Name: characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles at JoVE.com

Ondersteuning voor dit project kwam van de BGSU Graduate College, en de BGSU Office van gesponsorde Programma's en onderzoek.

1. generatie van de E. coli Double knock out mutant met P1 transduction
<ol><li>Verkrijg de e. coli single-Knockout Mutante stammen δpote en δcadb van het genetische voorraad centrum e. coli (<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">http://cgsc.Biology.Yale.edu</a>). Opmerking: De stam Δpote is kanamycine bestendig26 en de spanning δcadb is tetracycline resistent27.</li>
	...

<ol>
	<li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins.">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li><li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li><li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUC1+and+SUC2:+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana;+expression+and+characterization+in+baker's+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein.">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li><li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development:+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds.">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li><li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance,+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis.">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li><li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cells+are+not+just+green+yeast.">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li><li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+dynamics+of+aggresome+formation+by+a+cytosolic+GFP-chimera.">Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera.</a> Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).</li><li>Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter,+Ctr1p,+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase.">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+inward-rectifying+potassium+channel+by+the+Arabidopsis+KAT1+cDNA.">Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA.</a> Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).</li><li>Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+plant+plasma+membrane+transporter+in+Xenopus+oocytes.">Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes.</a> FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).</li><li>Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+LjSUT4,+a+vacuolar+sucrose+transporter+from+Lotus+japonicus.">Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).</li><li>Kovermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+vacuolar+malate+channel+is+a+member+of+the+ALMT+family.">The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family.</a> The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).</li><li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli.">Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).</li><li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+membrane+proteins:+choosing+the+appropriate+host.">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).</li><li>Takabatake, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cDNAs+encoding+mitochondrial+phosphate+transporters+in+soybean,+maize,+rice,+and+Arabidopis.">Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis.</a> Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).</li><li>Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+transporter+for+dicarboxylates+and+tricarboxylates+in+plant+mitochondria.+Bacterial+expression,+reconstitution,+functional+characterization,+and+tissue+distribution.">Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li><li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tonoplast+Glu/Asp/GABA+exchanger+that+affects+tomato+fruit+amino+acid+composition.">A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition.</a> The Plant Journal. 81 (5), (2015).</li><li>Kashiwagi, K., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+assays+of+polyamine+transport+systems+in+Escherichia+coli+and+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).</li><li>Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+of+putrescine+by+the+putrescine-ornithine+antiporter+encoded+by+the+potE+gene+of+Escherichia+coli.">Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).</li><li>Tsuchiya, T., Rosen, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transport+driven+by+a+proton+gradient+and+inverted+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli.">Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+analysis+of+Tn10+insertion+sites+in+a+collection+of+Escherichia+coli+strains+used+for+genetic+mapping+and+strain+construction.">Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).</li><li>. P1vir phage transduction Available from: <a target="_blank" href="https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction">https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction</a> (2011)</li><li>. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016</a> (2010)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+biochinic+acid.">Measurement of protein using biochinic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Wright, J. K., Overath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+lactose:+H++carrier+of+Escherichia+coli+and+characterization+of+galactoside+binding+and+transport.">Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport.</a> European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).</li><li>. GaphPad Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/">https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/</a> (2019)</li><li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+(ZmBT1)+from+Zea+mays.">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li><li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+chloroplast+ATP/ADP+transporter+in+E.+coli+membranes:+behind+the+Mistic+strategy.">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li><li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H+-Translocating+ATPases:+Advances+Using+Membrane+Vesicles.">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li><li>Bush, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-coupled+sugar+and+amino+acid+transporters+in+plants.">Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants.</a> Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).</li><li>Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+membrane+vesicle+from+Escherichea+coli+prepared+by+different+procedures.">Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures.</a> Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).</li><li>Seckler, R., Wright, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose:+H++carrier.">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li><li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes.">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli.">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li></ol>

In de huidige studie schetsen we een methode voor de karakterisering van een antiporter door eerst het eiwit in E. coli uit te drukken en vervolgens membraan blaasjes te genereren, zodat het heterologously uitgedrukte eiwit kan worden getest in een cel-vrij systeem. Naast de apparatuur die in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie wordt aangetroffen, vereist deze strategie het gebruik van een Franse pers, een ultracentrifuge, en toegang tot een faciliteit voor het uitvoeren van radio-isotopen testen.</p...

Eiwitten die betrokken zijn bij de handel in metabolieten vormen een essentieel niveau van fysiologische regulering, maar de overgrote meerderheid van de planten membraan vervoerders is nog niet functioneel gekenmerkt. Er zijn verschillende strategieën geïmplementeerd om nieuwe transporteiwitten te karakteriseren. Heterologeuze expressie in model organismen zoals E. coli en eukaryote cellen zoals gist, Xenopus oocyten, zoogdiercellen, insecten cellen en plantencellen zijn allemaal gebruikt om hun transportactiviteit te bepalen1. Eukaryote cellen zijn begunstigd voor de uitdrukking van eukaryotische eiwitten, omdat de basis cellulaire samenstelling, signaal transducing trajecten, transcriptie-en vertaal machines compatibel zijn met de inheemse omstandigheden.
Gist is een belangrijk modelorganisme voor de karakterisering van nieuwe transporteiwitten in planten. Het eerste plantaardige transporteiwit dat met succes werd uitgedrukt in gist (Saccharomyces pombe) was de van transporter HUP1 van Chlorella2. Sindsdien zijn veel planten transporteiwitten functioneel gekarakteriseerd met behulp van een gist uitdrukkings systeem. Deze omvatten, plantaardige suiker transporters (SUC1 en SUC23, VfSUT1 en VfSTP14) en de AUXIN SURGERY TRANSPORTERS (AUX1 en pin5). Nadelen van het gebruik van gist om plantaardige eiwitten te uiten kunnen een verminderde activiteit van Plastide-gelokaliseerde eiwitten omvatten, omdat gist deze organel mist, mistargeting6, en de vorming van misgevouwen aggregaten en activering van stress reacties in gist als gevolg van overexpressie van membraan eiwitten7,8,9.
Heterologeuze expressie van transporteiwitten in Xenopus -oocyten is op grote schaal gebruikt voor de elektrofysiologische karakterisering van transporters10. De eerste plantaardige transporteiwitten die worden gekenmerkt door heterologeuze expressie in Xenopus -eicellen waren het Arabidopsis kalium kanaal KAT110 en de Arabidopsis van transporter STP111. Sindsdien worden Xenopus -oocyten gebruikt om veel plantaardige transporteiwitten te karakteriseren, zoals plasma membraan transporters12, vacuole sucrose Transporter SUT413 en vacuole malaat Transporter ALMT914. Een belangrijke beperking van Xenopus -eicellen voor transport testen is dat de concentratie van intracellulaire metabolieten niet kan worden gemanipuleerd1. Bovendien is professionele kennis vereist om Xenopus -eicellen voor te bereiden en de variabiliteit van de oöcyten batches is moeilijk te beheersen.
Heterologeuze expressie in het modelorganisme E. coli is een ideaal systeem in termen van de karakterisering van nieuwe plantaardige transporteiwitten. Met een volledig gesequentieerde genoom15zijn de moleculaire en fysiologische kenmerken van E. coli bekend. Moleculaire gereedschappen en technieken zijn goed vastgesteld16. Daarnaast zijn er verschillende expressie vectoren, niet-pathogene stammen en mutanten beschikbaar17,18,19. Bovendien, E. coli heeft een hoge groeisnelheid en kan gemakkelijk worden geteeld onder laboratoriumomstandigheden. Veel eiwitten kunnen gemakkelijk worden uitgedrukt en gezuiverd in hoge hoeveelheden in E. coli9. Wanneer eiwitten niet direct in cellulaire systemen kunnen worden getest, is reconstitutie van eiwitten in liposomen ook een succesvolle, zij het uitdagende innovatie voor de karakterisering van gezuiverde membraan eiwitten. Functionele karakterisering van de plant mitochondriale transporteiwitten met inbegrip van opgeloste transporters zoals fosfaat transporteurs in soja, maïs, rijst en Arabidopsis, dicarboxylaat-tricarboxylaatdrager in Arabidopsis zijn bereikt met behulp van dit modelsysteem20,21. Echter, recombinante eiwitten van de tomaten proteïne SICAT9 bleken niet functioneel te zijn in reconstitutie experimenten, en andere leden van de CAT Transporter familie bleken niet functioneel te zijn in Xenopus oöcyt assays22. Er zijn dus extra moleculaire gereedschappen nodig voor de karakterisering van membraan transporteurs.
Vijf polyamine transportsystemen zijn te vinden in E. coli23. Ze omvatten twee ABC-transporters die de opname van spermidinerijk en putrestsin, een putrestsin/Ornithine-wisselaar, een cadaverine/lysine-wisselaar, een spermidinerijk-exporteur en een importeur van putrestsin bemiddelen. De putrestsin wisselaar Pote werd oorspronkelijk gekarakteriseerd met behulp van een blaasje Assay, waarbij binnenstevoren blaasjes werden bereid door lyserende cellen met een Franse pers en het meten van de opname van van putrestsin in de blaasjes in ruil voor Ornithine24. Vesicle assays werden ook gebruikt om een calcium transporter te karakteriseren, die het transport van calcium in reactie op een proton gradiënt25bemiddelde. Deze experimenten hebben ons ertoe aangezet een strategie te ontwikkelen voor de karakterisering van andere polyamine wissel wisselaars. We eerst creëerde een stam van E. coli tekort in Pote en CADB wissel wisselaars. Hier demonstreren we de functionele karakterisering van een plantaardige polyamine antiporter door heterlogous expressie in de gemodificeerde E. coli stam, generatie van membraan blaasjes met behulp van een Franse pers, en van assays.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-putrescine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET185001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-spermidine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET522001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C arginine</td>
			<td>Moravek Inc.</td>
			<td>MC137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His (C-term)-HRP antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R931-25</td>
			<td>Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl 
			group for detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Pierce BCA protein asay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxypeptidase B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9584-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td>SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>LabGenome</td>
			<td>7777-7</td>
			<td>Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint-H</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS275</td>
			<td>scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration manifold</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>FH225V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>FA-080A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>KROGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>hawp02500</td>
			<td>0.45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up kit</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>QuickClean II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putrescine</td>
			<td>fluka</td>
			<td>32810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains :E. coli &#916;potE740(del)::kan, &#916;cadB2231::Tn10</td>
			<td>This manuscript</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td>Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Research Products</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall MTX 150</td>
			<td>46960</td>
			<td>Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>45237</td>
			<td>Centrifuge tubes for S150-AT rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector: pBAD-DEST49</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Gateway expression vector for E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om nieuwe membraan transporteurs functioneel te karakteriseren. Polyamines zijn alomtegenwoordig in alle organismen, maar polyamine-wisselaars in planten zijn niet geïdentificeerd. Hier schetsen we een methode om polyamine-antiporters te karakteriseren met behulp van membraan blaasjes gegenereerd uit de lysis van Escherichia coli cellen die heterologously een plant antiporter uitdrukken. Eerste, we heterologously uitgedrukt AtBAT1 in een E. coli stam tekort aan polyamine en arginine Exchange transporters. Blaasjes werden geproduceerd met behulp van een Franse pers, gezuiverd door ultracentrifugatie en gebruikt in een membraanfiltratie test van gelabelde substraten om de substraat specificiteit van de transporter aan te tonen. Deze assays aangetoond dat AtBAT1 is een proton-gemedieerde transporter van arginine, γ-aminoboterzuur (GABA), putrestsin en spermidine. De Mutante stam die werd ontwikkeld voor de bepaling van AtBAT1 kan nuttig zijn voor de functionele analyse van andere families van plantaardige en dierlijke polyamine wissel wisselaars. We veronderstellen ook dat deze aanpak kan worden gebruikt om te karakteriseren vele andere soorten anti porters, zolang deze eiwitten kunnen worden uitgedrukt in de bacteriële celmembraan. E. coli is een goed systeem voor de karakterisering van nieuwe transporteurs, omdat er meerdere methoden zijn die kunnen worden gebruikt om inheemse vervoerders te mutageen.

De belangrijkste stappen in dit protocol worden op pictoriaal samengevat in Figuur 1. Kort, E. coli cellen gebrekkig in alle polyamine wisselaars en uitdrukken van AtBAT1 worden gekweekt, gecentrifugeerd, gewassen met een buffer en onderworpen aan cel lysis met behulp van een Franse pers. Lysis heeft de neiging om blaasjes te produceren die meestal binnenstebuiten zijn en de buffer buiten de cellen overvullen. Celpuin wordt verwijderd door c...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles at JoVE.com

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We beschrijven een methode voor de karakterisering van protonen-gedreven membraan transporteurs in membraan vesikel preparaten geproduceerd door heterologeuze expressie in E. coli en Lysis van cellen met behulp van een Franse pers.

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek voor het karakteriseren van membraantransporters is dat u de relatieve affiniteit van de transporter voor specifieke substraten bepalen en inzicht krijgt in het transportmechanisme. De karakterisering van membraaneiwitten die eiwitgradiënten gebruiken om substraattransport te stimuleren, is bijzonder geschikt voor deze binnenste vesicletest die we hier laten zien. Hoewel deze test vereist een aantal gespecialiseerde apparatuur, zoals een Franse pers en toegang tot een ultracentrifuge, we denken dat het technisch gemakkelijker dan testen die membraan transporters vereisen worden gereconstrueerd in kunstmatige liposomen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de relatieve affiniteiten voor verschillende substraten te kwantificeren en concurrentietesten te doen om het effect van concurrerende substraten op transportroosters te testen. In het geval van de BAT1 transporter die werd gebruikt om deze test te illustreren, konden we ook substraatactivering van de transporter door arginine laten zien. Om te beginnen met deze procedure, cultuur de voorbereide E.coli mutant cellen die het doel eiwit uit te drukken door het inenten van een enkele kolonie in vijf milliliter polyamine 3 media met de juiste antibiotica en groeien het 's nachts op 37 graden Celsius.De volgende dag, breng deze cultuur naar 500 milliliter verse polyamine 3 media die wordt aangevuld met 0,0002%arabinose en groeien tot de celcultuur een OD600 van tussen 0,6 en 0,8 bereikt. Na deze, centrifugeren op 2000 keer G en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten om de cel pellet te verzamelen. Schort de pellet opnieuw op en was deze drie keer met buffer één door telkens op 2000 g en telkens 15 minuten op vier graden Celsius te centen.Het uiteindelijke volume van cellen in Buffer een na de derde spin moet 10 milliliter. Stel een 35 milliliter Franse drukcel en giet de cel suspensie in het lichaam van de cel. Zet de machine aan met de schakelaar op de RHS aan de achterkant van het apparaat en stel de verhoudingskiezerschakelaar in op hoog.Zet de pompschakelaar aan. De zuiger zal beginnen te stijgen van de basis om de lucht te verplaatsen in de kamer. Verhoog de druk door de drukverhogingsklep met de klok mee te draaien tot de meter 640 PSI bereikt.Dit zal leiden tot een interne druk van 10.000 PSI. Zodra de cel de doeldruk heeft bereikt, opent u de montage van de stroomklep iets door deze tegen de klok in te draaien. Pas de opening van de klep aan om een stroomsnelheid van slechts ongeveer 10 druppels per minuut mogelijk te maken.Wanneer de stoplijn op het zuigerlichaam de bovenkant van de stroomcel bereikt, schakelt u de pomp uit. Verlaag de onderste plaat door het plaatsen van de verhouding selector schakelaar naar beneden, en vervolgens, het instellen van de pomp schakelaar op. Wanneer de bodemplaat volledig is ingetrokken, verlaagt u de systeemdruk tot nul door de drukverhogingsklep volledig tegen de klok in te draaien.Schakel de pomp uit en zet de machine uit. Centrifuge de Franse pers eluant op 10.000 keer G en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten om ongebroken cellen en celpuin te verwijderen. Gooi de pellet weg en breng de supernatant over op ultracentrifugebuizen.Ultracentrifuge de resulterende supernatant op 150.000 keer G en op vier graden Celsius gedurende een uur om de membraanvegels te pelleteren. Was de membraanveikels eenmaal zonder hersuspensie in buffer twee. Gebruik vervolgens een Dounce-weefselmolen om de membraanveikels opnieuw op te schorten in buffer twee.Bereid 100 microliter aliquots van de membraanpreparaten in 1,5 milliliter centrifugebuizen en bewaar ze bij min-80 Celsius. Eerst de vesicles wassen en opnieuw ophangen in 30 millimolar Tris bij pH 7.8, dat 0,1 millimolar kobalt II chloride bevat. Voeg een microliter van carboxypeptidase A in natriumchloride, Tris, en kobalt II chloride aan elk 100 microliter monster.Incubeer bij 20 graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg vijf microliter van een oplossing toe die natriumedta en 2-Mercaptoethanol bij PH 7.5 bevat om de spijsvertering te stoppen. Broed de oplossing een uur lang bij kamertemperatuur om het enzym volledig te inactiveren.Voeg vervolgens tussen de vijf en 10 microliter van een oplossing toe die lithium dodecylsulfaat, glycerol, bromofenolblauw en Tris bij pH 7,5 tot 100 microliter van het monster bevat en analyseer monsters door elektroforese. Om amino blotting uit te voeren, leg een nitrocellulosefilter bevochtigd met 25 millimolar natriumwaterstoffosfaat op de polyacrylamidegel. Plaats deze tussen twee bevochtigde cellulosefilters en tot slot tussen twee bevochtigde plastic schuursponsjes.Plaats deze assemblage tussen de elektroden van een kamer met 25 millimolar natriumwaterstoffosfaat bij een temperatuur tussen de twee en vier graden Celsius. Elektrotransfer van de eiwitten op 20 volt en op twee tot drie ampère gedurende drie uur. Blokkeer het nitrocellulosemembraan in het blokkeren van buffer 's nachts op twee graden Celsius.De volgende dag, incubeer de nitrocellulose op 20 milliliter van een tot 5, 000 verdunning van Anti-His C-terminal HRP antilichaam en blokkeren buffer gedurende twee uur en wassen twee keer met 50 milliliter buffer gedurende een totaal van 60 minuten. Om de aminovlek te visualiseren, los zes milligram 4-Chloro-1-naphthol op in 20 milliliter gedenatureerde alcohol en voeg 80 milliliter van 15 millimolar Tris en 50 microliter van 30% waterstofperoxide toe. Baad het filterpapier in deze substraatoplossing gedurende 20 minuten.Als er voldoende kleur is ontwikkeld, spoel het membraan met water en laat het drogen. Om te beginnen, incubeer de 100 microliter aliquot van membraan vesikels op 12 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg buffer 3 met radioactief gelabelde polyamines met een uiteindelijke concentratie van 50 micromolar toe aan de membraanveikjes in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen om transport te starten.Voer de transporttest uit bij 12 graden Celsius gedurende een minuut. Breng hierna de reactiemengsels over naar het filterspruitstuk en filtreer deze door een 0,45 micrometer nitrocellulosemembraanfilter. Voeg drie milliliter ijskoude testbuffer toe met een tienvoudige hogere concentratie niet-gelabelde polyamines, gevolgd door drie milliliter testbuffer zonder de polyamines om niet-specifieke binding te verminderen.Breng de gewassen filters naar 20 milliliter wegwerp scintillation flacons met 10 milliliter scintillatie vloeistof, en gebruik een vloeibare scintillatie teller om de radioactiviteit te bepalen. Bereken de netto polyamineopname zoals beschreven in het tekstprotocol. Bepaal de km voor het substraat door de opname van radioactief gelabeld substraat te meten in vesicles die het doeleiwit uitdrukken en bereken de Michaelis-Menten kinetiek met behulp van een niet-lineaire regressiemethode.Voeg voor de wedstrijdexperimenten het niet-gelabelde concurrerende substraat dat in de testbuffer is gemaakt, toe aan de centrifugebuis met 100 microliter vesicles bij 12 graden Celsius en voeg tegelijkertijd 50 micromolar van de radioactief gelabelde polyamine toe. Meet de radioactiviteit gevangen in vesicles zoals eerder beschreven. Bepaal een ouder-KM voor de concurrerende substraten door de opname van radioactief gelabelde polyamines en de aanwezigheid van 100 micromoer of hoger niet-gelabeld substraat te meten en gebruik een niet-lineaire regressiemethode om de curve in kaart te brengen.In deze studie wordt een anti-porter gekenmerkt door eerst het eiwit in E.coli uit te drukken, en vervolgens membraanveikles te genereren, zodat het heterologously-uitgedrukte eiwit kan worden getesteerd in een celvrij systeem. Een westelijke vlek wordt gebruikt om te controleren of AtBAT1 is overgemaakt naar blaasje. Indringende de vlek met een Anti-His C-terminal antilichaam bleek een fusie constructie eiwit dat is ongeveer 72,3 kilodaltons.Vertering van de vesicles voorafgaand aan SDS-PAGE resulteerde in een vermindering, maar niet een volledig verlies van de sonde signaal. Bij 12 graden Celsius, opname van een radiolabel spermidine door de eitjes is het hoogst op een minuut en bleef lineair gedurende drie minuten. Daarom wordt de incubatietijd voor de transporttest op één minuut vastgesteld.Na een minuut is er geen netto opname van isotoop door membraanveikels die werden bereid en opgeslagen bij pH 8.0 omdat er geen protongradiënt is over het blaasmembraan. Om het effect van de afvoer van de kunstmatige protongradiënt aan te tonen, worden de membraanvegelsicles gedurende 10 minuten in pH 8.0-buffer geïncubeerd, wat leidt tot een minimale opname van radioactief gelabeld substraat. Samen wijzen deze resultaten erop dat de proton-gedreven opname van spermidine te wijten is aan het BAT1-eiwit.Om de substraatspecificiteit van het eiwit te bepalen, worden km-waarden berekend door de opname van radioactief gelabeld substraat bij verschillende concentraties te meten. De Km-waarden voor spermidine, putrescine en arginine geven aan dat dit eiwit een polyamine met hoge affiniteit en arginine-wisselaar is. Affiniteit van de transporter voor een bepaald substraat kan ook indirect worden bepaald door gebruik te maken van concurrentietesten.Deze tests blijkt dat GABA is een concurrerende remmer van spermidine. Bovendien blijkt uit het meten van de opname van 50 micromolar radioactief gelabelde spermidine in aanwezigheid van verschillende concentraties van verschillende aminozuren dat AtBAT1 ook glutamaat en alanine kan vervoeren bij millimolarconcentraties. Bij het uitvoeren van deze procedure is de integratie van de membraantransporter in het bacteriële membraan uiteraard van cruciaal belang.Verificatie dat het eiwit van belang is geïntegreerd in het membraan kan worden gedaan met behulp van antilichamen gericht tegen de C-terminal tags. Genetische variatie van menselijke vervoerders kan het transport beïnvloeden van zowel metabolieten als geneesmiddelen die substraten van de specifieke vervoerder zijn. Zo kan allelic variatie invloed hebben op zowel de opname en uitscheiding van drugs.Veel allelic varianten kunnen snel worden gemaakt door side-directed mutagenesis van het transporter gen in een expressie vector. Functionele testen van deze varianten kunnen vervolgens worden getest onder zeer gecontroleerde omstandigheden met behulp van inside-out vesicle tests. Membraantransporters vormen acht tot tien van alle eiwitten en de meerderheid is niet volledig gekarakteriseerd in een van de modelorganismen.Transporters die gelokaliseerd zijn op organellemembranen zijn bijzonder uitdagend om te karakteriseren door heterologe expressie in eukaryotische cellen. Als uitwisselingstype of protongemedieerde transporters kunnen worden gelokaliseerd op dit E.coli membraan, kunnen deze transporters functioneel worden gekarakteriseerd met behulp van deze in vitro assay. De kwaliteit en opbrengst van vesicles wordt beïnvloed door de snelheid van elutie van celfragmenten uit de Franse pers.Bij het doen van transporttesten van vesicles met isotopen, is het belangrijk om een experimentele setup te hebben die het doen van experimentele replica's vergemakkelijkt. Er zijn vele manieren om dit te doen, maar we denken dat het nuttig zal zijn voor ons om u te laten zien hoe we het hebben gedaan.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biochemistry

Cell Biology

Anatomy and Physiology

Unit 1

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Cell Membrane Structure and Functions

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...