Name: characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles at JoVE.com

El apoyo a este proyecto vino de la BGSU Graduate College, y la Oficina de Programas Patrocinados e Investigación de BGSU.

1. Generación del Mutante Doble Knock Out de E. coli con Transducción P1
<ol><li>Obtenga las cepas mutantes de un solo knockout de E. coli, el Centro de Valores Genéticos de E. coli (<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">http://cgsc.biology.yale.edu</a>). NOTA: La cepa de la variedad de la variedad de la sr. Es resistente a la kanamicina26 y la cepa de CadB es resistente a la tetraciclina<sup ...

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	<li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins.">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li><li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li><li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUC1+and+SUC2:+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana;+expression+and+characterization+in+baker's+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein.">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li><li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development:+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds.">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li><li>Huang, J. 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Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li><li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. 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GaphPad Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/">https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/</a> (2019)</li><li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+(ZmBT1)+from+Zea+mays.">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li><li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+chloroplast+ATP/ADP+transporter+in+E.+coli+membranes:+behind+the+Mistic+strategy.">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li><li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H+-Translocating+ATPases:+Advances+Using+Membrane+Vesicles.">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li><li>Bush, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose:+H++carrier.">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li><li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes.">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli.">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li></ol>

En el presente estudio, delineamos un método para la caracterización de un antiportador expresando primero la proteína en E. coli y luego generando vesículas de membrana, de modo que la proteína expresada heterólogamente puede ser ensayada en un sistema libre de células. Además de los equipos que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología molecular, esta estrategia requiere el uso de una prensa francesa, una ultracentrífuga y el acceso a una instalación para llevar a cabo ensayos de ...

Las proteínas implicadas en el tráfico de metabolitos constituyen un nivel esencial de regulación fisiológica, pero la gran mayoría de los transportadores de membranas vegetales aún no se han caracterizado funcionalmente. Se han implementado varias estrategias para caracterizar las nuevas proteínas de transporte. La expresión hetróloga en organismos modelo como E. coli y células eucariotas como levaduras, ovocitos de Xenopus, células de mamíferos, células de insectos y células vegetales se han utilizado para determinar su actividad de transporte1. Las células eucariotas son favorecidas por la expresión de proteínas eucariotas, ya que la composición celular básica, las vías de transducción de señales, la transcripción y las máquinas de traducción son compatibles con las condiciones nativas.
La levadura ha sido un organismo modelo importante para la caracterización de nuevas proteínas de transporte en las plantas. La primera proteína de transporte vegetal que se expresó con éxito en levadura (Saccharomyces pombe) fue el transportador de hexosa HUP1 de Chlorella2. Desde entonces, muchas proteínas de transporte de plantas se han caracterizado funcionalmente utilizando un sistema de expresión de levadura. Estos incluyen, los transportadores de azúcar vegetal (SUC1 y SUC23, VfSUT1 y VfSTP14) y los transportadores de auxin (AUX1 y PIN5). Las desventajas de utilizar levadura para expresar proteínas vegetales pueden incluir deterioro de la actividad de las proteínas localizadas por plastid porque la levadura carece de este orgánulo, el objetivo erróneo6, y la formación de agregados mal plegados y la activación de respuestas de estrés en la levadura debido a la sobreexpresión de proteínas de membrana7,8,9.
La expresión heteróloga de proteínas de transporte en los ovocitos Xenopus ha sido ampliamente utilizada para la caracterización electrofisiológica de los transportadores10. Las primeras proteínas de transporte vegetal caracterizadas por expresión hetróloga en los ovocitos de Xenopus fueron el canal de potasio Arabidopsis KAT110 y el transportador de hexosa Deabidopsis STP111. Desde entonces, los ovocitos de Xenopus se han empleado para caracterizar muchas proteínas de transporte vegetal como los transportadores de membrana plasmática12, transportador de sacarosa vacuola raquídor SUT413 y transportador de malatovacuo ALMT914. Una limitación importante de los ovocitos de Xenopus para los ensayos de transporte es que la concentración de metabolitos intracelulares no puede ser manipulada1. Además, se requieren conocimientos profesionales para preparar los ovocitos de Xenopus y la variabilidad de los lotes de ovocitos es difícil de controlar.
La expresión heteróloga en el organismo modelo E. coli es un sistema ideal en términos de caracterización de nuevas proteínas de transporte vegetal. Con un genoma15completamente secuenciado, las características moleculares y fisiológicas de E. coli son bien conocidas. Las herramientas y técnicas moleculares están bien establecidas16. Además, diferentes vectores de expresión, cepas no patógenas y mutantes están disponibles17,18,19. Además, E. coli tiene una alta tasa de crecimiento y se puede cultivar fácilmente en condiciones de laboratorio. Muchas proteínas se pueden expresar y purificar fácilmente en grandes cantidades en E. coli9. Cuando las proteínas no se pueden ensayo directamente en los sistemas celulares, la reconstitución de proteínas en liposomas también ha sido una innovación exitosa, aunque desafiante para la caracterización de proteínas de membrana purificadas. La caracterización funcional de las proteínas de transporte mitocondrial vegetal, incluidos los transportadores de solutos como los transportadores de fosfato en soja, maíz, arroz y Arabidopsis, portadorde de dicarboxilato-tricarboxilato en Arabidopsis, se han logrado utilizando este sistema modelo20,21. Sin embargo, se encontró que las proteínas recombinantes de la proteína de tomate SICAT9 no eran funcionales en experimentos de reconstitución, y se encontró que otros miembros de la familia de transportadores CAT no eran funcionales en los ensayos de ovocitos del xenopus 22. Por lo tanto, se necesitan herramientas moleculares adicionales para la caracterización de los transportadores de membranas.
Cinco sistemas de transporte de poliamina se encuentran en E. coli23. Incluyen dos transportadores ABC que median la toma de espermidina y putrescina, un intercambiador de putrescina/ornitina, un intercambiador de cadaverina/lisina, un exportador de espermadina y un importador de putrescina. El intercambiador de putrescina PotE se caracterizó originalmente utilizando un ensayo de vesícula, donde de adentro hacia afuera se preparaban vesículas cortando células con una prensa francesa y midiendo la toma de putrescina radioetiquetada en las vesículas a cambio de ornitina24. Los ensayos de vesículas también se utilizaron para caracterizar a un transportador de calcio, que mediaba en el transporte de calcio en respuesta a un gradiente de protones25. Estos experimentos nos llevaron a desarrollar una estrategia para la caracterización de otros intercambiadores de poliamina. Primero creamos una cepa de E. coli deficiente en intercambiadores PotE y CadB. Aquí, demostramos la caracterización funcional de una planta antiportadora de poliamina por expresión heterlomea en la cepa modificada de E. coli, generación de vesículas de membrana utilizando una prensa francesa y ensayos radiomarcados.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-putrescine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET185001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-spermidine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET522001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C arginine</td>
			<td>Moravek Inc.</td>
			<td>MC137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His (C-term)-HRP antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R931-25</td>
			<td>Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl 
			group for detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Pierce BCA protein asay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxypeptidase B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9584-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td>SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>LabGenome</td>
			<td>7777-7</td>
			<td>Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint-H</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS275</td>
			<td>scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration manifold</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>FH225V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>FA-080A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>KROGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>hawp02500</td>
			<td>0.45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up kit</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>QuickClean II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putrescine</td>
			<td>fluka</td>
			<td>32810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains :E. coli &#916;potE740(del)::kan, &#916;cadB2231::Tn10</td>
			<td>This manuscript</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td>Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Research Products</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall MTX 150</td>
			<td>46960</td>
			<td>Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>45237</td>
			<td>Centrifuge tubes for S150-AT rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector: pBAD-DEST49</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Gateway expression vector for E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles

Se han desarrollado varios métodos para caracterizar funcionalmente a los nuevos transportadores de membranas. Las poliaminas son omnipresentes en todos los organismos, pero no se han identificado intercambiadores de poliamina en las plantas. Aquí, delineamos un método para caracterizar los antiportadores de poliamina utilizando vesículas de membrana generadas a partir de la lisis de Escherichia coli cells hetrólogamente expresando un antiportador vegetal. En primer lugar, expresamos heterologousamente AtBAT1 en una cepa de E. coli deficiente en transportadores de intercambio de poliamina y arginina. Las vesículas se produjeron utilizando una prensa francesa, purificadas por ultracentrifugación y utilizadas en un ensayo de filtración por membrana de sustratos etiquetados para demostrar la especificidad del sustrato del transportador. Estos ensayos demostraron que AtBAT1 es un transportador mediado por protones de arginina, ácido aminobutírico (GABA), putrescina y espermidina. La cepa mutante que se desarrolló para el ensayo de AtBAT1 puede ser útil para el análisis funcional de otras familias de intercambiadores de poliaminas vegetales y animales. También hipotetizamos que este enfoque se puede utilizar para caracterizar muchos otros tipos de antiportadores, siempre y cuando estas proteínas se puedan expresar en la membrana celular bacteriana. E. coli es un buen sistema para la caracterización de nuevos transportadores, ya que hay múltiples métodos que se pueden emplear para mutagenizar a los transportadores nativos.

Los pasos principales de este protocolo se resumen pictóricamente en la Figura 1. Brevemente, las células de E. coli deficientes en todos los intercambiadores de poliamina y la expresión de AtBAT1 son cultivadas, centrifugadas, lavadas con un tampón y sometidas a lisis celular utilizando una prensa francesa. La lisis tiende a producir vesículas que son en su mayoría de adentro hacia afuera y atrapan el tampón fuera de las células. Lo...

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Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Describimos un método para la caracterización de transportadores de membrana impulsados por protones en preparaciones de vesículas de membrana producidas por la expresión heteróloga en E. coli y lisis de células utilizando una prensa francesa.

Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Una de las principales ventajas de esta técnica para caracterizar los transportadores de membrana es que se puede determinar la afinidad relativa del transportador para sustratos específicos, así como obtener información sobre el mecanismo de transporte. La caracterización de las proteínas de membrana que utilizan gradientes proteicos para impulsar el transporte del sustrato es particularmente adecuada para este ensayo de vesículas de adentro hacia afuera que demostramos aquí. Si bien este ensayo requiere algunos equipos especializados, como una prensa francesa y acceso a una ultracentrífuga, creemos que puede ser técnicamente más fácil que los ensayos que requieren que los transportadores de membranas se reconstituyen en liposomas artificiales.La principal ventaja de esta técnica es que nos permite cuantificar las afines relativas para diferentes sustratos y realizar ensayos de competición para probar el efecto de los sustratos competidores en las rejillas de transporte. En el caso del transportador BAT1 utilizado para ilustrar este ensayo, también pudimos mostrar la activación del sustrato del transportador por arginina. Para comenzar este procedimiento, cultiva las células mutantes E.coli preparadas que expresan la proteína diana inoculando una sola colonia en cinco mililitros de poliamina 3 medios con antibióticos apropiados y creciendo durante la noche a 37 grados centígrados.Al día siguiente, transferir este cultivo a 500 mililitros de poliamina fresca 3 medios que se complementa con 0.0002%arabinose y crecer hasta que el cultivo celular alcanza un OD600 de entre 0.6 y 0.8. Después de esto, centrifugar a 2000 veces G y a cuatro grados Celsius durante 15 minutos para recoger el pellet celular. Vuelva a suspender el pellet y lávelo tres veces con el tampón uno centrifugando a 2000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos cada vez.El volumen final de celdas en el búfer uno después del tercer giro debe ser de 10 mililitros. Establecer una célula de presión francesa de 35 mililitros y verter la suspensión celular en el cuerpo de la célula. Encienda la máquina con el interruptor en el RHS en la parte posterior de la unidad y ajuste el selector de relación a alto.Encienda el interruptor de la bomba. El pistón comenzará a subir desde la base para desplazar el aire en la cámara. Aumente la presión girando la válvula de aumento de presión en el sentido de las agujas del reloj hasta que el medidor alcance 640 PSI.Esto creará una presión interna de 10.000 PSI. Una vez que la celda haya alcanzado la presión objetivo, abra ligeramente el conjunto de la válvula de flujo girándola en sentido contrario a las agujas del reloj. Ajuste la apertura de la válvula para permitir un caudal de solo 10 gotas por minuto.Cuando la línea de tope en el cuerpo del pistón alcanza la parte superior de la celda de flujo, la bomba se apaga. Baje la placa inferior colocando el selector de relación hacia abajo y, a continuación, activando el interruptor de la bomba. Cuando la placa inferior esté completamente retraída, reduzca la presión del sistema a cero girando la válvula de aumento de presión completamente en sentido contrario a las agujas del reloj.Apague el interruptor de la bomba y apague la máquina. Centrifugar el eluant de prensa francés a 10.000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos para eliminar las células ininterrumpidas y los desechos celulares. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga.Ultracentrífaza el sobrenadante resultante a 150.000 veces G y a cuatro grados Celsius durante una hora para peletizar las vesículas de membrana. Lave las vesículas de membrana una vez sin volver a suspendido en el tampón dos. Luego, utilice una amoladora de tejido Dounce para volver a suspender las vesículas de membrana en el búfer dos.Preparar 100 microlitros alícuotas de los preparados de membrana en tubos centrífugos de 1,5 mililitros y almacenarlos en menos 80 Grados Centígrados. En primer lugar, lavar y volver a suspender las vesículas en 30 mililitros de Tris a pH 7,8, que contiene 0,1 milivola de cloruro de cobalto II. Agregue un microlitro de carboxepepeposa A en cloruro de sodio, Tris y cloruro de cobalto II a cada muestra de 100 microlitros.Incubar a 20 grados centígrados durante 20 minutos. Añadir cinco microlitros de una solución que contenga EDTA sódico y 2-Mercaptoetanol a PH 7.5 para detener la digestión. Incubar la solución a temperatura ambiente durante una hora para inactivar completamente la enzima.A continuación, añadir entre cinco y 10 microlitros de una solución que contenga dodecil sulfato de litio, glicerol, azul bromopol y Tris a pH 7,5 a 100 microlitros de la muestra y analizar muestras por electroforesis. Para realizar una hinchazón amino, ponga un filtro de nitrocelulosa humedecido con fosfato de hidrógeno sódico de 25 milimolar sobre el gel de poliacrilamida. Colóquelos entre dos filtros de celulosa humedecidos y, finalmente, entre dos almohadillas de plástico humedecido.Coloque este conjunto entre los electrodos de una cámara que contenga 25 mililitros de fosfato de hidrógeno sódico milimolar a una temperatura de entre dos y cuatro grados centígrados. Electrotransferar las proteínas a 20 voltios y a dos o tres amperios durante tres horas. Bloquee la membrana de nitrocelulosa en el tampón de bloqueo durante la noche a dos grados centígrados.Al día siguiente, incubar la nitrocelulosa a 20 mililitros de uno a 5.000 dilución de anticuerpos anti-su C-terminal HRP y tampón de bloqueo durante dos horas y lavar dos veces con 50 mililitros de tampón durante un total de 60 minutos. Para visualizar la mancha amino, disolver seis miligramos de 4-cloro-1-naftol en 20 mililitros de alcohol desnaturalado y añadir 80 mililitros de 15 tris mililolares y 50 microlitros de 30%peróxido de hidrógeno. Bañe el papel de filtro en esta solución de sustrato durante 20 minutos.Cuando se haya desarrollado suficiente color, enjuague la membrana con agua y deje que se seque. Para empezar, incubar la alícuota de 100 microlitros de vesículas de membrana a 12 grados centígrados durante cinco minutos. Añadir el tampón 3 que contenga poliaminas radiomarcadas a una concentración final de 50 micromolares a las vesículas de membrana en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para iniciar el transporte.Lleve a cabo el ensayo de transporte a 12 grados centígrados durante un minuto. Después de esto, transfiera las mezclas de reacción al colector de filtración y filtre a través de un filtro de membrana de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros. Añadir tres mililitros de tampón de ensayo helado que contenga una concentración diez veces mayor de poliaminas sin etiquetar, seguidos de tres mililitros de tampón de ensayo sin las poliaminas para reducir la unión no específica.Transfiera los filtros lavados a viales de centelleo desechables de 20 mililitros que contengan 10 mililitros de líquido de centelleo, y utilice un contador de centelleo líquido para determinar la radiactividad. Calcule la absorción neta de poliamina como se describe en el protocolo de texto. Determinar el Km para el sustrato midiendo la absorción de sustrato radiomarcado en vesículas expresando la proteína diana y calcular la cinética Michaelis-Menten utilizando un método de regresión no lineal.Para los experimentos de competición, añada el sustrato competitivo no etiquetado fabricado en el tampón de ensayo al tubo centrífugo que contiene 100 microlitros de vesículas a 12 grados centígrados y, al mismo tiempo, añada 50 micromolares de la poliamina radiomarcada. Mida la radiactividad atrapada dentro de las vesículas como se describió anteriormente. Determinar un KM padre para los sustratos competitivos midiendo la absorción de poliaminas radiomarcadas y la presencia de 100 sustratos micromolares o no etiquetados superiores y utilizar un método de regresión no lineal para trazar la curva.En este estudio, un anti-portero se caracteriza por expresar primero la proteína en E.coli, y luego, generar vesículas de membrana para que la proteína expresada heterólogamente pueda ser ensayada en un sistema libre de células. Una mancha occidental se utiliza para verificar que AtBAT1 se translota a vesícula. El sondeo de la mancha con un anticuerpo C-terminal anti-su revelación de una proteína de construcción de fusión que es aproximadamente 72,3 kilodaltons.La digestión de las vesículas antes de SDS-PAGE dio lugar a una disminución, pero no una pérdida completa de la señal de la sonda. A 12 grados Celsius, la captación de una espermicida radiomarcada por las vesículas es más alta en un minuto y permaneció lineal durante tres minutos. Por lo tanto, el tiempo de incubación para el ensayo de transporte se fija en un minuto.Después de un minuto, no hay absorción neta de isótopos por vesículas de membrana que fueron preparadas y almacenadas a pH 8.0, ya que no hay gradiente de protones a través de la membrana vesícula. Para demostrar el efecto de la disipación del gradiente de protones artificiales, las vesículas de membrana se incuban en pH 8.0 tampón durante 10 minutos antes de la adición del sustrato etiquetado, lo que conduce a una absorción mínima del sustrato radiomarcado. En conjunto, estos resultados indican que la absorción de espermatozoides impulsada por protones se debe a la proteína BAT1.Para determinar la especificidad del sustrato de la proteína, los valores de Km se calculan midiendo la absorción del sustrato radiomarcado en diferentes concentraciones. Los valores de Km para espermidina, putresina, y arginina indican que esta proteína es un intercambiador de poliamina y arginina de alta afinidad. La afinidad del transportador para un sustrato en particular también se puede determinar indirectamente mediante el uso de ensayos de competencia.Estos ensayos revelan que GABA es un inhibidor competitivo de la espermilina. Además, la medición de la absorción de 50 micromolares de espermidina radiomarcada en presencia de concentraciones variables de diferentes aminoácidos revela que AtBAT1 también es capaz de transportar glutamato y alanina a concentraciones milimolares. Al realizar este procedimiento, la integración del transportador de membrana en la membrana bacteriana es, obviamente, crítica.La verificación de que la proteína de interés está integrada en la membrana se puede hacer utilizando anticuerpos dirigidos contra las etiquetas C-terminal. La variación genética de los transportadores humanos puede afectar al transporte de metabolitos y fármacos que son sustratos del transportador en particular. Por lo tanto, la variación alélica puede afectar, tanto, la absorción y la excreción de drogas.Muchas variantes alélicas pueden ser rápidamente hechas por mutagénesis dirigida lateralmente del gen transportador en un vector de expresión. Los ensayos funcionales de estas variantes se pueden probar en condiciones muy controladas utilizando ensayos de vesículas de adentro hacia afuera. Los transportadores de membrana constituyen de ocho a 10 de todas las proteínas y la mayoría no se han caracterizado completamente en ninguno de los organismos modelo.Los transportadores que están localizados en las membranas de los orgánulos son particularmente difíciles de caracterizar por la expresión heteróloga en las células eucariotas. Si los transportadores de tipo de intercambio o mediados por protones se pueden localizar a esta membrana de E.coli, estos transportadores pueden caracterizarse funcionalmente utilizando este ensayo in vitro. La calidad y el rendimiento de las vesículas se ve afectada por la tasa de elución de fragmentos celulares de la prensa francesa.Al realizar ensayos de transporte de vesículas con isótopos, es importante tener una configuración experimental que facilite la realización de réplicas experimentales. Hay muchas maneras de hacer esto, pero creemos que será útil para nosotros mostrarle cómo lo hemos hecho.

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Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

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Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

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