abra los datos en el software de análisis adecuado y seleccione uno de los pozos medidos en la placa una ventana. Haga clic en Seleccionar pozos e incluya todos los pozos medidos en la ventana Diálogo de selección de pozos antes de hacer clic en Aceptar. A continuación, seleccione Datos en la placa una ventana para visualizar los resultados tabulados y haga clic en QuickExport para exportar los datos a una hoja de cálculo.En una hoja de cálculo, etiquete las columnas de datos según corresponda para cada muestra y sondeo, y trace las unidades de fluorescencia relativas frente al tiempo para que los datos generen gráficos cinéticos. En este experimento representativo, después de la primera ronda de cribado, los sobrenadantes del cultivo de Salmonella reportaron una clara preferencia por las sondas de ARN sobre las sondas de ADN. Sobre la base de la identificación del ARN como el tipo de ácido nucleico preferido por las nucleas de Salmonella, una nueva biblioteca solo de ARN está diseñada para ser utilizada en la segunda ronda de cribado.Por el contrario, E. coli en los controles de medios de cultivo demostró una capacidad muy limitada para degradar las sondas de ARN. Después de una segunda ronda de cribado utilizando nucleótidos modificados químicamente con el objetivo de aumentar la especificidad de las sondas de ARN, el ARN pirimidina 2'O-metil y ARN purina 2'O-purilo podrían identificarse sobre la base de sus modificaciones químicas como que presentan el mejor comportamiento cinético de rendimiento en comparación con el ARN pirimidina 2'fluoro y ARNina 2'fluoro respectivamente. Estos resultados sugieren que Salmonella tiene una actividad importante de RNAse con preferencia química de sustrato diferencial que se puede utilizar para seleccionar sondas capaces de reconocer específicamente esta bacteria.Este procedimiento permite la selección de sondas que son capaces de identificar las actividades de nucleasa asociadas con las condiciones de la enfermedad, como el cáncer o la infección bacteriana, permitiendo el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico clínico.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Un sensor basado en polianilina de ácidos nucleicos

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Investigación

Bioquímica

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Preparación y<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de DesB dioxigenasa

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Estimación del contenido de lignina de biomasa vegetal utilizando ácido tioglicólico (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Realización de mediciones FRET precisas y precisas de una sola molécula utilizando el smfBox de código abierto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Identificación de g-cuádruples en una plantilla de ADN mediante mapeo químico

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Autor destacado: Caracterización del ADN G-Quadruplex mediante mapeo químico basado en bis-3-cloropiperidina 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Mapeo químico de estructuras de ADN G-cuádruple por bis-3-cloropiperidinas

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...