Name: kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Yazarlar luiza I. Hernandez (Linköping Üniversitesi) el yazması ve değerli tavsiyeler onu dikkatli revizyon için kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Linköping Üniversitesi'nde (Fakülte Hibe SFO-Mat-LiU No. 2009-00971) Knut ve Alice Wallenberg Vakfı ve İsveç Hükümeti Malzeme Bilimi Stratejik Araştırma Alanı tarafından desteklenmiştir.

1. Oligonükleotid kütüphane tasarımı ve hazırlanması
<ol><li>Kütüphane tasarımı<ol>
<li>Aşağıdaki kriterlere göre, tüm problar için eşit uzunlukta, ikincil yapı oluşumunu önlemek için 8 ile 12-mer uzunluğunda ki söndürülen floresan oligonükleotid problardan oluşan bir kütüphane tasarlayın.<ol>
<li>Adenin (A), guanin (G), sitozin (C) ve timin (T)/urasil (U)(Tablo 1'de DNA ve RNA probları)kombinasyonunu içeren en az bir DNA ve bir RNA rasgele dizisini ekleyin. NOT: <st...

<ol>
	<li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleases:+diversity+of+structure,+function+and+mechanism.">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).</li><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing.">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li><li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li><li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional,+surface-attached+extracellular+nuclease.">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).</li><li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity.">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes.">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, 184-190 (2010).</li><li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae.">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li><li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria.">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li><li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function.">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li><li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity:+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA.">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death &amp; Disease. 7 (11), 2458 (2016).</li><li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay.">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors.">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnases+in+health+and+disease.">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li><li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe.">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li><li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity.">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li><li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tipping+the+balance:+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis.">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li><li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease.">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li><li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li><li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction.">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li><li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction.">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li><li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer.">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li><li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes.">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques:+plating+methods.">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).</li><li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).</li><li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia.">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).</li><li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+confidence+in+high-throughput+screening.">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li><li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+overview:+selection,+features+and+applications.">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li><li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display:+concept,+innovations,+applications+and+future.">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li><li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+binding+proteins:+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities.">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li><li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Aptamers:+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing.">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li><li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics.">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li><li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+peptide+libraries:+mining+for+cell-binding+peptides.">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li></ol>

Nükleaz aktivitesindeki değişiklikler, farklı kanser türleri ve bakteriyel enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalık fenotipleri ile ilişkilendirilmiştir. Bu değişiklikler bir durumun nedensel ajan olduğu önerilmektedir14, diğer durumlarda onlar zararlı bir fizyolojik olayın sonucu iken20 veya patojenik ajan16,26. Beklendiği gibi, bir tanıbiyomarker olarak nükleaz ve nükleaz akti...

Nükleazlar, nükleik asit moleküllerinin omurga yapısını oluşturan fosfodiester bağlarını kırpabilen bir enzim sınıfıdır. Çekirdeklerin büyük çeşitliliği sınıflandırmalarını oldukça zorlaştırır. Ancak, substrat tercihi (deoksiribonükleik asit (DNA) veya ribonükleik asit (RNA)), dekolte alanı (ensonükleazlar veya eksikonklezler) veya metal iyon bağımlılığı gibi nükleazları tanımlamak için kullanılan bazı ortak kriterlervardır. Nükleazlar, hem prokaryotik hem de ökaryotik organizmalarda temel rolleri olan ve gen düzenleme araçları2olarak kullanılan ve kullanılmaya devam eden katalitik enzimlerdir. Onlar da DNA bakım ve çoğaltma temel aktörler, genom istikrarı tutmak için yardımcı ve prova okuma süreçlerine katılan3. Bakterilerde, örneğin, nükleazlar önemli virülans faktörleri olarak tespit edilmiştir, konak bağışıklık sisteminin etkinliğini azaltarak bakteri sağkalımını teşvik edebiliyoruz4,5,6,7 ,8. Memelilerde, nükleazlar apoptoz 9, mitokondriyalbiyogenez ve bakım10 ve antibakteriyel ve antiviral doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının arabuluculuk karıştığı ileri sürülmüştür11. Beklendiği gibi, nükleaz aktivitesi değişiklikleri, geliştirme veya eksikliği olsun, insan hastalıklarının geniş bir yelpazede karıştığı olmuştur. Bu hastalıklar kanserlerin geniş bir yelpazede değişir12,13 kardiyak hipertrofi10 veya otoimmün hastalıklar14. Bu nedenle, nükleazlar insan koşullarının heterojen bir grup için biyobelirteçler olarak ilginç adaylar haline gelmiştir. Aslında, nükleazlar zaten belirli bakteriyel ajanların neden olduğu enfeksiyonların tespiti için başarılı tanı araçları olarak potansiyellerini göstermiştir, Staphylococcus aureus veya Escherichia coli15gibi, 16. Birçok kanser türünde, stafilokokal nükleaz etki alanı içeren protein 1 (SND1) ribonükleaz ekspresyonu kötü prognoz un göstergesidir17. Pankreas kanseri hastalarında, yüksek ribonükleaz I (RNase I) serum düzeyleri bildirilmiştir18 ve kanserli hücrefenottipleri ile ilişkili olduğu önerilmiştir19. Iskemik kalp koşullarında, miyokard enfarktüsü veya kararsız anjina pektoris gibi, deoksiribonuklez i (DNase I) serum düzeyleri geçerli bir tanı belirteci 20 olduğu gösterilmiştir20,21.
Bu nükleaz aktivitesinin küresel planı sağlıklı ve hastalık durumlarında farklı olabilir hipotez edilmiştir. Aslında, son raporlar sağlıklı ve kanserli fenotipler22 ayırt etmek veya bir türe özgü bir şekilde patojenik bakteriyel enfeksiyonları belirlemek için nükleaz aktivitesi farklılıkları kullandık15,23. Bu bulgular, hastalığın biyobelirteçleri olarak nükleazların kullanımı için yeni bir yol açmıştır. Bu nedenle, yeni tanı araçlarının geliştirilmesinde önemli olabilecek nükleaz aktivitesindeki hastalıkla ilişkili farklılıkları sistematik olarak belirleyebilen kapsamlı bir tarama yönteminin geliştirilmesi için bir gereklilik vardır.
Burada, sağlıklı ve sağlıksız olarak nükleaz aktivitesi veya bir hücre veya bakteri türüne özgü aktivite arasında ayrım yapabilen hassas ve spesifik probları tanımlamak için yeni bir in vitro tarama yaklaşımı(Şekil 1)tanıtıyoruz ve tanımlıyoruz. Nükleik asitlerin modülerliğinden yararlanarak, kütüphane tasarımı için önemli parametreler olan, her ikisi de farklı diziler ve kimyalardan oluşan, söndürülmüş floresan oligonükleotid problardan oluşan bir başlangıç kütüphanesi tasarladık. Bu oligonükleotid problar sırasıyla 5' ve 3' uçlarda bir florofor (floresan amidit, FAM) ve bir sorgulayıcı (gelgit quencher 2, TQ2) ile çevrilidir (Tablo 1). Enzimatik bozulmanın kinetiğini ölçmek için bu floresan rezonans enerji transferi (FRET) bazlı florometrik testkullanarak, çekirdek aktivitesinin diferansiyel desenlerini ayırt etme potansiyeline sahip aday probları tanımlayabildik. sağlıklı veya hastalık durumları ile ilişkili. Yeni kütüphanelerin en iyi aday sondalarına dayalı olarak oluşturulduğu ve sonraki tarama adımlarında her zamankinden daha spesifik aday sondalarının belirlenmesine olanak tanıyan yinelemeli bir süreç tasarladık. Ayrıca bu yaklaşım, duyarlılığı artırmak için nükleazların katalitik yapısından yararlanır. Bu, muhabir sondaların aktivize edici doğasından ve çekirdeklerin alternatif antikor veya küçük molekül tabanlı tarama yöntemlerine göre önemli avantajları temsil eden substrat moleküllerini sürekli olarak işleme yeteneğinden yararlanarak elde edilir.
Bu yaklaşım, sağlıklı ve hastalık durumları arasında ayrım yapabilen spesifik nükleik asit problarının tanımlanması için son derece modüler, esnek ve uygulanması kolay bir tarama aracı ve yeni gelecekteki klinik uygulamalar için uyarlanabilen tanı araçları. Bu yaklaşım, salmonella Typhimurium'dan (burada Salmonellaolarak anılacaktır) bu bakterilerin spesifik olarak tanımlanması için elde edilen nükleaz aktivitesini tanımlamak için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokolde, kinetik analiz kullanarak bakteriyel nükleaz aktivitesini taramak için bir yöntem rapor ediyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:759px;" width="759">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Black bottom, non-treated 96 well plate</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10000631</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Cytation1</td>
			<td style="width:199px;">BioTek</td>
			<td style="width:128px;">CYT1FAV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td style="width:128px;">11926955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">25922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Microbank cryogenic storage vial containing beads</td>
			<td style="width:199px;">Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td style="width:128px;">22-286-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Nucleic acid probes</td>
			<td style="width:199px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:128px;">#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2</td>
			<td style="width:199px;">Gibco&#8482;</td>
			<td style="width:128px;">14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Salmonella enterica subs. Enterica</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:128px;">14028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Tris-EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10647633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">10362223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:344px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">22092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic screening of nuclease activity using nucleic acid probes

Nükleazlar, riboz şekerlerini birbirine bağlayan fosfodiester bağlarının hidrolizini katalize ederek nükleik asitleri parçalayan enzimler sınıfıdır. Nükleazlar prokaryotik ve ökaryotik organizmalarda genom stabilitesinin korunmasından patojenlere karşı koruma sağlamaya kadar çeşitli hayati fizyolojik roller sergilerler. Değiştirilmiş nükleaz aktivitesi bakteriyel enfeksiyonlar ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullar ile ilişkili olmuştur. Bu amaçla, nükleaz aktivitesi belirli bir biyomarker olarak istismar edilmesi için büyük bir potansiyel göstermiştir. Ancak, bu aktiviteye dayalı sağlam ve tekrarlanabilir bir tarama yöntemi son derece arzu edilir.
Burada, patolojik ve sağlıklı koşullar arasında ayrım kapsamı ile, substrat olarak nükleik asit probları kullanarak nükleaz aktivitesi için tarama sağlayan bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yinelemeli bir şekilde, artan özgüllük ile, yeni sonda kitaplıkları tasarlama olanağı sunar. Bu nedenle, kimyasal olarak değiştirilmiş nükleik asitlerin kullanılabilirliğinden yararlanarak, probların tasarımını gelişmiş özelliklerle hassaslaştırmak için birden fazla tarama turu gereklidir. Önerilen teknolojinin önemli potansiyeli, hastalık koşullarıyla ilişkili nükleaz aktivitesinin taranması için esnekliği, yüksek tekrarlanabilirliği ve çok yönlülüğünde yatmaktadır. Bu teknolojinin klinikte büyük bir potansiyele sahip umut verici tanı araçlarının geliştirilmesine olanak sağlaması beklenmektedir.

Şekil 1, iki tarama turuna ayrılan bu metodolojinin iş akışını göstermektedir. İlk tarama turunda 5 DNA sondası (DNA, DNA Poli A, DNA Poly T, DNA Poly C ve DNA Poly G) ve ayrıca 5 RNA probu (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C ve RNA Poly G) kullanıldı. Bu tarama turunun ham verileri Ek Tablo 1'de bulunabilir. İkinci turda, kimyasal olarak modifiye edilmiş problar, RNA dizisini kimyasal olarak değiştirilmiş nükleozitlerle (Tümü 2'-Floro ve Tüm 2'-OMt...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes at JoVE.com

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Değiştirilmiş nükleaz aktivitesi farklı insan koşulları ile ilişkili olmuştur, bir biyomarker olarak potansiyelinin altında yatan. Bu makalede sunulan modüler ve kolay tarama metodolojisi, hastalığın biyobelirteci olarak nükleaz aktivitesinden yararlanmak için spesifik nükleik asit problarının seçilmesine olanak sağlar.

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Bu protokol, nükleik asit probları konusunda uzmanlaşmış olmayan araştırmacılar için bile uygulanması kolay bir metodoloji ile, hastalığın biyobelirteci olarak nükleaz aktivitesinin taranması için güçlü bir alternatif sunmaktadır. Bu tekniğin en büyük avantajı, sonda-nükleaz dinamik etkileşiminden yararlanarak hem bilinen hem de bilinmeyen nükleaz aktivitelerini tanımlayabilen nükleik asit problarını seçebilme yeteneğidir. Bu metodolojinin diğer avantajları esnekliği, yüksek tekrarlanabilirliği ve kullanım kolaylığıdır.Gösteri, Ustalık öğrencisi Hatice ve laboratuvarımızdan doktora sonrası barış tarafından gerçekleştirilecek. Bir oligonükleotid kütüphane tasarlarken, en az bir DNA ve adenin, guanin, sitozin ve tiamin veya urasil bir arada içeren bir RNA rasgele dizi içerir. Oligonükleotid probları hazırlamak için, liyofilize oligonükleotid probları aşağı spin ve çekirdek bozulmasını önlemek için mikrolitre konsantrasyonu başına 500 picomolar bir Tris-EDTA tampon her prob seyreltmek.Katı ortamda bakteri kültürü için, tek bir gözenekli cam boncuk kriyojenik depolama doğrudan tsa içeren tek bir kültür çanak üzerine tek bir bakteri kolonileri dışarı çizgi defibrinated koyun kanı ile takviye rulo. Sonra 24 saat boyunca 37 santigrat derece plaka yerleştirin. Sıvı ortamda bakteri kültürü için, tek bir koloniyi katı bir orta kültürden 50 mililitre TSB'ye transfer edin ve dakikada 200 dönüşte 24 saat boyunca 37 derecede kuluçka için TSB'ye aktarın.Ertesi gün, taze TSB bir ila 500 oranında kültür seyreltmek ve bir sallayarak kuvöz de 37 santigrat derece ve dakikada 200 rotasyonek 24 saat için bakteri kuluçka. Bir nükleaz aktivitesi analizi kurmak için, ilk önceden 37 santigrat derece bir florometre Sıcak ve dikkatle steril TSB veya supernatant 96 mikrolitre bir Salmonella veya E.Coli sıvı orta kültür den bir 1.5 mililitre nükleaz içermeyen mikrocentrifuge tüp prob başına ekleyin. Her tüpe dört mikrolitre prob çalışma çözeltisi ekleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen terek homojen çözümler elde edilene kadar her tüp içeriğini iyice karıştırmak için bir pipet kullanın.Daha sonra, her çözeltinin 95 mikrolitresini siyah bir alt, arıtılmayan 96 kuyu plakasının duvarına yakın bir şekilde yükleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen din. Tüm çözümler eklendiğinde, plakayı kapatın ve kapağı ölçüm yapıtlarına neden olabilecek kalem işaretleri veya toz lar için görsel olarak inceleyin. Nükleaz aktivite ölçümü için yazılım kurmak için uygun bir edinme yazılımı programı açın.Görev Yöneticisi penceresinden Şimdi Oku'yu seçin ve kinetik ölçüm protokolünü oluşturmak için Yeni'yi seçin. 37 santigrat derece seçmek ve Tamam'ı tıklatarak ayarları onaylamak ve kaydetmek için Sıcaklığı Ayarla'yı tıklatın. Başlat Kinetik'i tıklatın. Açılan pencerede, ayarları onaylamak ve kaydetmek için Tamam'ı tıklatmadan önce Çalışma Zamanı giriş kutusunda iki saat ve aralık giriş kutusunda iki dakika seçin.Oku'ya tıklayın. Açılan pencerede, Algılama Yöntemi olarak Floresan yoğunluğunu, Okuma Türü olarak Uç Kinetik'i ve Optik Türü olarak Filtreler'i seçin. Ardından Tamam'ı tıklatın. Açılan pencerede, Filtre Kümesi'nden Yeşil'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Yordam penceresinde, Kapağı Kullan'ı seçin ve Onu Doğrula'yı tıklatın.Oluşturulan protokolün geçerli olduğunu onaylayan bir açılır pencere görüntülenir. Protokol menüsüaltında Yordam'ı seçin. Yordam penceresinde, ölçülecek kuyuları tanımlayın ve Dosya adı giriş kutusuna denemenin adını girin.Daha sonra plakayı plaka okuyucusuna yükleyin, plakanın doğru yönde olduğuna dikkat edin ve satın almaya başlamak için Yeni Oku düğmesini tıklayın. Veri analizi için, verileri uygun analiz yazılımında açın ve plaka bir penceresinde ölçülen kuyulardan birini seçin. Wells'i seç'i tıklatın ve Tamam'ı tıklatmadan önce Ölçülen kuyuların tümünü Kuyu Seçimi İletişim penceresine ekleyin. Ardından, tablolanmış sonuçları görselleştirmek için bir numaralı plakadaki Veriler'i seçin ve verileri elektronik tabloya aktarmak için QuickExport'ı tıklatın.Elektronik tabloda, veri sütunlarını her örnek ve sonda için uygun olarak etiketlendirin ve verilerin kinetik grafikler oluşturması için göreceli floresan birimlerini zamana göre çizin. Bu temsili deneyde, ilk tarama turundan sonra Salmonella kültürü süpernatants DNA sondaları üzerinde RNA probları için net bir tercih bildirdi. RNA'nın Salmonella nükleazları tarafından tercih edilen nükleik asit tipi olarak tanımlanmasına göre, taramanın ikinci turunda kullanılmak üzere yeni bir RNA kütüphanesi tasarlanmıştır.Buna karşılık, E.Coli kültür orta kontrolleri RNA probları düşürmek için çok sınırlı bir yetenek gösterdi. RNA problarının özgüllüğünü artırmayı amaçlayan kimyasal olarak modifiye edilmiş nükleotitler kullanılarak yapılan ikinci bir taramadan sonra, RNA pirimidin 2'O-metil ve RNA püre 2'O-metil, kimyasal modifikasyonları temelinde, RNA pirimidin 2'fluoro ve RNA purine 2'fluoroile ile karşılaştırıldığında en iyi performans gösteren kinetik davranışı sergiledikleri için tanımlanabilir. Bu sonuçlar Salmonella özellikle bu bakteri tanıma yeteneğine sahip probları seçmek için kullanılabilecek diferansiyel substrat kimya tercihi ile önemli bir RNaAse aktivitesi olduğunu göstermektedir.Bu prosedür, kanser veya bakteriyel enfeksiyon gibi hastalık koşullarıyla ilişkili nükleaz aktivitelerini belirleyebilen probların seçilmesini sağlayarak yeni klinik tanı araçlarının geliştirilmesine olanak sağlar.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Nükleik Asitlerin bir Polyaniline tabanlı sensör

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Biyokimya

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls and is an aromatic heteropolymer primarily composed of three monolignols with significant industrial importance. Lignin plays an important role in plant growth and development, protects&#160;from biotic and abiotic stresses, and in the quality of animal fodder, the wood, and industrial lignin products. Accurate estimation of lignin content is essential for both fundamental understanding of the lignin biosynthesis and industrial applications of biomass. The thioglycolic acid (TGA) method is a highly reliable method of estimating the total lignin content in the plant biomass. This method estimates the lignin content by forming thioethers with the benzyl alcohol groups of lignin, which are soluble in alkaline conditions and insoluble in acidic conditions. The total lignin content is estimated using a standard curve generated from commercial bamboo lignin.

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Here, we present a modified TGA method for estimation of lignin content in herbaceous plant biomass. This method estimates the lignin content by forming specific thioether bonds with lignin and presents an advantage over the Klason method, as it requires a relatively small sample for lignin content estimation.

Tiyoglikolik Asit (TGA) Kullanılarak Bitki Biyokütle Lignin İçeriğinin Tahmini

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Kimyasal Haritalama Kullanarak Bir DNA Şablonundaki G-Dörtlülerini Tanımlama

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Yazar Spot Işığı: Bis-3-Kloropiperidin Bazlı Kimyasal Haritalama ile DNA G-Quadruplex'in Karakterize Edilmesi 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...