Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Yazarlar luiza I. Hernandez (Linköping Üniversitesi) el yazması ve değerli tavsiyeler onu dikkatli revizyon için kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Linköping Üniversitesi'nde (Fakülte Hibe SFO-Mat-LiU No. 2009-00971) Knut ve Alice Wallenberg Vakfı ve İsveç Hükümeti Malzeme Bilimi Stratejik Araştırma Alanı tarafından desteklenmiştir.

1. Oligonükleotid kütüphane tasarımı ve hazırlanması
<ol><li>Kütüphane tasarımı<ol>
<li>Aşağıdaki kriterlere göre, tüm problar için eşit uzunlukta, ikincil yapı oluşumunu önlemek için 8 ile 12-mer uzunluğunda ki söndürülen floresan oligonükleotid problardan oluşan bir kütüphane tasarlayın.<ol>
<li>Adenin (A), guanin (G), sitozin (C) ve timin (T)/urasil (U)(Tablo 1'de DNA ve RNA probları)kombinasyonunu içeren en az bir DNA ve bir RNA rasgele dizisini ekleyin. NOT: <st...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Nükleaz aktivitesindeki değişiklikler, farklı kanser türleri ve bakteriyel enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalık fenotipleri ile ilişkilendirilmiştir. Bu değişiklikler bir durumun nedensel ajan olduğu önerilmektedir14, diğer durumlarda onlar zararlı bir fizyolojik olayın sonucu iken20 veya patojenik ajan16,26. Beklendiği gibi, bir tanıbiyomarker olarak nükleaz ve nükleaz akti...

Nükleazlar, nükleik asit moleküllerinin omurga yapısını oluşturan fosfodiester bağlarını kırpabilen bir enzim sınıfıdır. Çekirdeklerin büyük çeşitliliği sınıflandırmalarını oldukça zorlaştırır. Ancak, substrat tercihi (deoksiribonükleik asit (DNA) veya ribonükleik asit (RNA)), dekolte alanı (ensonükleazlar veya eksikonklezler) veya metal iyon bağımlılığı gibi nükleazları tanımlamak için kullanılan bazı ortak kriterlervardır. Nükleazlar, hem prokaryotik hem de ökaryotik organizmalarda temel rolleri olan ve gen düzenleme araçları2olarak kullanılan ve kullanılmaya devam eden katalitik enzimlerdir. Onlar da DNA bakım ve çoğaltma temel aktörler, genom istikrarı tutmak için yardımcı ve prova okuma süreçlerine katılan3. Bakterilerde, örneğin, nükleazlar önemli virülans faktörleri olarak tespit edilmiştir, konak bağışıklık sisteminin etkinliğini azaltarak bakteri sağkalımını teşvik edebiliyoruz4,5,6,7 ,8. Memelilerde, nükleazlar apoptoz 9, mitokondriyalbiyogenez ve bakım10 ve antibakteriyel ve antiviral doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının arabuluculuk karıştığı ileri sürülmüştür11. Beklendiği gibi, nükleaz aktivitesi değişiklikleri, geliştirme veya eksikliği olsun, insan hastalıklarının geniş bir yelpazede karıştığı olmuştur. Bu hastalıklar kanserlerin geniş bir yelpazede değişir12,13 kardiyak hipertrofi10 veya otoimmün hastalıklar14. Bu nedenle, nükleazlar insan koşullarının heterojen bir grup için biyobelirteçler olarak ilginç adaylar haline gelmiştir. Aslında, nükleazlar zaten belirli bakteriyel ajanların neden olduğu enfeksiyonların tespiti için başarılı tanı araçları olarak potansiyellerini göstermiştir, Staphylococcus aureus veya Escherichia coli15gibi, 16. Birçok kanser türünde, stafilokokal nükleaz etki alanı içeren protein 1 (SND1) ribonükleaz ekspresyonu kötü prognoz un göstergesidir17. Pankreas kanseri hastalarında, yüksek ribonükleaz I (RNase I) serum düzeyleri bildirilmiştir18 ve kanserli hücrefenottipleri ile ilişkili olduğu önerilmiştir19. Iskemik kalp koşullarında, miyokard enfarktüsü veya kararsız anjina pektoris gibi, deoksiribonuklez i (DNase I) serum düzeyleri geçerli bir tanı belirteci 20 olduğu gösterilmiştir20,21.
Bu nükleaz aktivitesinin küresel planı sağlıklı ve hastalık durumlarında farklı olabilir hipotez edilmiştir. Aslında, son raporlar sağlıklı ve kanserli fenotipler22 ayırt etmek veya bir türe özgü bir şekilde patojenik bakteriyel enfeksiyonları belirlemek için nükleaz aktivitesi farklılıkları kullandık15,23. Bu bulgular, hastalığın biyobelirteçleri olarak nükleazların kullanımı için yeni bir yol açmıştır. Bu nedenle, yeni tanı araçlarının geliştirilmesinde önemli olabilecek nükleaz aktivitesindeki hastalıkla ilişkili farklılıkları sistematik olarak belirleyebilen kapsamlı bir tarama yönteminin geliştirilmesi için bir gereklilik vardır.
Burada, sağlıklı ve sağlıksız olarak nükleaz aktivitesi veya bir hücre veya bakteri türüne özgü aktivite arasında ayrım yapabilen hassas ve spesifik probları tanımlamak için yeni bir in vitro tarama yaklaşımı(Şekil 1)tanıtıyoruz ve tanımlıyoruz. Nükleik asitlerin modülerliğinden yararlanarak, kütüphane tasarımı için önemli parametreler olan, her ikisi de farklı diziler ve kimyalardan oluşan, söndürülmüş floresan oligonükleotid problardan oluşan bir başlangıç kütüphanesi tasarladık. Bu oligonükleotid problar sırasıyla 5' ve 3' uçlarda bir florofor (floresan amidit, FAM) ve bir sorgulayıcı (gelgit quencher 2, TQ2) ile çevrilidir (Tablo 1). Enzimatik bozulmanın kinetiğini ölçmek için bu floresan rezonans enerji transferi (FRET) bazlı florometrik testkullanarak, çekirdek aktivitesinin diferansiyel desenlerini ayırt etme potansiyeline sahip aday probları tanımlayabildik. sağlıklı veya hastalık durumları ile ilişkili. Yeni kütüphanelerin en iyi aday sondalarına dayalı olarak oluşturulduğu ve sonraki tarama adımlarında her zamankinden daha spesifik aday sondalarının belirlenmesine olanak tanıyan yinelemeli bir süreç tasarladık. Ayrıca bu yaklaşım, duyarlılığı artırmak için nükleazların katalitik yapısından yararlanır. Bu, muhabir sondaların aktivize edici doğasından ve çekirdeklerin alternatif antikor veya küçük molekül tabanlı tarama yöntemlerine göre önemli avantajları temsil eden substrat moleküllerini sürekli olarak işleme yeteneğinden yararlanarak elde edilir.
Bu yaklaşım, sağlıklı ve hastalık durumları arasında ayrım yapabilen spesifik nükleik asit problarının tanımlanması için son derece modüler, esnek ve uygulanması kolay bir tarama aracı ve yeni gelecekteki klinik uygulamalar için uyarlanabilen tanı araçları. Bu yaklaşım, salmonella Typhimurium'dan (burada Salmonellaolarak anılacaktır) bu bakterilerin spesifik olarak tanımlanması için elde edilen nükleaz aktivitesini tanımlamak için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokolde, kinetik analiz kullanarak bakteriyel nükleaz aktivitesini taramak için bir yöntem rapor ediyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nükleazlar, riboz şekerlerini birbirine bağlayan fosfodiester bağlarının hidrolizini katalize ederek nükleik asitleri parçalayan enzimler sınıfıdır. Nükleazlar prokaryotik ve ökaryotik organizmalarda genom stabilitesinin korunmasından patojenlere karşı koruma sağlamaya kadar çeşitli hayati fizyolojik roller sergilerler. Değiştirilmiş nükleaz aktivitesi bakteriyel enfeksiyonlar ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullar ile ilişkili olmuştur. Bu amaçla, nükleaz aktivitesi belirli bir biyomarker olarak istismar edilmesi için büyük bir potansiyel göstermiştir. Ancak, bu aktiviteye dayalı sağlam ve tekrarlanabilir bir tarama yöntemi son derece arzu edilir.
Burada, patolojik ve sağlıklı koşullar arasında ayrım kapsamı ile, substrat olarak nükleik asit probları kullanarak nükleaz aktivitesi için tarama sağlayan bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yinelemeli bir şekilde, artan özgüllük ile, yeni sonda kitaplıkları tasarlama olanağı sunar. Bu nedenle, kimyasal olarak değiştirilmiş nükleik asitlerin kullanılabilirliğinden yararlanarak, probların tasarımını gelişmiş özelliklerle hassaslaştırmak için birden fazla tarama turu gereklidir. Önerilen teknolojinin önemli potansiyeli, hastalık koşullarıyla ilişkili nükleaz aktivitesinin taranması için esnekliği, yüksek tekrarlanabilirliği ve çok yönlülüğünde yatmaktadır. Bu teknolojinin klinikte büyük bir potansiyele sahip umut verici tanı araçlarının geliştirilmesine olanak sağlaması beklenmektedir.

Şekil 1, iki tarama turuna ayrılan bu metodolojinin iş akışını göstermektedir. İlk tarama turunda 5 DNA sondası (DNA, DNA Poli A, DNA Poly T, DNA Poly C ve DNA Poly G) ve ayrıca 5 RNA probu (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C ve RNA Poly G) kullanıldı. Bu tarama turunun ham verileri Ek Tablo 1'de bulunabilir. İkinci turda, kimyasal olarak modifiye edilmiş problar, RNA dizisini kimyasal olarak değiştirilmiş nükleozitlerle (Tümü 2'-Floro ve Tüm 2'-OMt...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Değiştirilmiş nükleaz aktivitesi farklı insan koşulları ile ilişkili olmuştur, bir biyomarker olarak potansiyelinin altında yatan. Bu makalede sunulan modüler ve kolay tarama metodolojisi, hastalığın biyobelirteci olarak nükleaz aktivitesinden yararlanmak için spesifik nükleik asit problarının seçilmesine olanak sağlar.

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Bu protokol, nükleik asit probları konusunda uzmanlaşmış olmayan araştırmacılar için bile uygulanması kolay bir metodoloji ile, hastalığın biyobelirteci olarak nükleaz aktivitesinin taranması için güçlü bir alternatif sunmaktadır. Bu tekniğin en büyük avantajı, sonda-nükleaz dinamik etkileşiminden yararlanarak hem bilinen hem de bilinmeyen nükleaz aktivitelerini tanımlayabilen nükleik asit problarını seçebilme yeteneğidir. Bu metodolojinin diğer avantajları esnekliği, yüksek tekrarlanabilirliği ve kullanım kolaylığıdır.Gösteri, Ustalık öğrencisi Hatice ve laboratuvarımızdan doktora sonrası barış tarafından gerçekleştirilecek. Bir oligonükleotid kütüphane tasarlarken, en az bir DNA ve adenin, guanin, sitozin ve tiamin veya urasil bir arada içeren bir RNA rasgele dizi içerir. Oligonükleotid probları hazırlamak için, liyofilize oligonükleotid probları aşağı spin ve çekirdek bozulmasını önlemek için mikrolitre konsantrasyonu başına 500 picomolar bir Tris-EDTA tampon her prob seyreltmek.Katı ortamda bakteri kültürü için, tek bir gözenekli cam boncuk kriyojenik depolama doğrudan tsa içeren tek bir kültür çanak üzerine tek bir bakteri kolonileri dışarı çizgi defibrinated koyun kanı ile takviye rulo. Sonra 24 saat boyunca 37 santigrat derece plaka yerleştirin. Sıvı ortamda bakteri kültürü için, tek bir koloniyi katı bir orta kültürden 50 mililitre TSB'ye transfer edin ve dakikada 200 dönüşte 24 saat boyunca 37 derecede kuluçka için TSB'ye aktarın.Ertesi gün, taze TSB bir ila 500 oranında kültür seyreltmek ve bir sallayarak kuvöz de 37 santigrat derece ve dakikada 200 rotasyonek 24 saat için bakteri kuluçka. Bir nükleaz aktivitesi analizi kurmak için, ilk önceden 37 santigrat derece bir florometre Sıcak ve dikkatle steril TSB veya supernatant 96 mikrolitre bir Salmonella veya E.Coli sıvı orta kültür den bir 1.5 mililitre nükleaz içermeyen mikrocentrifuge tüp prob başına ekleyin. Her tüpe dört mikrolitre prob çalışma çözeltisi ekleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen terek homojen çözümler elde edilene kadar her tüp içeriğini iyice karıştırmak için bir pipet kullanın.Daha sonra, her çözeltinin 95 mikrolitresini siyah bir alt, arıtılmayan 96 kuyu plakasının duvarına yakın bir şekilde yükleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen din. Tüm çözümler eklendiğinde, plakayı kapatın ve kapağı ölçüm yapıtlarına neden olabilecek kalem işaretleri veya toz lar için görsel olarak inceleyin. Nükleaz aktivite ölçümü için yazılım kurmak için uygun bir edinme yazılımı programı açın.Görev Yöneticisi penceresinden Şimdi Oku'yu seçin ve kinetik ölçüm protokolünü oluşturmak için Yeni'yi seçin. 37 santigrat derece seçmek ve Tamam'ı tıklatarak ayarları onaylamak ve kaydetmek için Sıcaklığı Ayarla'yı tıklatın. Başlat Kinetik'i tıklatın. Açılan pencerede, ayarları onaylamak ve kaydetmek için Tamam'ı tıklatmadan önce Çalışma Zamanı giriş kutusunda iki saat ve aralık giriş kutusunda iki dakika seçin.Oku'ya tıklayın. Açılan pencerede, Algılama Yöntemi olarak Floresan yoğunluğunu, Okuma Türü olarak Uç Kinetik'i ve Optik Türü olarak Filtreler'i seçin. Ardından Tamam'ı tıklatın. Açılan pencerede, Filtre Kümesi'nden Yeşil'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Yordam penceresinde, Kapağı Kullan'ı seçin ve Onu Doğrula'yı tıklatın.Oluşturulan protokolün geçerli olduğunu onaylayan bir açılır pencere görüntülenir. Protokol menüsüaltında Yordam'ı seçin. Yordam penceresinde, ölçülecek kuyuları tanımlayın ve Dosya adı giriş kutusuna denemenin adını girin.Daha sonra plakayı plaka okuyucusuna yükleyin, plakanın doğru yönde olduğuna dikkat edin ve satın almaya başlamak için Yeni Oku düğmesini tıklayın. Veri analizi için, verileri uygun analiz yazılımında açın ve plaka bir penceresinde ölçülen kuyulardan birini seçin. Wells'i seç'i tıklatın ve Tamam'ı tıklatmadan önce Ölçülen kuyuların tümünü Kuyu Seçimi İletişim penceresine ekleyin. Ardından, tablolanmış sonuçları görselleştirmek için bir numaralı plakadaki Veriler'i seçin ve verileri elektronik tabloya aktarmak için QuickExport'ı tıklatın.Elektronik tabloda, veri sütunlarını her örnek ve sonda için uygun olarak etiketlendirin ve verilerin kinetik grafikler oluşturması için göreceli floresan birimlerini zamana göre çizin. Bu temsili deneyde, ilk tarama turundan sonra Salmonella kültürü süpernatants DNA sondaları üzerinde RNA probları için net bir tercih bildirdi. RNA'nın Salmonella nükleazları tarafından tercih edilen nükleik asit tipi olarak tanımlanmasına göre, taramanın ikinci turunda kullanılmak üzere yeni bir RNA kütüphanesi tasarlanmıştır.Buna karşılık, E.Coli kültür orta kontrolleri RNA probları düşürmek için çok sınırlı bir yetenek gösterdi. RNA problarının özgüllüğünü artırmayı amaçlayan kimyasal olarak modifiye edilmiş nükleotitler kullanılarak yapılan ikinci bir taramadan sonra, RNA pirimidin 2'O-metil ve RNA püre 2'O-metil, kimyasal modifikasyonları temelinde, RNA pirimidin 2'fluoro ve RNA purine 2'fluoroile ile karşılaştırıldığında en iyi performans gösteren kinetik davranışı sergiledikleri için tanımlanabilir. Bu sonuçlar Salmonella özellikle bu bakteri tanıma yeteneğine sahip probları seçmek için kullanılabilecek diferansiyel substrat kimya tercihi ile önemli bir RNaAse aktivitesi olduğunu göstermektedir.Bu prosedür, kanser veya bakteriyel enfeksiyon gibi hastalık koşullarıyla ilişkili nükleaz aktivitelerini belirleyebilen probların seçilmesini sağlayarak yeni klinik tanı araçlarının geliştirilmesine olanak sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Nükleik Asitlerin bir Polyaniline tabanlı sensör

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Tiyoglikolik Asit (TGA) Kullanılarak Bitki Biyokütle Lignin İçeriğinin Tahmini

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...