Name: characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles at JoVE.com

Le BGSU Graduate College et le BGSU Office of Sponsored Programs and Research ont appuyé ce projet.

1. Génération de l'E. coli Double Knock Out Mutant avec Transduction P1
<ol><li>Obtenir les souches mutantes E. coli à un seul KO , PotE et CadB, du E. coli Genetic Stock Center<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">(http://cgsc.biology.yale.edu</a>). REMARQUE: La souche 'PotE est résistante à la kanamycine26 et la souche 'CadB' est résistante à la tétracycline27.</l...

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Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li><li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. 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GaphPad Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/">https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/</a> (2019)</li><li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+(ZmBT1)+from+Zea+mays.">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li><li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+chloroplast+ATP/ADP+transporter+in+E.+coli+membranes:+behind+the+Mistic+strategy.">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li><li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H+-Translocating+ATPases:+Advances+Using+Membrane+Vesicles.">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li><li>Bush, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose:+H++carrier.">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li><li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes.">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli.">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li></ol>

Dans la présente étude, nous dénoncions une méthode pour la caractérisation d'un antiporteur en exprimant d'abord la protéine dans E. coli, puis en générant des vésicules membranaires, de sorte que la protéine hétérogène peut être astoyée dans un système sans cellules. En plus de l'équipement trouvé dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire, cette stratégie nécessite l'utilisation d'une presse Français, d'un ultracentrifuge et de l'accès à une installation pour effectuer de...

Les protéines impliquées dans le trafic de métabolites constituent un niveau essentiel de régulation physiologique, mais la grande majorité des transporteurs de membranes végétales n'ont pas encore été caractérisés fonctionnellement. Plusieurs stratégies ont été mises en œuvre pour caractériser les nouvelles protéines de transport. L'expression hétérologue dans les organismes modèles tels que E. coli et les cellules eucaryotes telles que la levure, les ovocytes Xenopus, les cellules de mammifères, les cellules d'insectes et les cellules végétales ont tous été utilisés pour déterminer leur activité de transport1. Les cellules eucaryotes sont favorisées pour l'expression des protéines eucaryotes, parce que la composition cellulaire de base, les voies de transduire de signal, la transcription et les machines de traduction sont compatibles avec les conditions indigènes.
La levure a été un organisme modèle important pour la caractérisation de nouvelles protéines de transport chez les plantes. La première protéine de transport de plantes qui a été exprimée avec succès dans la levure (Saccharomyces pombe) était le transporteur de hexose HUP1 de Chlorella2. Depuis lors, de nombreuses protéines de transport de plantes ont été fonctionnellement caractérisées à l'aide d'un système d'expression de levure. Il s'agit notamment des transporteurs de sucre végétal (SUC1 et SUC23, VfSUT1 et VfSTP14) et les transporteurs d'auxin (AUX1 et PIN5). Les inconvénients de l'utilisation de levure pour exprimer les protéines végétales peuvent inclure l'activité altérée des protéines plastides localisées parce que la levure manque de cette organelle, mal cibler6, et la formation d'agrégats mal repliés et l'activation des réponses de stress dans la levure en raison de la surexpression des protéines membranaires7,8,9.
L'expression hétérologue des protéines de transport dans les ovocytes Xenopus a été largement utilisée pour la caractérisation électrophysiologique des transporteurs10. Les premières protéines de transport de plantes caractérisées à l'aide d'une expression hétérologue dans les ovocytes Xenopus étaient le canal de potassium D'Arabidopsis KAT110 et le transporteur d'hexose Arabidopsis STP111. Depuis lors, les ovocytes Xenopus ont été utilisés pour caractériser de nombreuses protéines de transport de plantes telles que les transporteurs de membrane splamine12, transporteur de saccharose vacuolaire SUT413 et transporteur de malate vacuolaire ALMT914. Une limitation importante des ovocytes Xenopus pour les essais de transport est que la concentration de métabolites intracellulaires ne peut pas être manipulée1. En outre, des connaissances professionnelles sont nécessaires pour préparer les ovocytes Xenopus et la variabilité des lots d'ovocytes est difficile à contrôler.
L'expression hétérologue dans l'organisme modèle E. coli est un système idéal en termes de caractérisation des nouvelles protéines de transport des plantes. Avec un génome entièrement séquencé15, les caractéristiques moléculaires et physiologiques d'E. coli sont bien connues. Les outils et les techniques moléculaires sont bien établis16. En outre, différents vecteurs d'expression, souches non pathogènes et mutants sont disponibles17,18,19. En outre, E. coli a un taux de croissance élevé et peut être facilement cultivé dans des conditions de laboratoire. De nombreuses protéines peuvent être facilement exprimées et purifiées en grandes quantités dans E. coli9. Lorsque les protéines ne peuvent pas être astorquées directement dans les systèmes cellulaires, la reconstitution des protéines en liposomes a également été une innovation réussie, bien que difficile pour la caractérisation des protéines membranaires purifiées. La caractérisation fonctionnelle des protéines de transport mitochondrial des plantes, y compris les transporteurs de solutés tels que les transporteurs de phosphate dans le soja, le maïs, le riz et l'arabidopsis, le transporteur de dicarboxylate-tricarboxylate dans Arabidopsis ont été accomplies en utilisant ce système modèle20,21. Cependant, les protéines recombinantes de la protéine de tomate SICAT9 se sont avérées non fonctionnelles dans les expériences de reconstitution, et d'autres membres de la famille de transporteur de CAT se sont avérés non fonctionnels dans Xenopus oocyte s'indique22. Ainsi, des outils moléculaires supplémentaires sont nécessaires pour la caractérisation des transporteurs de membranes.
Cinq systèmes de transport de polyamine se trouvent dans E. coli23. Il s'agit de deux transporteurs ABC médiateurs de l'apport de spermidine et de putrescine, d'un échangeur de putrescine/ornithine, d'un échangeur de cadaverine/lysine, d'un exportateur de spermidine et d'un importateur de putrescine. L'échangeur de putrescine PotE a été caractérisé à l'origine à l'aide d'un étosay vésicule, où l'intérieur des vésicules ont été préparés en lysing cellules avec une presse Français et de mesurer l'utilisation de putrescine radiolabeled dans les vésicules en échange de l'ornithine24. Des essais de vésicule ont également été utilisés pour caractériser un transporteur de calcium, qui a négocié le transport du calcium en réponse à un gradient de proton25. Ces expériences nous ont incités à développer une stratégie pour la caractérisation d'autres échangeurs de polyamines. Nous avons d'abord créé une souche de E. coli déficiente chez les échangeurs de PotE et de CadB. Ici, nous démontrons la caractérisation fonctionnelle d'un antiporteur de polyamine de plante par l'expression hétérologue dans la souche modifiée d'E. coli, la génération des vésicules de membrane utilisant une presse Français, et les essais radiolabeled.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-putrescine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET185001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-spermidine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET522001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C arginine</td>
			<td>Moravek Inc.</td>
			<td>MC137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His (C-term)-HRP antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R931-25</td>
			<td>Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl 
			group for detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Pierce BCA protein asay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxypeptidase B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9584-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td>SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>LabGenome</td>
			<td>7777-7</td>
			<td>Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint-H</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS275</td>
			<td>scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration manifold</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>FH225V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>FA-080A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>KROGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>hawp02500</td>
			<td>0.45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up kit</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>QuickClean II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putrescine</td>
			<td>fluka</td>
			<td>32810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains :E. coli &#916;potE740(del)::kan, &#916;cadB2231::Tn10</td>
			<td>This manuscript</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td>Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Research Products</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall MTX 150</td>
			<td>46960</td>
			<td>Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>45237</td>
			<td>Centrifuge tubes for S150-AT rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector: pBAD-DEST49</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Gateway expression vector for E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles

Plusieurs méthodes ont été développées pour caractériser fonctionnellement les nouveaux transporteurs de membrane. Les polyamines sont omniprésentes dans tous les organismes, mais les échangeurs de polyamines dans les plantes n'ont pas été identifiés. Ici, nous dénoncons une méthode pour caractériser les antiporteurs de polyamine utilisant des vésicules membranaires générées par la lyse des cellules escherichia coli exprimant hétérolifèrement un antiporteur de plante. Tout d'abord, nous avons exprimé hétérossablement AtBAT1 dans une souche E. coli déficiente dans les transporteurs d'échange de polyamine et d'arginine. Les vésicules ont été produites à l'aide d'une presse Français, purifiée par ultracentrifugation et utilisée dans un procédé de filtration membranaire de substrats étiquetés pour démontrer la spécificité du substrat du transporteur. Ces essais ont démontré qu'AtBAT1 est un transporteur à médiation proton de l'arginine, de l'acide aminobutyrique (GABA), de la putrescine et de la spermidine. La souche mutante qui a été développée pour l'analyse d'AtBAT1 peut être utile pour l'analyse fonctionnelle d'autres familles d'échangeurs de polyamine végétale et animale. Nous émettons également l'hypothèse que cette approche peut être utilisée pour caractériser de nombreux autres types d'antiporteurs, tant que ces protéines peuvent être exprimées dans la membrane cellulaire bactérienne. E. coli est un bon système pour la caractérisation des nouveaux transporteurs, car il existe plusieurs méthodes qui peuvent être utilisées pour mutiler les transporteurs indigènes.

Les principales étapes de ce protocole sont résumées de façon picturale à la figure 1. En bref, les cellules E. coli déficientes chez tous les échangeurs de polyamines et exprimant AtBAT1 sont cultivées, centrifugeuses, lavées à l'aide d'un tampon et soumises à la lyse cellulaire à l'aide d'une presse Français. La lyse a tendance à produire des vésicules qui sont la plupart du temps à l'intérieur-extérieur et piéger le tam...

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Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Nous décrivons une méthode pour la caractérisation des transporteurs de membrane proton-conduits dans les préparations de vésicule de membrane produites par l'expression hétérologue dans E. coli et lysis des cellules utilisant une presse Français.

Caractérisation des transporteurs de membrane par l'expression hétérologue dans E. coli et la production de vésicules membranaires

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Un des principaux avantages de cette technique pour caractériser les transporteurs membranaires est que vous pouvez déterminer l’affinité relative du transporteur pour des substrats spécifiques, ainsi que d’obtenir un aperçu sur le mécanisme de transport. La caractérisation des protéines membranaires qui utilisent des gradients protéiques pour stimuler le transport du substrat est particulièrement adaptée à cet essai de vésicule à l’intérieur que nous démontrons ici. Bien que cet essai nécessite certains équipements spécialisés tels qu’une presse Français et l’accès à une ultracentrifugeuse, nous pensons qu’il peut être techniquement plus facile que les analyses qui nécessitent des transporteurs membranaires pour être reconstitués en liposomes artificiels.Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de quantifier les affinités relatives pour différents substrats et de faire des essais de compétition pour tester l’effet des substrats concurrents sur les grilles de transport. Dans le cas du transporteur BAT1 utilisé pour illustrer cet essai, nous avons également pu montrer l’activation du substrat du transporteur par arginine. Pour commencer cette procédure, cultivez les cellules mutantes préparées d’E.coli qui expriment la protéine cible en inoculant une seule colonie en cinq millilitres de polyamine 3 médias avec des antibiotiques appropriés et en la cultivant pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, transférez cette culture à 500 millilitres de polyamine fraîche 3 médias qui est complétée par 0,0002%arabinose et se développent jusqu’à ce que la culture cellulaire atteint un OD600 entre 0,6 et 0,8. Après cela, centrifugeuse à 2000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour recueillir la pastille cellulaire. Suspendez le granulé et lavez-le trois fois avec le tampon un en centrifugant à 2000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes à chaque fois.Le volume final de cellules dans buffer un après le troisième spin doit être de 10 millilitres. Mettez en place une cellule Français de pression de 35 millilitres et versez la suspension cellulaire dans le corps de la cellule. Allumez la machine avec l’interrupteur sur le RHS à l’arrière de l’appareil et réglez le commutateur de sélecteur de rapport à haut.Allumez la pompe. Le piston commencera à s’élever de la base pour déplacer l’air dans la chambre. Augmentez la pression en tournant la soupape d’augmentation de pression dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la jauge atteigne 640 PSI.Ça créera une pression interne de 10 000 PSI. Une fois que la cellule a atteint la pression cible, ouvrez légèrement l’assemblage de la valve d’écoulement en la retournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Ajustez l’ouverture de la vanne pour permettre un débit d’environ 10 gouttes par minute.Lorsque la ligne d’arrêt sur le corps du piston atteint le sommet de la cellule d’écoulement éteindre la pompe. Abaissez la plaque inférieure en plaçant le commutateur sélecteur de rapport vers le bas, puis, en mettant l’interrupteur de la pompe allumé. Lorsque la plaque inférieure est complètement rétractée, réduisez la pression du système à zéro en tournant la soupape d’augmentation de pression complètement dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.Éteignez la pompe et éteignez la machine. Centrifugeuse Français presse à 10 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour enlever les cellules ininterrompues et les débris cellulaires. Jeter la pastille et transférer le supernatant dans des tubes d’ultracentrifugeuse.Ultracentrifugeuse le supernatant résultant à 150.000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant une heure pour pelleter les vésicules membranaires. Laver les vésicules membranaires une fois sans re-suspension dans le tampon deux. Ensuite, utilisez un broyeur de tissu Dounce pour suspendre à nouveau les vésicules membranaires dans le tampon deux.Préparez 100 microlitres aliquots des préparations membranaires dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre et conservez-les à moins-80 Degrés Celsius. Tout d’abord, laver et suspendre à nouveau les vésicules dans 30 millimolaires de Tris au pH 7,8, qui contient 0,1 millimolaire de chlorure de cobalt II. Ajouter un microlitre de carboxypeptidase A en chlorure de sodium, tris et chlorure de cobalt II à chaque échantillon de 100 microlitres.Incuber à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajouter cinq microlitres d’une solution contenant de l’EDTA de sodium et du 2-Mercaptoéthanol à PH 7,5 pour arrêter la digestion. Incuber la solution à température ambiante pendant une heure pour inactiver complètement l’enzyme.Ensuite, ajoutez entre cinq et 10 microlitres d’une solution contenant du sulfate de dodédecyl au lithium, du glycérol, du bromophénol bleu et du Tris au pH 7,5 à 100 microlitres de l’échantillon et analysez des échantillons par électrophorèse. Pour effectuer le buvard d’acides aminés, déposer un filtre à nitrocellulose humidifié avec du phosphate d’hydrogène de sodium de 25 millimlaires sur le gel de polyacrylamide. Placez-les entre deux filtres à cellulose humidifiés, et enfin, entre deux tampons d’affouillement en plastique humidifiés.Placez cet assemblage entre les électrodes d’une chambre contenant du phosphate d’hydrogène de sodium de 25 millimlaires à une température comprise entre deux et quatre degrés Celsius. Électrotransférer les protéines à 20 volts et à deux à trois amplis pendant trois heures. Bloquez la membrane de nitrocellulose en bloquant le tampon pendant la nuit à deux degrés Celsius.Le lendemain, incuber la nitrocellulose à 20 millilitres de une à 5000 dilution de l’anticorps HRP anti-son terminal C et bloquer le tampon pendant deux heures et laver deux fois avec 50 millilitres de tampon pour un total de 60 minutes. Pour visualiser la tache d’aminé, dissoudre six milligrammes de 4-Chloro-1-naphthol en 20 millilitres d’alcool dénaturé et ajouter 80 millilitres de Tris de 15 millimolaires et 50 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30%. Baignez le papier filtre dans cette solution de substrat pendant 20 minutes.Lorsque suffisamment de couleur s’est développée, rincer la membrane à l’eau et la laisser sécher. Pour commencer, incuber les 100 microlitres aliquot des vésicules membranaires à 12 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter le tampon 3 contenant des polyamines radioétiques à une concentration finale de 50 micromolaires aux vésicules membranaires dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitres pour initier le transport.Effectuez l’analyse de transport à 12 degrés Celsius pendant une minute. Après cela, transférez les mélanges de réaction au collecteur de filtration et filtrez-le par un filtre à membrane nitrocellulose de 0,45 micromètre. Ajouter trois millilitres de tampon d’essai glacé contenant une concentration dix fois plus élevée de polyamines non étiquetées, suivie de trois millilitres de tampon d’essai sans les polyamines pour réduire la liaison non spécifique.Transférer les filtres lavés sur des flacons jetables de scintillation de 20 millilitres contenant 10 millilitres de liquide de scintillation et utiliser un compteur de scintillation liquide pour déterminer la radioactivité. Calculer l’absorption nette de polyamine tel qu’il est décrit dans le protocole textuel. Déterminer le km pour le substrat en mesurant l’absorption du substrat radioétique dans les vésicules exprimant la protéine cible et calculer la cinétique Michaelis-Menten à l’aide d’une méthode de régression non ligneaire.Pour les expériences de compétition, ajouter le substrat concurrentiel non étiqueté fabriqué dans le tampon d’essai au tube de centrifugeuse contenant 100 microlitres de vésicules à 12 degrés Celsius tout en ajoutant simultanément 50 micromolaires de la polyamine radiolabellisé. Mesurer la radioactivité emprisonnée à l’intérieur des vésicules comme décrit précédemment. Déterminer un KM parent pour les substrats compétitifs en mesurant l’absorption des polyamines radioétiques et la présence de substrat non étiqueté de 100 micromolaires ou plus et utiliser une méthode de régression non ligneux pour tracer la courbe.Dans cette étude, un anti-porteur se caractérise par l’expression d’abord de la protéine dans E.coli, puis, la génération de vésicules membranaires de sorte que la protéine exprimée heterologously peut être analysée dans un système sans cellules. Une tache occidentale est utilisée pour vérifier qu’AtBAT1 est translocalisé en vésicule. Sonder la tache avec un anticorps anti-son C-terminal a indiqué une protéine de construction de fusion qui est approximativement 72.3 kilodaltons.La digestion des vésicules avant SDS-PAGE a entraîné une diminution, mais pas une perte complète du signal de la sonde. À 12 degrés Celsius, l’absorption d’une spermidine radioétique par les vésicules est la plus élevée à une minute et est restée linéaire pendant trois minutes. Par conséquent, le temps d’incubation de l’analyse de transport est fixé à une minute.Après une minute, il n’y a pas d’absorption nette d’isotopes par les vésicules membranaires qui ont été préparées et stockées au pH 8.0 car il n’y a pas de gradient de protons à travers la membrane vésicule. Pour démontrer l’effet de la dissipation du gradient artificiel des protons, les vésicules membranaires sont incubées en tampon pH 8.0 pendant 10 minutes avant l’ajout d’un substrat étiqueté, ce qui entraîne une absorption minimale du substrat radioétique. Pris ensemble, ces résultats indiquent que l’absorption de spermidine par proton est due à la protéine BAT1.Pour déterminer la spécificité du substrat de la protéine, les valeurs km sont calculées en mesurant l’absorption du substrat radioétique à différentes concentrations. Les valeurs km pour la spermidine, la putrescine et l’arginine indiquent que cette protéine est un échangeur de polyamine et d’arginine de haute affinité. L’affinité du transporteur pour un substrat particulier peut également être déterminée indirectement en utilisant des analyses de concurrence.Ces analyses révèlent que GABA est un inhibiteur compétitif de la spermidine. En outre, la mesure de l’absorption de 50 micromolaires de spermidine radiolabeled en présence de concentrations variables de différents acides aminés révèle qu’AtBAT1 est également capable de transporter le glutamate et l’alanine à des concentrations millimolaires. Lors de l’exécution de cette procédure, l’intégration du transporteur membranaire dans la membrane bactérienne est, évidemment, critique.La vérification que la protéine d’intérêt est intégrée dans la membrane peut être effectuée à l’aide d’anticorps dirigés contre les étiquettes du terminal C. La variation génétique des transporteurs humains peut affecter le transport, à la fois, de métabolites et de médicaments qui sont des substrats du transporteur particulier. Ainsi, la variation allélique peut affecter, à la fois, l’absorption et l’excrétion des médicaments.De nombreuses variantes alléliliques peuvent être rapidement faites par mutagenèse latérale du gène transporteur dans un vecteur d’expression. Les analyses fonctionnelles de ces variantes peuvent ensuite être testées dans des conditions très contrôlées à l’aide d’analyses vésicules à l’intérieur. Les transporteurs membranaires constituent de huit à dix de toutes les protéines et la majorité n’ont pas été caractérisés complètement dans aucun des organismes modèles.Les transporteurs qui sont localisés aux membranes organelles sont particulièrement difficiles à caractériser par l’expression heterologous dans les cellules eucaryotes. Si le type d’échange ou les transporteurs à base de protons peuvent être localisés à cette membrane E.coli, ces transporteurs peuvent être caractérisés fonctionnellement à l’aide de cet essai in vitro. La qualité et le rendement des vésicules sont affectés par le taux d’élitution des fragments de cellules de la Français presse.En faisant des analyses de transport de vésicules avec des isotopes, il est important d’avoir une configuration expérimentale qui facilite faire des répliques expérimentales. Il y a plusieurs façons de le faire, mais nous pensons qu’il nous sera utile de vous montrer comment nous l’avons fait.

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