Name: characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00
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1. P1転起を伴う大腸菌ダブルノックアウト変異体の生成
<ol><li>大腸菌遺伝ストックセンター<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">(http://cgsc.biology.yale.edu)</a>から大腸菌単一ノックアウト変異株ΔPotEおよびΔCadBを取得する。 注:ΔPotE株はカナマイシン耐性26であり、ΔCadB株はテトラサイクリン耐性27</...

<ol>
	<li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins.">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li><li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li><li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUC1+and+SUC2:+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana;+expression+and+characterization+in+baker's+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein.">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li><li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development:+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds.">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li><li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance,+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis.">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li><li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cells+are+not+just+green+yeast.">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li><li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter,+Ctr1p,+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase.">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).</li><li>Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. 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Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li><li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. 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P., Shafiq, O., Meiners, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+analysis+of+Tn10+insertion+sites+in+a+collection+of+Escherichia+coli+strains+used+for+genetic+mapping+and+strain+construction.">Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).</li><li>. P1vir phage transduction Available from: <a target="_blank" href="https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction">https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction</a> (2011)</li><li>. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016</a> (2010)</li><li>Green, M. 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K., Overath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+lactose:+H++carrier+of+Escherichia+coli+and+characterization+of+galactoside+binding+and+transport.">Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport.</a> European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).</li><li>. GaphPad Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/">https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/</a> (2019)</li><li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+(ZmBT1)+from+Zea+mays.">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li><li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+chloroplast+ATP/ADP+transporter+in+E.+coli+membranes:+behind+the+Mistic+strategy.">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li><li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H+-Translocating+ATPases:+Advances+Using+Membrane+Vesicles.">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li><li>Bush, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose:+H++carrier.">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li><li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes.">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli.">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li></ol>

本研究では、まず大腸菌でタンパク質を発現し、次に膜小胞を生成し、異種発現タンパク質を無細胞系でアッセイできるようにすることにより、抗ポーターの特性評価方法を概説する。ほとんどの分子生物学ラボで見られる機器に加えて、この戦略は、フランスのプレス、超遠心分離機、および放射性同位元素アッセイを行うための施設へのアクセスを使用する必要があります。
<p...

代謝産物の密売に関与するタンパク質は、生理学的調節の本質的なレベルを構成するが、植物膜トランスポーターの大半はまだ機能的に特徴付けされていない。新規輸送タンパク質を特徴付けるために、いくつかの戦略が実施されている。酵母、ゼノプス卵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞などの大腸菌および真核細胞などのモデル生物における異種発現は、いずれもその輸送活性を決定するために使用されている1。真核細胞は真核生物タンパク質の発現に好まれ、基本的な細胞組成、シグナル伝達経路、転写および翻訳機械は、天然の条件と互換性があるからである。
酵母は、植物における新規輸送タンパク質の特性評価のための重要なモデル生物となっています。酵母(サッカロミセスポンベ)で正常に発現した最初の植物輸送タンパク質は、クロレラ2からヘキ酸トランスポーターHUP1であった。それ以来、多くの植物輸送タンパク質は、酵母発現系を用いて機能的に特徴付けられてきた。これらには、植物糖トランスポーター(SUC1およびSUC23、VfSUT1およびVfSTP14)およびオーキシントランスポーター(AUX1およびPIN5)が含まれる。植物タンパク質を発現するために酵母を利用する欠点は、酵母がこのオルガネラを欠いているため、プラスチド局在タンパク質の活性障害、6を誤って標的化し、膜タンパク質の過剰発現による酵母における誤折凝集体およびストレス応答の活性化を含むことができる。
ゼノプス卵母細胞における輸送タンパク質の異種発現は、トランスポーター10の電気生理学的特性評価のために広く使用されている。ゼノプス卵母細胞における異種発現を用いて特徴づけられた最初の植物輸送タンパク質は、アラビドプシスカリウムチャネルKAT111およびアラビドプシスヘキソプシストランスポーターSTP111であった。それ以来、ゼノプス卵母細胞は、血漿膜トランスポーター12、空胞スクローストランスポーターSUT413および空胞軟質泌トランスポーターALMT914などの多くの植物輸送タンパク質を特徴付けるために採用されている。輸送アッセイのためのゼノプス卵母細胞の重要な制限は、細胞内代謝産物の濃度が操作できないということです 1.さらに、ゼノプス卵母細胞を調製するために専門的な知識が必要であり、卵母細胞バッチの変動性を制御することは困難である。
モデル生物大腸菌における異種発現は、新規植物輸送タンパク質の特性評価の点で理想的なシステムである。完全に配列されたゲノム15では、大腸菌の分子的および生理学的特徴がよく知られている。分子ツールと技術は十分に確立されています16.加えて、異なる発現ベクター、非病原性株および変異体は、17、18、19で利用可能である。さらに、大腸菌は高い成長率を有し、実験室条件下で容易に成長することができる。多くのタンパク質は、大腸菌9において高量で容易に発現および精製することができる。タンパク質を細胞系で直接アッセイできない場合、タンパク質をリポソームに再構成することも成功していますが、精製膜タンパク質の特性評価に関する革新は困難です。植物ミトコンドリア輸送タンパク質の機能特性評価は、大豆中のリン酸トランスポーターなどの溶質トランスポーターを含む、トウモロコシ、米およびアラビドプシス、ジカルボン酸トリカルボン酸キャリアをアラビドプシス中で、このモデルシステム20、21を用いて達成されている。しかしながら、トマトタンパク質SICAT9の組換えタンパク質は再構成実験において機能的でないことが判明し、CATトランスポーターファミリーの他のメンバーはゼノプス卵母細胞アッセイ22において機能的でないことが判明した。したがって、膜トランスポーターの特性評価には追加の分子ツールが必要です。
5つのポリアミン輸送システムが大腸菌23に見られる。彼らは、スペルミジンとプトレシンの取り込みを仲介する2つのABCトランスポーター、プトレシン/オルニチン交換器、カダベリン/リジン交換器、スペルピジン輸出業者とプトレシン輸入業者が含まれます。プトレシン交換器PotEはもともと小胞アッセイを使用して特徴付けられていたが、そこではフランスのプレスで細胞をライジングし、オルニチン24と引き換えに放射性標識プトレシンの取り込みを測定することによって小胞を調製した。小胞アッセイはまた、プロトン勾配25に応答してカルシウムの輸送を媒介するカルシウムトランスポーターを特徴付けるために使用された。これらの実験は、他のポリアミン交換器の特性評価のための戦略を開発することを促しました。私たちはまず、PotEとCadB交換器で大腸菌欠乏株を作成しました。ここでは、修飾大腸菌株における異種発現による植物ポリアミン抗ポーターの機能的特徴、フランス語プレスを用いた膜小胞の生成、放射線標識アッセイを示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-putrescine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET185001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-spermidine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET522001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C arginine</td>
			<td>Moravek Inc.</td>
			<td>MC137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His (C-term)-HRP antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R931-25</td>
			<td>Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl 
			group for detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Pierce BCA protein asay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxypeptidase B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9584-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td>SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>LabGenome</td>
			<td>7777-7</td>
			<td>Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint-H</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS275</td>
			<td>scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration manifold</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>FH225V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>FA-080A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>KROGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>hawp02500</td>
			<td>0.45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up kit</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>QuickClean II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putrescine</td>
			<td>fluka</td>
			<td>32810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains :E. coli &#916;potE740(del)::kan, &#916;cadB2231::Tn10</td>
			<td>This manuscript</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td>Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Research Products</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall MTX 150</td>
			<td>46960</td>
			<td>Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>45237</td>
			<td>Centrifuge tubes for S150-AT rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector: pBAD-DEST49</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Gateway expression vector for E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles

新規膜トランスポーターを機能的に特徴付けるいくつかの方法が開発されている。ポリアミンはすべての生物において普遍的であるが、植物中のポリアミン交換器は同定されていない。ここでは、異種植物抗ポーターを発現する大腸菌細胞の分解から発生する膜小胞を用いてポリアミン抗ポーターを特徴付ける方法を概説する。まず、ポリアミンおよびアルギニン交換トランスポーターにおいて欠損した大腸菌株中のAtBAT1を異種発現した。小胞は、フランスのプレスを使用して製造され、超遠心分離によって精製され、トランスポーターの基質特異性を実証するために標識基板の膜濾過アッセイに利用された。これらのアッセイは、AtBAT1がアルギニン、γ-アミノ酪酸(GABA)、プトレシンおよびスペルミジンのプロトン媒介トランスポーターであることを実証した。AtBAT1のアッセイのために開発された変異株は、植物および動物ポリアミン交換器の他のファミリーの機能解析に有用であり得る。我々はまた、これらのタンパク質が細菌細胞膜で発現できる限り、このアプローチは他の多くのタイプの抗ポーターを特徴付けるために使用できると仮定する。大腸菌は、ネイティブトランスポーターを変異化するために使用することができる複数の方法があるので、新規トランスポーターの特性評価のための良いシステムです。

このプロトコルの主な手順は、図 1にまとめて説明します。簡単に説明すると、大腸菌細胞は、すべてのポリアミン交換器で欠損し、AtBAT1を発現し、培養、遠心分離、緩衝液で洗浄し、フランスのプレスを使用して細胞分解を行う。Lysisは、主に裏返しの小胞を産生し、細胞外の緩衝液をトラップする傾向がある。細胞破片は遠心分...

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Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

フランスのプレスを用いた大腸菌の異種発現と細胞の分解によって産生される膜小胞製剤におけるプロトン駆動膜トランスポーターの特性評価方法について説明する。

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

膜トランスポーターを特徴付けるためのこの技術の主な利点の1つは、特定の基質に対するトランスポーターの相対的な親和性を決定し、輸送メカニズムに関する洞察を得ることができることです。タンパク質勾配を利用して基質輸送を駆動する膜タンパク質の特性評価は、ここで示すこの裏返しの小胞アッセイに特に適しています。このアッセイには、フランスのプレスや超遠心分離機へのアクセスなどの特殊な機器が必要ですが、膜トランスポーターを人工リポソームに再構成する必要があるアッセイよりも技術的に簡単である可能性があると考えています。この技術の主な利点は、異なる基質の相対的な親和性を定量化し、競合する基質が輸送格子に及ぼす影響をテストするために競合アッセイを行うことができる点です。このアッセイを説明するために使用されるBAT1トランスポーターの場合、アルギニンによるトランスポーターの基質活性化を示すこともできた。この手順を開始するために、適切な抗生物質を用いてポリアミン3培地の5ミリリットルで単一コロニーを接種し、摂氏37度で一晩成長させることによって標的タンパク質を発現する調製された大腸菌変異細胞を培養する。翌日、この培養液を0.0002%アラビノースで補充された新鮮なポリアミン3培地の500ミリリットルに移し、細胞培養が0.6~0.8のOD600に達するまで増殖する。この後、遠心分離機はGの2000倍、摂氏4度で15分間、細胞ペレットを採取する。ペレットを再び懸濁し、バッファー1で3回、2000倍Gで遠心し、摂氏4度で毎回15分間洗浄します。3回目のスピンの後にバッファ1の細胞の最終体積は10ミリリットルでなければなりません。35ミリリットルのフランスの圧力セルをセットし、細胞の体に細胞の懸濁液を注ぎます。ユニットの背面にあるRHSのスイッチでマシンの電源を入れ、レシオセレクタスイッチを高に設定します。ポンプスイッチをオンにします。ピストンは、チャンバー内の空気を置き換えるためにベースから上昇し始めます。ゲージが640 PSIに達するまで圧力上昇弁を時計回りに回して圧力を上げます。これにより、10,000 PSI の内部圧力が作成されます。セルが目標圧力に達したら、フローバルブアセンブリを反時計回りに回して少し開きます。弁の開口を調整して、毎分約10滴の流量を可能にします。ピストン本体の停止線がフローセルの上部に到達すると、ポンプスイッチがオフになります。レシオセレクタスイッチを下に置いて下げ、ポンプスイッチをオンにします。底板が完全に引き込まれたら、圧力上昇弁を完全に反時計回りに回して、システム圧力をゼロに減らします。ポンプスイッチをオフにして、機械の電源を切ります。遠心分離フランスのプレス溶出物はGの10,000倍、摂氏4度で15分間、切れ目のない細胞や細胞の破片を取り除きます。ペレットを捨てて、上清を超遠心チューブに移します。超遠心伏せは、得られた上清を150,000倍Gで、摂氏4度で1時間膜小胞をペレットする。膜小胞をバッファー2に再懸濁せずに1回洗浄します。次いで、ダンス組織粉砕機を使用して、2つの緩衝液中の膜小胞を再懸濁させる。1.5ミリリットル遠心管で膜調製物の100マイクロリットルのアリコートを調製し、マイナス80°Cで保存します。まず、0.1ミリモルの塩化コバルトを含むpH 7.8でトリスの30ミリモルで小胞を洗浄し、再中断します。カルボキシペプチダーゼAを塩化ナトリウム、トリス、塩化コバルトIIに1マイクロリットルずつ加えて、各100マイクロリットルのサンプルに加えます。摂氏20度で20分間インキュベートします。消化を止めるために、ナトリウムEDTAと2-メルカプトエタノールを含む溶液を5マイクロリットル加え、PH 7.5で消化を止めます。溶液を室温で1時間インキュベートし、酵素を完全に不活性化します。次に、5~10マイクロリットルの溶液を5~10マイクロリットルの間で加え、pH 7.5~100マイクロリットルのサンプルで、5~10マイクロリットルの溶液をサンプルで分析し、電気泳動によりサンプルを分析します。アミノブロッティングを行うために、ポリアクリルアミドゲルに25ミリモルリン酸水素ナトリウムを湿らせたニトロセルロースフィルターを置く。2つの湿らせたセルロースフィルターの間にこれらを置き、最後に、2つの湿らせたプラスチック製の精練パッドの間に置きます。25ミリモルリン酸水素ナトリウムを含むチャンバーの電極の間にこの集合体を2〜4°Cの温度で置きます。20ボルトでタンパク質を電気伝達し、2〜3アンペアで3時間タンパク質を電気伝達する。ニトロセルロース膜を摂氏2度で一晩ブロッキングバッファでブロックします。翌日、抗ヒスC末端HRP抗体の20ミリリットル~5,000希釈、ブロッキングバッファーを2時間培養し、50ミリリットルのバッファーで合計60分間洗浄します。アミノブロットを可視化するには、変性アルコールの20ミリリットルに4-クロロ-1-ナフトールの6ミリグラムを溶解し、15ミリモルトリスの80ミリリットルと30%過酸化水素の50マイクロリットルを追加します。この基板溶液中の濾紙を20分間浴びる。十分な色が発達したら、膜を水ですすいで乾かします。まず、100マイクロリットルの膜小胞を摂氏12度で5分間インキュベートします。放射性標識ポリアミンを含むバッファー3を50マイクロモルの最終濃度で膜小胞に加え、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで輸送を開始する。1分間摂氏12度で輸送アッセイを行います。この後、反応混合物を濾過マニホールドに移し、0.45マイクロメートルのニトロセルロース膜フィルターを通して濾過します。10倍高濃度の非標識ポリアミンを含む氷冷アッセイバッファーを3ミリリットル加え、ポリアミンを含まないアッセイバッファーを3ミリリットル加え、非特異的結合を低減します。洗浄したフィルターを、10ミリリットルのシンチレーション液を含む20ミリリットルの使い捨てシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射能を決定する。テキストプロトコルで概説されているように、正味ポリアミンの取り込み値を計算します。標的タンパク質を発現する小胞への放射性標識基質の取り込み量を測定し、非線形回帰法を用いてミカニス・メンテン動態を計算することにより、基質のKmを決定する。競技実験では、アッセイバッファーで作られた非標識競合基板を12°Cの小胞100マイクロリットルを含む遠心管に加え、同時に50マイクロモルの放射性標識ポリアミンを添加する。先に説明したように小胞の中に閉じ込められた放射能を測定する。放射性標識ポリアミンの取り込みと100マイクロモル以上の非標識基板の存在を測定し、非線形回帰法を使用して曲線をプロットすることにより、競合基板の親KMを決定します。この研究では、抗ポーターは、まず大腸菌でタンパク質を発現し、次に異種発現タンパク質を無細胞系でアッセイできるように膜小胞を生成することを特徴とする。ウェスタンブロットは、AtBAT1が小胞に転置されていることを確認するために使用されます。抗HisC末端抗体でブロットを調査すると、約72.3キロダルトンの融合構築タンパク質が明らかになった。SDS-PAGEより前の小胞の消化は減少をもたらしたが、プローブ信号の完全な損失ではなかった。摂氏12度では、小胞による放射性標識されたスペルミジンの取り込みは1分で最も高く、3分間にわたって直線的であった。従って、輸送アッセイのためのインキュベーション時間は1分に固定される。1分後、小胞膜全体にプロトン勾配がないため、pH 8.0で調製され保存された膜小胞による同位体の正味取り込みはありません。人工プロトン勾配の散逸の効果を実証するために、膜小胞は標識された基質の付加の前に10分間pH 8.0バッファーでインキュベートされ、放射標識された基質の最小取り込みにつながる。まとめると、これらの結果は、スペルミジンのプロトン駆動の取り込みがBAT1タンパク質によるものであることを示している。タンパク質の基質特異性を決定するために、Km値は、異なる濃度での放射性標識基質の取り込み量を測定することによって計算される。スペルミジン、プトレシン、アルギニンのKm値は、このタンパク質が高親和性ポリアミンおよびアルギニン交換器であることを示しています。特定の基質に対するトランスポーターの親和性は、競争アッセイを用いて間接的に決定することもできる。これらのアッセイは、GABAがスペルミジンの競合性阻害剤であることを明らかにします。さらに、異なるアミノ酸の様々な濃度の存在下で放射性標識されたスペルミジンの50マイクロモルの取り込みの取り込み量を測定すると、AtBAT1はミリモル濃度でグルタミンおよびアラニンを輸送できることも明らかになる。この手順を行う場合、膜トランスポーターを細菌膜に集積することは、明らかに、重要である。目的のタンパク質が膜に統合されていることを確認するには、C末端タグに対する抗体を使用して行うことができます。ヒトトランスポーターの遺伝的変異は、特定のトランスポーターの基質である代謝産物および薬物の輸送に影響を及ぼす可能性がある。したがって、アグリスの変動は、薬物の取り込みおよび排泄の両方に影響を及ぼす可能性がある。多くの対立遺伝子変異体は、発現ベクターにおけるトランスポーター遺伝子の左右方向変異生成によって迅速に作製することができる。これらの変異体の機能アッセイは、その後、内部のベシクルアッセイを使用して非常に制御された条件下でテストすることができます。膜トランスポーターは、すべてのタンパク質の8〜10を構成し、大部分は、モデル生物のいずれかで完全に特徴付けられていない。オルガネラ膜に局在するトランスポーターは、真核細胞の異種発現によって特徴付けるのが特に困難です。交換タイプまたはプロトン媒介性トランスポーターがこの大腸菌膜に局在化できる場合、これらのトランスポーターは、このインビトロアッセイを使用して機能的に特徴づけることができる。小胞の質と収率は、フランスのプレスからの細胞断片の溶出速度によって影響を受ける。同位体を用いた小胞の輸送アッセイを行う際には、実験複製を容易にする実験用セットアップを行うことが重要である。これを行う方法はたくさんありますが、私たちがどのようにやってきたかを示すのが役に立つと思います。

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Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Cell Membrane Structure and Functions

Membrane Structure and Components

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