Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Författarna vill tacka Luiza I. Hernandez (Linköpings universitet) för hennes noggranna revidering av manuskriptet och värdefulla råd. Detta arbete stöddes av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse och statens strategiska forskningsområde i materialvetenskap om avancerade funktionella material vid Linköpings universitet (fakultets bidraget SFO-mat-LiU nr 2009-00971).

1. utformning och förberedelse av oligonukleotidbibliotek
<ol><li>Biblioteks design<ol>
<li>Baserat på följande kriterier utforma ett bibliotek av kylda fluorescerande oligonukleotid sonder mellan 8 och 12-mer lång tid för att undvika sekundär struktur bildning, med samma längd för alla sonder.<ol>
<li>Inkludera minst ett DNA och en RNA-slumpmässig sekvens som innehåller en kombination av adenin (a), Guanin (G), Cytosin (C) och Tymin (T)/uracil (U) (DNA och RNA-sonder i tabell 1). Anmärkn...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Förändringar av nukleasaktivitet har förknippats med en mängd olika sjukdoms fenotyper, inklusive olika typer av cancer och bakteriella infektioner. Dessa förändringar föreslås vara smittämnen av ett tillstånd14, medan de i andra fall är följden av en skadlig fysiologisk händelse20 eller patogena medel16,26. Inte överraskande, försök att använda nukleaser och nukleasaktivitet som en diagnostisk biom...

Nukleaser är en klass av enzymer som kan klyva de fosfodiester obligationer som utgör ryggraden struktur av nukleinsyra molekyler. Den stora mångfalden av nukleaser gör deras klassificering ganska svårt. Emellertid, det finns några gemensamma kriterier som används för att beskriva nukleaser, såsom substrat preferens (deoxyribonukleinsyra (DNA) eller ribonukleinsyra (RNA)), klyvning webbplats (endonukleaser eller exonukleases), eller metall Jon beroende, bland annat1. Nukleaser är mycket bevarade katalytiska enzymer som har grundläggande roller i både, prokaryota och eukaryota organismer och har använts, och fortsätter att användas, som gen redigeringsverktyg2. De är också grundläggande aktörer i DNA-underhåll och replikering, hjälper till att hålla genom stabilitet och deltar i korrekturläsning processer3. I bakterier, till exempel, har nukleaser identifierats som viktiga virulensfaktorer, kunna främja bakteriell överlevnad genom att minska effekten av värdens immunsystem4,5,6,7 ,8. Hos däggdjur har nukleaser föreslagits vara inblandade i apoptos9, mitokondriell biogenes och underhåll10 och medling av antibakteriella och antivirala medfödda immunsvar11. Inte överraskande, Nuclease aktivitet förändringar, vare förbättring eller brist på, har varit inblandade i ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar. Dessa sjukdomar varierar från en mängd olika cancer12,13 till hjärthypertrofi10 eller autoimmuna sjukdomar14. Därför har nukleaser blivit intressanta kandidater som biomarkörer för en heterogen grupp av mänskliga förhållanden. I själva verket, nukleaser har redan visat sin potential som framgångsrika diagnostiska verktyg för detektion av infektioner orsakade av specifika bakteriella agenter, såsom Staphylococcus aureus eller Escherichia coli15, 16. i många cancertyper, uttryck av staphylococcal Nuclease domän innehållande protein 1 (SND1) ribonukleas är indikativt för dålig prognos17. I pankreascancer patienter, förhöjda ribonukleas i (RNase i) serumnivåer har rapporterats18 och föreslog att associeras med cancerogena cell fenotyper19. I ischemiska hjärttillstånd, såsom hjärtinfarkt eller instabil angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serumnivåer har visat sig vara en giltig diagnostisk markör20,21.
Det har varit en hypotes om att den globala blåkopia av nukleasaktivitet kan vara olika i friska och sjukdomstillstånd. I själva verket har de senaste rapporterna använt skillnader i nukleasaktivitet för att skilja mellan friska och cancerogena fenotyper22 eller för att identifiera patogena bakteriella infektioner på ett artspecifikt sätt15,23. Dessa fynd har öppnat en ny aveny för användning av nukleaser som biomarkörer för sjukdom. Därför finns det en nödvändighet för att utveckla en heltäckande screeningmetod som systematiskt kan identifiera sjukdomsrelaterade skillnader i nukleasaktivitet, vilket kanske är av avgörande betydelse för utvecklingen av nya diagnostiska verktyg.
Häri introducerar och beskriver vi en ny in vitro-screeningmetod (figur 1) för att identifiera känsliga och specifika sonder som kan diskriminera mellan nukleasaktivitet i friska och ohälsosamma, eller aktivitet som är specifik för en typ av cell eller bakterier. Med utnyttjande av modularitet av nukleinsyror, designade vi ett första bibliotek av kylda fluorescerande oligonukleotid sonder bestående av en omfattande uppsättning av olika sekvenser och kemiska sammansättningar, båda är viktiga parametrar för biblioteks design. Dessa oligonukleotidsonder flankeras av en fluorophore (fluorescein amidite, FAM) och en törstsläckare (Tide törstsläckare TQ2) vid 5 ' och 3 ' ändarna respektive (tabell 1). Genom att använda denna fluorescerande resonans energiöverföring (FRET) baserade fluorometriska analysen för att mäta kinetiken av enzymatisk nedbrytning, kunde vi identifiera kandidat sonder med potential att diskriminera differential mönster av nukleasaktivitet associerade med friska eller sjukdomstillstånd. Vi utformade en iterativ process, där nya bibliotek skapas baserat på de bästa kandidaten sonderna, som gör det möjligt att identifiera allt mer specifika kandidat prober i efterföljande screening steg. Dessutom, detta tillvägagångssätt utnyttjar den katalytiska karaktären av nukleaser för att öka känsligheten. Detta uppnås genom att utnyttja den activatable karaktären av reportern sonder och förmågan hos nukleaser att kontinuerligt bearbeta substrat molekyler, båda representerar viktiga fördelar jämfört med alternativa antikroppar eller små molekyl-baserade screeningmetoder.
Detta tillvägagångssätt erbjuder ett mycket modulärt, flexibelt och lätt att genomföra screening verktyg för identifiering av specifika nukleinsyrliga sonder som kan diskriminera mellan friska och sjukdomstillstånd, och en utmärkt plattform för utveckling av nya diagnostiska verktyg som kan anpassas för framtida kliniska tillämpningar. Som sådan, detta tillvägagångssätt användes för att identifiera Nuclease verksamhet som härrör från salmonella typhimurium (häri kallad salmonella) för den specifika identifieringen av denna bakterie. I följande protokoll rapporterar vi om en metod för att avskärma för bakteriell nukleasaktivitet med hjälp av kinetisk analys.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nukleaser är en klass av enzymer som bryter ner nukleinsyror genom att katalysera hydrolys av fosfodiester obligationer som länkar ribose socker. Nukleaser uppvisar en mängd vitala fysiologiska roller i prokaryota och eukaryotiska organismer, allt från att upprätthålla genomstabilitet till att ge skydd mot patogener. Förändrad nukleasaktivitet har förknippats med flera sjukdomstillstånd inklusive bakteriella infektioner och cancer. För detta ändamål har nukleasaktiviteten visat stor potential att utnyttjas som en specifik biomarkör. En robust och reproducerbar screeningmetod baserad på denna verksamhet är dock fortfarande mycket önskvärd.
Häri introducerar vi en metod som möjliggör screening för nukleasaktivitet med hjälp av nukleinsyrliga sonder som substrat, med omfattningen av differentiering mellan patologiska och hälsosamma tillstånd. Denna metod ger möjlighet att utforma nya sond bibliotek, med ökande specificitet, på ett iterativt sätt. Således, flera omgångar av screening är nödvändiga för att förfina sonderna design med förbättrade funktioner, att dra nytta av tillgängligheten av kemiskt modifierade nukleinsyror. Den föreslagna teknikens avsevärda potential ligger i dess flexibilitet, höga reproducerbarhet och mångsidighet för screening av nukleasaktivitet i samband med sjukdomstillstånd. Det förväntas att denna teknik kommer att möjliggöra utveckling av lovande diagnostiska verktyg med en stor potential i kliniken.

Figur 1 visar arbetsflödet för denna metodik, som är uppdelad i två screening rundor. I den första omgången av screening, vi använde 5 DNA sonder (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C och DNA Poly G) och även 5 RNA sonder (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C och RNA Poly G). Rådata från denna screening runda återfinns i tilläggstabell 1. I den andra omgången syntetiserades kemiskt modifierade sonder genom att ersätta RNA-sekvensen med kemiskt modifierade ...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Förändrad nukleasaktivitet har förknippats med olika mänskliga tillstånd, underliggande dess potential som en biomarkör. Den modulära och lätt att genomföra screening metodik som presenteras i detta dokument kan valet av specifika nukleinsyra sonder för att utnyttja nukleasaktivitet som en biomarkör för sjukdom.

Kinetisk screening av Nukleasaktivitet med hjälp av Nukleinsyrprober

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Detta protokoll ger ett kraftfullt alternativ för screening nukleas aktivitet som biomarkör för sjukdom, med en lätt att genomföra metodik även för forskare som inte är lika specialiserade på nukleinsyra sonder. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att välja nukleinsyra sonder som kan identifiera både kända och okända nukleas aktiviteter, dra nytta av den sond-nukleas dynamisk interaktion. Andra fördelar med denna metodik är dess flexibilitet, höga reproducerbarhet och användarvänlighet.Demonstrationen kommer att utföras av Khadija, en Masters student, och Baris, en postdoc från vårt laboratorium. Vid utformning av ett oligonukleotidbibliotek, inkludera minst ett DNA och en RNA-slumpmässig sekvens som innehåller en kombination av adenin, guanin, cytosin och tiamin eller uracil. För att förbereda oligonukleotid-sonderna, snurra ner de lyophilized oligonukleotid sonderna och späd varje sond i Tris-EDTA buffert vid en 500 picomolar per mikroliter koncentration för att förhindra nukleas nedbrytning.För bakteriekultur på fast medium, rulla en enda porös glaspärla från kryogen lagring direkt på en kultur maträtt som innehåller TSA kompletteras med defibrinated fårblod att strimma ut enskilda bakteriella kolonier. Placera sedan plattan på 37 grader Celsius i 24 timmar. För bakteriekultur i flytande medium, överför en enda koloni från en fast medelkultur till 50 milliliter TSB för inkubation vid 37 grader Celsius i 24 timmar vid 200 rotationer per minut.Nästa dag, späd kulturen på en en till 500 förhållande i färska TSB och inkubera bakterierna i ytterligare 24 timmar vid 37 grader Celsius och 200 rotationer per minut i en skakande inkubator. För att ställa in en nukleas aktivitetsanalys, först förväxa en fluorometer till 37 grader Celsius och tillsätt försiktigt 96 mikroliter av steril tsb eller supernatant från en Salmonella eller E.Coli flytande medium kultur till en 1,5 milliliter nukleasfri mikrocentrifugub per sond. Tillsätt fyra mikroliter av sondarbetslösning till varje rör och använd en pipett för att noggrant blanda varje rörinnehåll tills homogena lösningar uppnås, var noga med att undvika bubblor.Därefter försiktigt ladda 95 mikroliter av varje lösning nära väggen av enskilda brunnar av en svart botten, icke-behandlad 96 väl platta, var noga med att undvika bubblor. När alla lösningar har lagts till, täck plattan och visuellt inspektera locket för pennmarkeringar eller damm som kan införa mätartefakter. För att ställa in programvaran för nukleas aktivitetsmätning, öppna ett lämpligt förvärvsprogram.Välj Läs nu i fönstret Aktivitetshanteraren och välj Nytt för att skapa det kinetiska mätprotokollet. Klicka på Ange temperatur om du vill välja 37 grader Celsius och bekräfta och spara inställningarna genom att klicka på OK. Klicka på Starta kinetik. I popup-fönstret väljer du två timmar i inmatningsrutan Körtid och två minuter i rutan för intervaling-inmatning innan du klickar på OK för att bekräfta och spara inställningarna.Klicka på Läs. I popup-fönstret väljer du Fluorescensintensitet som identifieringsmetod, Slutpunktskinetik som Lästyp och Filtrerar som optiktyp. Klicka sedan på OK. I popup-fönstret väljer du Grönt i filteruppsättningen och klickar på OK. I fönstret Procedur väljer du Använd locket och klickar på Validera.Ett popup-fönster kommer att visas som bekräftar att det skapade protokollet är giltigt. Välj Procedur under Protokoll-menyn. I fönstret Procedur definierar du de brunnar som ska mätas och ange namnet på experimentet i rutan För inmatning av filnamn.Sedan ladda plattan i plattan läsaren, var noga med att plattan är i rätt orientering och klicka på Läs nytt knappen för att börja förvärvet. För dataanalys, öppna data i lämplig analys programvara, och välj en av de uppmätta brunnarna i plattan ett fönster. Klicka på Välj brunnar och inkludera alla de uppmätta brunnarna i fönstret Brunnsval dialogruta innan du klickar på OK. Välj sedan Data i plattan ett fönster för att visualisera de tabulerade resultaten och klicka på QuickExport om du vill exportera data till ett kalkylblad.I ett kalkylblad, etikett datakolumnerna som lämpligt för varje prov och sond, och rita den relativa fluorescens enheter kontra tid för data för att generera kinetiska grafer. I detta representativa experiment, efter den första omgången av screening, rapporterade Salmonellakulturens supernatanter en tydlig preferens för RNA-sonder över DNA-sonderna. Baserat på identifiering av RNA som den föredragna nukleinsyratypen av Salmonella nukleaser, är ett nytt RNA-only-bibliotek utformat för att användas i den andra screeningomgången.Däremot visade E.Coli i kulturmedelkontroller en mycket begränsad förmåga att försämra RNA-sonder. Efter en andra omgång screening med användning av kemiskt modifierade nukleotider som syftar till att öka specificiteten hos RNA-sonderna kunde RNA pyrimidin 2'O-metyl och RNA purin 2'O-metyl identifieras på grundval av deras kemiska modifieringar som uppvisar det bäst presterande kinetiska beteendet jämfört med RNA pyrimidin 2'fluor respektive RNA-purin 2'fluoro. Dessa resultat tyder på att Salmonella har en viktig RNAs aktivitet med differential substrat kemi preferens som kan användas för att välja sonder som kan specifikt erkänna denna bakterie.Detta förfarande möjliggör val av sonder som kan identifiera nukleas aktiviteter i samband med sjukdomstillstånd, såsom cancer eller bakteriell infektion, vilket möjliggör utveckling av nya kliniska diagnostiska verktyg.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

En Polyanilin-baserad sensor av nukleinsyror

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

förberedelse och<em&gt; In Vivo</em&gt; Användning av en aktivitetsbaserad Probe för<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidas

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Uttryck och rening av Nukleasfri syre avskiljare Protocatechuat 3, 4-dioxygenas

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Uppskattning av växtbiomassa Ligninhalt med tioglykolsyra (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Bestämning av den termodynamiska och kinetiska föreningen av en DNA-aptamer och tetracyklin med användning av isotermisk titreringskalorimetri

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Identifiera G-quadruplexer i en DNA-mall med hjälp av kemisk kartläggning

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Författare i fokus: Karakterisering av DNA G-Quadruplex genom Bis-3-klorpiperidinbaserad kemisk kartläggning 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In vitro Kemisk kartläggning av G-Quadruplex DNA-strukturer med Bis-3-kloropiperidiner

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...