Name: characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles at JoVE.com

Unterstützung für dieses Projekt kam vom BGSU Graduate College und dem BGSU Office of Sponsored Programs and Research.

1. Erzeugung des E. coli Double Knock Out Mutant mit P1-Transduktion
<ol><li>Beziehen Sie die E. coli Single-Knockout-Mutantenstämme "PotE" und "CadB" vom E. coli Genetic Stock Center (<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">http://cgsc.biology.yale.edu</a>). HINWEIS: Die Sorte "PotE" ist kanamycinbeständig26 und die Sorte "CadB" tetracyclinbeständig27.</li>
	<li>Konstruie...

<ol>
	<li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins.">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li><li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li><li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUC1+and+SUC2:+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana;+expression+and+characterization+in+baker's+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein.">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li><li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development:+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds.">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li><li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance,+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis.">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li><li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cells+are+not+just+green+yeast.">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li><li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+dynamics+of+aggresome+formation+by+a+cytosolic+GFP-chimera.">Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera.</a> Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).</li><li>Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter,+Ctr1p,+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase.">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Miroux, B., Walker, J. 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Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li><li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. 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GaphPad Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/">https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/</a> (2019)</li><li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+(ZmBT1)+from+Zea+mays.">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li><li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+chloroplast+ATP/ADP+transporter+in+E.+coli+membranes:+behind+the+Mistic+strategy.">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li><li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H+-Translocating+ATPases:+Advances+Using+Membrane+Vesicles.">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li><li>Bush, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose:+H++carrier.">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li><li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes.">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli.">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li></ol>

In der vorliegenden Studie skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung eines Antiporters, indem wir zuerst das Protein in E. coli exprimieren und dann Membranbläschen erzeugen, so dass das heterologös exprimierte Protein in einem zellfreien System untersucht werden kann. Zusätzlich zu den Geräten, die in den meisten molekularbiologischen Labors zu finden sind, erfordert diese Strategie den Einsatz einer französischen Presse, einer Ultrazentrifuge und zugang zu einer Einrichtung zur Durchführung von R...

Proteine, die am Handel mit Metaboliten beteiligt sind, stellen ein wesentliches Maß an physiologischer Regulation dar, aber die überwiegende Mehrheit der Pflanzenmembrantransporter ist noch nicht funktionell charakterisiert. Mehrere Strategien wurden implementiert, um neuartige Transportproteine zu charakterisieren. Heterologe Expression in Modellorganismen wie E. coli und eukaryotischen Zellen wie Hefe, Xenopus Oozyten, Säugetierzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen wurden alle verwendet, um ihre Transportaktivität zu bestimmen1. Eukaryotische Zellen werden für die Expression von eukaryotischen Proteinen bevorzugt, da die grundlegende zelluläre Zusammensetzung, Signaltransducing-Pfade, Transkription und Übersetzungsmaschinen mit den nativen Bedingungen kompatibel sind.
Hefe war ein wichtiger Modellorganismus für die Charakterisierung neuartiger Transportproteine in Pflanzen. Das erste Pflanzentransportprotein, das erfolgreich in Hefe exprimiert wurde (Saccharomyces pombe) war der Hexose-Transporter HUP1 von Chlorella2. Seitdem wurden viele Pflanzentransportproteine funktionell mit einem Hefeexpressionssystem charakterisiert. Dazu gehören Pflanzenzuckertransporter (SUC1 und SUC23, VfSUT1 und VfSTP14) und die Auxin-Transporter (AUX1 und PIN5). Nachteile der Verwendung von Hefe, um pflanzliche Proteine auszudrücken, können eine beeinträchtigte Aktivität von plastid-lokalisierten Proteinen umfassen, da Hefe diese Organelle fehlt, Fehlausrichtung6, und Bildung von falsch gefalteten Aggregaten und Aktivierung von Stressreaktionen in Hefe aufgrund der Überexpression von Membranproteinen7,8,9.
Heterologe Expression von Transportproteinen in Xenopus Oozyten wurde häufig für die elektrophysiologische Charakterisierung von Transportern10verwendet. Die ersten pflanzentransportinochig charakterisierten Pflanzentransportproteine, die mit heterologer Expression in Xenopus oocyten charakterisiert wurden, waren der Arabidopsis Kaliumkanal KAT110 und der Arabidopsis Hexose Transporter STP111. Seitdem wurden Xenopus Oozyten eingesetzt, um viele Pflanzentransportproteine wie Plasmamembrantransporter12, Vacuolar-Saccharosetransporter SUT413 und Vacuolar-Malattransporter ALMT914zu charakterisieren. Eine wichtige Einschränkung von Xenopus Oozyten für Transporttests ist, dass die Konzentration von intrazellulären Metaboliten nicht manipuliert werden kann1. Darüber hinaus sind professionelle Kenntnisse erforderlich, um Xenopus Oozyten vorzubereiten, und die Variabilität der Eizellenchargen ist schwer zu kontrollieren.
Heterologe Expression im Modellorganismus E. coli ist ein ideales System in Bezug auf die Charakterisierung neuartiger Pflanzentransportproteine. Mit einem vollständig sequenzierten Genom15sind die molekularen und physiologischen Eigenschaften von E. coli bekannt. Molekulare Werkzeuge und Techniken sind gut etabliert16. Darüber hinaus stehen verschiedene Expressionsvektoren, nichtpathogene Stämme und Mutanten zur Verfügung17,18,19. Darüber hinaus hat E. coli eine hohe Wachstumsrate und kann leicht unter Laborbedingungen angebaut werden. Viele Proteine können leicht in hohen Mengen in E. coli9exprimiert und gereinigt werden. Wenn Proteine nicht direkt in zellulären Systemen untersucht werden können, war die Rekonstitution von Proteinen zu Liposomen auch eine erfolgreiche, wenn auch herausfordernde Innovation für die Charakterisierung gereinigter Membranproteine. Die funktionelle Charakterisierung der mitochondrialen Transportproteine der Pflanze einschließlich gelöster Transporter wie Phosphattransporter in Sojabohnen, Mais, Reis und Arabidopsis, Dicarboxylat-Tricarboxylatträger in Arabidopsis wurde mit diesem Modellsystem20,21erreicht. Jedoch, rekombinante Proteine des Tomatenproteins SICAT9 wurden festgestellt, dass nicht funktional in Rekonstitutionsexperimente, und andere Mitglieder der CAT-Transporter-Familie wurden gefunden, um nicht funktional in Xenopus Oozyten-Assays22. Daher werden zusätzliche molekulare Werkzeuge für die Charakterisierung von Membrantransportern benötigt.
Fünf Polyamin-Transportsysteme sind in E. coli23zu finden. Dazu gehören zwei ABC-Transporter, die die Aufnahme von Spermidin und Putrescin vermitteln, einen Putrescine/Ornithin-Austauscher, einen Kadaverin/Lysinaustauscher, einen Spermidinexporteur und einen Putrescine-Importeur. Der Putrescine-Austauscher PotE wurde ursprünglich mit einem Vesikel-Assay charakterisiert, bei dem von innen nach außen Vesikel durch Lysingzellen mit einer französischen Presse hergestellt und die Aufnahme von radioaktiv markiertem Putrescin in die Vesikel im Austausch gegen Ornithin24gemessen wurden. Vesikel-Assays wurden auch verwendet, um einen Kalziumtransporter zu charakterisieren, der den Transport von Kalzium als Reaktion auf einen Protonengradientenvermittelte 25. Diese Experimente veranlassten uns, eine Strategie für die Charakterisierung anderer Polyaminaustauscher zu entwickeln. Wir haben zuerst einen Stamm von E. coli-Mangel an PotE- und CadB-Austauschern entwickelt. Hier zeigen wir die funktionelle Charakterisierung eines Pflanzenpolyamin-Antiporters durch heterlogen Ausdruck im modifizierten E. coli-Stamm, die Erzeugung von Membranbläschen mit einer französischen Presse und radioaktiv markierte Assays.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-putrescine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET185001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-spermidine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET522001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C arginine</td>
			<td>Moravek Inc.</td>
			<td>MC137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His (C-term)-HRP antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R931-25</td>
			<td>Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl 
			group for detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Pierce BCA protein asay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxypeptidase B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9584-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td>SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>LabGenome</td>
			<td>7777-7</td>
			<td>Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint-H</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS275</td>
			<td>scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration manifold</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>FH225V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>FA-080A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>KROGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>hawp02500</td>
			<td>0.45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up kit</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>QuickClean II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putrescine</td>
			<td>fluka</td>
			<td>32810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains :E. coli &#916;potE740(del)::kan, &#916;cadB2231::Tn10</td>
			<td>This manuscript</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td>Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Research Products</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall MTX 150</td>
			<td>46960</td>
			<td>Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>45237</td>
			<td>Centrifuge tubes for S150-AT rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector: pBAD-DEST49</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Gateway expression vector for E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles

Mehrere Methoden wurden entwickelt, um neuartige Membrantransporter funktionell zu charakterisieren. Polyamine sind in allen Organismen allgegenwärtig, aber Polyaminaustauscher in Pflanzen wurden nicht identifiziert. Hier skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung von Polyamin-Antiportern mit Membranvesiken, die aus der Lyse von Escherichia coli-Zellen erzeugt werden, die heterolog einen Pflanzenantiporter exemitzen. Zunächst haben wir AtBAT1 heterolog in einem E. coli-Stamm mangelhaft in Polyamin- und Argininaustauschtransportern exprimiert. Vesikel wurden mit einer französischen Presse hergestellt, die durch Ultrazentrifugation gereinigt und in einem Membranfiltrationstest von markierten Substraten verwendet wird, um die Substratspezifität des Transporters zu demonstrieren. Diese Assays zeigten, dass AtBAT1 ein Proton-vermittelter Transporter von Arginin, Aminobuttersäure (GABA), Putrescin und Spermidin ist. Der mutierte Stamm, der für den Test von AtBAT1 entwickelt wurde, kann für die funktionelle Analyse anderer Familien von Pflanzen- und Tierpolyaminaustauschern nützlich sein. Wir gehen auch davon aus, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um viele andere Arten von Antiportern zu charakterisieren, solange diese Proteine in der bakteriellen Zellmembran exprimiert werden können. E. coli ist ein gutes System für die Charakterisierung neuartiger Transporter, da es mehrere Methoden gibt, die eingesetzt werden können, um einheimische Transporter zu mutagenisieren.

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind bildlich in Abbildung 1zusammengefasst. Kurz gesagt, E. coli-Zellen, die in allen Polyaminaustauschern einen Mangel haben und AtBAT1 exprimieren, werden kultiviert, zentrifugiert, mit einem Puffer gewaschen und mit einer französischen Presse einer Zelllyse unterzogen. Lyse neigt dazu, Vesikel zu produzieren, die meist innen nach außen sind und den Puffer außerhalb der Zellen fangen. Zellab...

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Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Wir beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung von protonengetriebenen Membrantransportern in Membranvesikelpräparaten, die durch heterologe Expression in E. coli und Lyse von Zellen mit einer französischen Presse hergestellt werden.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Einer der Hauptvorteile dieser Technik zur Charakterisierung von Membrantransportern ist, dass Sie die relative Affinität des Transporters für bestimmte Substrate bestimmen und Einblicke in den Transportmechanismus gewinnen können. Die Charakterisierung von Membranproteinen, die Proteingradienten zur Anfahrt zum Substrattransport verwenden, eignet sich besonders für diesen inside-out Vesikel-Assay, den wir hier demonstrieren. Während dieser Test einige spezielle Geräte wie eine französische Presse und den Zugang zu einer Ultrazentrifuge erfordert, denken wir, dass es technisch einfacher sein kann als Assays, die erfordern, dass Membrantransporter zu künstlichen Liposomen rekonstituiert werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die relativen Affinitäten für verschiedene Substrate zu quantifizieren und Wettbewerbstests durchzuführen, um die Wirkung konkurrierender Substrate auf Transportroste zu testen. Im Fall des BAT1-Transporters, der zur Veranschaulichung dieses Assays verwendet wurde, konnten wir auch die Substrataktivierung des Transporters durch Arginin nachweisen. Um dieses Verfahren zu beginnen, kulturieren Sie die vorbereiteten E.coli-Mutantenzellen, die das Zielprotein ausdrücken, indem sie eine einzelne Kolonie in fünf Milliliter Polyamin-3-Medien mit geeigneten Antibiotika impfen und es über Nacht bei 37 Grad Celsius anbauen.Am nächsten Tag, übertragen Sie diese Kultur auf 500 Milliliter frische Polyamin 3 Medien, die mit 0.0002%arabinose ergänzt wird und wachsen, bis die Zellkultur erreicht eine OD600 zwischen 0.6 und 0.8. Danach zentrifugieren Sie bei 2000 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um das Zellpellet zu sammeln. Das Pellet wieder aufhängen und dreimal mit Puffer eins durch Zentrifugieren bei 2000 mal G und bei jeweils 15 Minuten bei vier Grad Celsius waschen.Das endgültige Volumen der Zellen in Puffer eins nach der dritten Drehung sollte 10 Milliliter betragen. Legen Sie eine 35 Milliliter französische Druckzelle und gießen Sie die Zellsuspension in den Körper der Zelle. Schalten Sie die Maschine mit dem Schalter am RHS auf der Rückseite des Geräts ein und stellen Sie den Ratio-Wahlschalter auf hoch.Schalten Sie den Pumpenschalter ein. Der Kolben beginnt, von der Basis zu steigen, um die Luft in der Kammer zu verdrängen. Erhöhen Sie den Druck, indem Sie das Druckerhöhungsventil im Uhrzeigersinn drehen, bis das Messgerät 640 PSI erreicht.Dadurch entsteht ein interner Druck von 10.000 PSI. Sobald die Zelle den Zieldruck erreicht hat, öffnen Sie die Durchflussventilbaugruppe leicht, indem Sie sie gegen den Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie die Öffnung des Ventils so ein, dass eine Durchflussrate von nur etwa 10 Tropfen pro Minute möglich ist.Wenn die Stoppleitung am Kolbenkörper die Oberseite der Durchflusszelle erreicht, schaltet sich die Pumpe ab. Senken Sie die untere Platte, indem Sie den Ratio-Auswahlschalter nach unten platzieren, und dann den Pumpenschalter einschalten. Wenn die Bodenplatte vollständig eingefahren ist, reduzieren Sie den Systemdruck auf Null, indem Sie das Druckerhöhungsventil vollständig gegen den Uhrzeigersinn drehen.Schalten Sie die Pumpe aus und schalten Sie die Maschine aus. Zentrifugieren Sie das französische Presseluant bei 10.000 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um ungebrochene Zellen und Zellablagerungen zu entfernen. Entsorgen Sie das Pellet und übertragen Sie den Überstand in Ultrazentrifugenrohre.Ultrazentrifugieren Sie den resultierenden Überstand bei 150.000 mal G und bei vier Grad Celsius für eine Stunde, um die Membranbläschen zu pellet. Waschen Sie die Membranbläschen einmal ohne Erneutsuspension in Puffer zwei. Verwenden Sie dann einen Dounce-Gewebeschleifer, um die Membranbläschen in Puffer zwei wieder aufzuhängen.100 Mikroliter Der Membranpräparate in 1,5 Milliliter Zentrifugenrohren vorbereiten und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Waschen und suspendieren Sie zunächst die Vesikel in 30 Millimolar von Tris bei pH 7,8, das 0,1 Millimolar Kobalt-II-Chlorid enthält. Fügen Sie je 100 Mikroliter-Probe einen Mikroliter Carboxypeptidase A in Natriumchlorid, Tris und Kobalt-II-Chlorid hinzu.20 Minuten bei 20 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie fünf Mikroliter einer Lösung, die Natrium-EDTA und 2-Mercaptoethanol bei PH 7.5 enthält, um die Verdauung zu stoppen. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für eine Stunde, um das Enzym vollständig zu inaktivieren.Als nächstes zwischen fünf und 10 Mikroliter einer Lösung, die Lithium-Dodecylsulfat, Glycerin, Bromphenolblau und Tris bei pH 7,5 bis 100 Mikroliter der Probe enthält, und Proben mittels Elektrophorese analysieren. Zur Durchführung der Aminoblottinglegen Sie einen Nitrozellulosefilter mit 25 Millimolaren Natriumhydrogenphosphat auf das Polyacrylamid-Gel. Platzieren Sie diese zwischen zwei befeuchteten Zellulosefiltern und schließlich zwischen zwei befeuchteten Kunststoff-Scheuerpads.Platzieren Sie diese Assemblage zwischen den Elektroden einer Kammer, die 25 Millimolar-Natriumhydrogenphosphat bei einer Temperatur zwischen zwei und vier Grad Celsius enthält. Elektrotransfer der Proteine bei 20 Volt und bei zwei bis drei Ampere für drei Stunden. Blockieren Sie die Nitrozellulosemembran im Sperrpuffer über Nacht bei zwei Grad Celsius.Am nächsten Tag die Nitrocellulose bei 20 Millilitern einer bis 5 000 Verdünnung des Anti-His C-Terminal HRP Antikörpers und Blockierpuffers für zwei Stunden inkubieren und zweimal mit 50 Milliliter Puffer für insgesamt 60 Minuten waschen. Um den Aminofleck zu visualisieren, lösen Sie sechs Milligramm 4-Chlor-1-Naphthol in 20 Milliliter denaturiertem Alkohol auf und fügen Sie 80 Milliliter 15 Millimolar Tris und 50 Mikroliter 30% Wasserstoffperoxid hinzu. Das Filterpapier in dieser Substratlösung 20 Minuten lang aufstellen.Wenn sich genügend Farbe entwickelt hat, spülen Sie die Membran mit Wasser ab und lassen Sie sie trocknen. Um zu beginnen, inkubieren Sie die 100 Mikroliter Aliquot der MembranVesikbei bei 12 Grad Celsius für fünf Minuten. Fügen Sie Puffer 3, der radioaktiv markierte Polyamine in einer Endkonzentration von 50 Mikromolaren enthält, in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren in die Membranbläschen ein, um den Transport zu initiieren.Führen Sie den Transport-Assay bei 12 Grad Celsius für eine Minute. Danach die Reaktionsgemische auf den Filtrationskrümmer übertragen und durch einen 0,45 Mikrometer Nitrocellulose-Membranfilter filtern. Fügen Sie drei Milliliter eiskalten Assaypuffer mit einer zehnfach höheren Konzentration von nicht beschrifteten Polyamonien hinzu, gefolgt von drei Millilitern Assaypuffer ohne die Polyame, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.Übertragen Sie die gewaschenen Filter auf 20 Milliliter Einweg-Szintillationsfläschchen mit 10 MilliliterSzlotationsflüssigkeit und verwenden Sie einen flüssigen Szintillationszähler, um die Radioaktivität zu bestimmen. Berechnen Sie die Netto-Polyaminaufnahme, wie im Textprotokoll beschrieben. Bestimmen Sie den Km für das Substrat, indem Sie die Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat in Vesikel messen, die das Zielprotein exemiten, und berechnen Sie die Michaelis-Menten-Kinetik mit einer nichtlinearen Regressionsmethode.Für die Wettbewerbsexperimente fügen Sie das nicht gekennzeichnete Wettbewerbssubstrat, das im Assaypuffer hergestellt wird, dem Zentrifugenrohr hinzu, das 100 Mikroliter Vesikel bei 12 Grad Celsius enthält, während gleichzeitig 50 Mikromolar des radioaktiv markierten Polyamins hinzugefügt werden. Messen Sie die Radioaktivität, die in Denbeinen gefangen ist, wie zuvor beschrieben. Bestimmen Sie ein übergeordnetes KM für die wettbewerbsorientierten Substrate, indem Sie die Aufnahme von radioaktiv markierten Polyaminen und das Vorhandensein von 100 mikromolaren oder höheren nicht-labelierten Substraten messen und eine nichtlineare Regressionsmethode verwenden, um die Kurve darzustellen.In dieser Studie wird ein Anti-Porter dadurch charakterisiert, dass er zuerst das Protein in E.coli exprimiert und dann Membranbläschen erzeugt, so dass das heterologös exprimierte Protein in einem zellfreien System untersucht werden kann. Ein westlicher Fleck wird verwendet, um zu überprüfen, ob AtBAT1 in Vesikel umgesiedelt ist. Die Untersuchung des Blots mit einem Anti-His C-terminalen Antikörper ergab ein Fusionskonstruktprotein, das etwa 72,3 Kilodaltonen beträgt.Die Verdauung der Vesikel vor SDS-PAGE führte zu einer Verminderung, aber nicht zu einem vollständigen Verlust des Sondensignals. Bei 12 Grad Celsius ist die Aufnahme eines radioaktiv markierten Spermidins durch die Vesikel mit einer Minute am höchsten und blieb über drei Minuten linear. Daher wird die Inkubationszeit für den Transporttest auf eine Minute festgelegt.Nach einer Minute gibt es keine Nettoaufnahme von Isotopen durch Membranvesik, die bei pH 8,0 hergestellt und gespeichert wurden, da es keinen Protonengradienten über der Vesikelmembran gibt. Um die Wirkung der Ableitung des künstlichen Protonengradienten zu demonstrieren, werden die Membranbläschen 10 Minuten lang im pH 8,0-Puffer inkubiert, bevor das markierte Substrat zugesetzt wird, was zu einer minimalen Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat führt. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Protonen-getriebene Aufnahme von Spermidin auf das BAT1-Protein zurückzuführen ist.Um die Substratspezifität des Proteins zu bestimmen, werden km-Werte berechnet, indem die Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat in verschiedenen Konzentrationen gemessen wird. Die Km-Werte für Spermidin, Putrescin und Arginin deuten darauf hin, dass es sich bei diesem Protein um einen hochaffinen Polyamin- und Argininaustauscher handelt. Die Affinität des Transporters für ein bestimmtes Substrat kann auch indirekt durch Wettbewerbstests bestimmt werden.Diese Assays zeigen, dass GABA ein wettbewerbsfähiger Inhibitor von Spermidin ist. Darüber hinaus zeigt die Messung der Aufnahme von 50 Mikromolaren von radioaktiv markiertem Spermidin in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen verschiedener Aminosäuren, dass AtBAT1 auch in der Lage ist, Glutamat und Alanin in Millimolarkonzentrationen zu transportieren. Bei diesem Verfahren ist die Integration des Membrantransporters in die bakterielle Membran natürlich kritisch.Die Überprüfung, ob das Protein von Interesse in die Membran integriert ist, kann mit Antikörpern durchgeführt werden, die gegen die C-Terminal-Tags gerichtet sind. Genetische Variation von menschlichen Transportern kann den Transport von, sowohl Metaboliten und Medikamente, die Substrate des jeweiligen Transporters sind beeinflussen. So kann allel Variation beeinflussen, sowohl, Aufnahme und Ausscheidung von Medikamenten.Viele allelische Varianten lassen sich durch seitlichgesteuerte Mutagenese des Transportergens in einem Expressionsvektor schnell machen. Funktionelle Assays dieser Varianten können dann unter sehr kontrollierten Bedingungen mit Inside-Out-Vesikel-Assays getestet werden. Membrantransporter machen acht bis zehn aller Proteine aus, und die Mehrheit wurde in keinem der Modellorganismen vollständig charakterisiert.Transporter, die auf Organellenmembranen lokalisiert sind, sind besonders schwierig, durch heterologe Expression in eukaryotischen Zellen zu charakterisieren. Können Austauschtyp- oder Protonentransporter auf diese E.coli-Membran lokalisiert werden, können diese Transporter mit diesem In-vitro-Assay funktionell charakterisiert werden. Die Qualität und Ausbeute der Vesikel wird durch die Rate der Elution von Zellfragmenten aus der französischen Presse beeinflusst.Bei der Transportuntersuchung von Vesikeln mit Isotopen ist es wichtig, einen experimentellen Aufbau zu haben, der experimentelle Replikationen erleichtert. Es gibt viele Möglichkeiten, dies zu tun, aber wir denken, dass es hilfreich für uns sein wird, Ihnen zu zeigen, wie wir es getan haben.

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Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

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Membrane Structure and Components

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

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Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

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