Name: characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles at JoVE.com

Bu proje için destek BGSU Graduate College ve BGSU Ofis Sponsorprogramları ve Araştırma geldi.

1. P1 Transdüksiyonlu E. coli Double Knock Out Mutant Üretimi
<ol><li>E. coli Genetik Stok Merkezi'nden ΔPotE ve ΔCadB <a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">(http://cgsc.biology.yale.edu)</a> e. coli tek nakavt mutant suşları edinin. NOT: ΔPotE suşu kanamisin edayanıklı26 ve ΔCadB suşu tetrasikline dayanıklıdır 27.</li>
	<li>P1 transdüksiyon protokolü<sup c...

<ol>
	<li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins.">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li><li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li><li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUC1+and+SUC2:+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana;+expression+and+characterization+in+baker's+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein.">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li><li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development:+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds.">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li><li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance,+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis.">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li><li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cells+are+not+just+green+yeast.">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li><li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+dynamics+of+aggresome+formation+by+a+cytosolic+GFP-chimera.">Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera.</a> Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).</li><li>Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter,+Ctr1p,+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase.">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+an+inward-rectifying+potassium+channel+by+the+Arabidopsis+KAT1+cDNA.">Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA.</a> Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).</li><li>Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+plant+plasma+membrane+transporter+in+Xenopus+oocytes.">Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes.</a> FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).</li><li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters.">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).</li><li>Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+LjSUT4,+a+vacuolar+sucrose+transporter+from+Lotus+japonicus.">Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).</li><li>Kovermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+vacuolar+malate+channel+is+a+member+of+the+ALMT+family.">The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family.</a> The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).</li><li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli.">Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).</li><li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+membrane+proteins:+choosing+the+appropriate+host.">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).</li><li>Takabatake, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cDNAs+encoding+mitochondrial+phosphate+transporters+in+soybean,+maize,+rice,+and+Arabidopis.">Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis.</a> Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).</li><li>Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+transporter+for+dicarboxylates+and+tricarboxylates+in+plant+mitochondria.+Bacterial+expression,+reconstitution,+functional+characterization,+and+tissue+distribution.">Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li><li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tonoplast+Glu/Asp/GABA+exchanger+that+affects+tomato+fruit+amino+acid+composition.">A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition.</a> The Plant Journal. 81 (5), (2015).</li><li>Kashiwagi, K., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+assays+of+polyamine+transport+systems+in+Escherichia+coli+and+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).</li><li>Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+of+putrescine+by+the+putrescine-ornithine+antiporter+encoded+by+the+potE+gene+of+Escherichia+coli.">Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).</li><li>Tsuchiya, T., Rosen, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transport+driven+by+a+proton+gradient+and+inverted+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli.">Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+analysis+of+Tn10+insertion+sites+in+a+collection+of+Escherichia+coli+strains+used+for+genetic+mapping+and+strain+construction.">Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).</li><li>. P1vir phage transduction Available from: <a target="_blank" href="https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction">https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction</a> (2011)</li><li>. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016</a> (2010)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+biochinic+acid.">Measurement of protein using biochinic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Wright, J. K., Overath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+lactose:+H++carrier+of+Escherichia+coli+and+characterization+of+galactoside+binding+and+transport.">Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport.</a> European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).</li><li>. GaphPad Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/">https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/</a> (2019)</li><li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+(ZmBT1)+from+Zea+mays.">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li><li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+chloroplast+ATP/ADP+transporter+in+E.+coli+membranes:+behind+the+Mistic+strategy.">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li><li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H+-Translocating+ATPases:+Advances+Using+Membrane+Vesicles.">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li><li>Bush, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-coupled+sugar+and+amino+acid+transporters+in+plants.">Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants.</a> Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).</li><li>Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+membrane+vesicle+from+Escherichea+coli+prepared+by+different+procedures.">Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures.</a> Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).</li><li>Seckler, R., Wright, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose:+H++carrier.">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li><li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes.">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli.">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li></ol>

Bu çalışmada, önce E. coli'deki proteini ifade ederek ve daha sonra membran vezikülleri üreterek bir antiporterın karakterizasyonu için bir yöntem özetleyilmiştir, böylece heterolog olarak ifade edilen protein hücresiz bir sistemde doğrulanabilir. Çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan ekipmana ek olarak, bu strateji bir Fransız basını, ultracentrifuge ve radyoizotop tahlilleri yapmak için bir tesise erişim gerektirir.
Bu tekniğin temel gereksinimlerin...

Metabolitlerin ticaretinde rol oynayan proteinler fizyolojik düzenlemenin temel bir düzeyini oluşturmaktadır, ancak bitki zarı taşıyıcılarının büyük çoğunluğu henüz işlevsel olarak karakterize edilmemiştir. Yeni taşıma proteinlerini karakterize etmek için çeşitli stratejiler uygulanmıştır. E. coli gibi model organizmalarda heterolog ekspresyon ve maya, Kenopus oositleri, memeli hücreleri, böcek hücreleri ve bitki hücreleri gibi ökaryotik hücreler taşıma aktivitelerini belirlemek için kullanılmıştır1. Ökaryotik hücreler ökaryotik proteinlerin ekspresyonu için tercih edilir, çünkü temel hücresel bileşim, sinyal transducing yolları, transkripsiyon ve çeviri makineleri yerli koşullarla uyumludur.
Maya bitkilerde yeni taşıma proteinleri karakterizasyonu için önemli bir model organizma olmuştur. Başarıyla maya ifade edildi ilk bitki taşıma proteini(Saccharomyces pombe) Chlorella2heksoz taşıyıcı HUP1 oldu. O zamandan beri, birçok bitki taşıma proteinleri fonksiyonel bir maya ifade sistemi kullanılarak karakterize edilmiştir. Bunlar, bitki şekeri taşıyıcıları (SUC1 ve SUC23, VfSUT1 ve VfSTP14)ve auxin taşıyıcılar (AUX1 ve PIN5)içerir. Bitki proteinlerini ifade etmek için maya kullanmanın dezavantajları, mayanın bu organelden yoksun olması, yanlış hedeflenme6, yanlış katlanmış agregaların oluşumu ve membran proteinlerinin aşırı ekspresyonuna bağlı olarak mayadaki stres tepkilerinin aktivasyonu7,8,9.
Xenopus oositlerinde taşıma proteinlerinin heterolog ekspresyonu10taşıyıcıların elektrofizyolojik karakterizasyonu nda yaygın olarak kullanılmaktadır. Xenopus oositlerinde heterolog ekspresyon kullanılarak karakterize edilen ilk bitki taşıma proteinleri Arabidopsis potasyum kanalı KAT110 ve Arabidopsis heksoz taşıyıcısı STP111idi. O zamandan beri, Xenopus oositler plazma membran taşıyıcıları 12 gibi birçok bitki taşıma proteinleri karakterize etmek için istihdam edilmiştir12,vacuolar sakaroz taşıyıcı SUT413 ve vacuolar malate taşıyıcı ALMT914. Xenopus oositlerinin taşıma tahlilleri için önemli bir sınırlama hücre içi metabolitlerin konsantrasyonunun manipüle edilemeyeceğidir1. Ayrıca, profesyonel bilgi Xenopus oositler hazırlamak için gereklidir ve oosit toplu değişkenlik kontrol etmek zordur.
E. coli modelinde heterolog ifade, yeni bitki taşıma proteinlerinin karakterizasyonu açısından ideal bir sistemdir. Tam sekanslı genom15ile E. coli'nin moleküler ve fizyolojik özellikleri iyi bilinmektedir. Moleküler araçlar ve teknikler iyi16kurulmuştur. Buna ek olarak, farklı ekspresyon vektörleri, patojenik olmayan suşlar ve mutantlar mevcuttur17,18,19. Ayrıca, E. coli yüksek bir büyüme hızına sahiptir ve laboratuvar koşullarında kolayca yetiştirilebilir. Birçok protein kolayca ifade edilebilir ve E. coliyüksek miktarlarda saflaştırılmış9. Proteinler hücresel sistemlerde doğrudan titreşemediğinde, proteinlerin lipozomlara dönüştürülmesi de başarılı olmuştur, ancak saflaştırılmış membran proteinlerinin karakterizasyonu için zorlu bir yenilik olmuştur. Soya fasulyesi, mısır, pirinç ve Arabidopsis, Arabidosil-trikarboksilit taşıyıcı gibi soya, mısır, pirinç ve Arabidopsis, dikarboksilat-trikarboksilat taşıyıcı gibi solute taşıyıcılar da dahil olmak üzere bitki mitokondriyal taşıma proteinleri fonksiyonel karakterizasyonu bu model sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir20,21. Ancak, domates proteini SICAT9 rekombinant proteinlerreconstitution deneylerde fonksiyonel olmayan bulundu, ve CAT taşıyıcı ailesinin diğer üyeleri Xenopus oosit tahlilleri fonksiyonel olmayan bulundu22. Bu nedenle membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için ek moleküler araçlara ihtiyaç vardır.
E. coli23'tebeş poliamin taşıma sistemi bulunur. Bunlar spermidin ve putrescine alımı aracılık iki ABC taşıyıcılar, bir putrescine / ornitin eşanjör, bir kadavra / lizin değiştirici, bir spermidin ihracatçısı ve putrescine ithalatçısı içerir. Putrescine değiştirici PotE başlangıçta bir vezikül titreği kullanılarak karakterize edildi, iç dış veziküller bir Fransız basın ıskarta hücreleri lysing tarafından hazırlanan ve ornithine karşılığında veziküller içine radiolabeled putrescine alımını ölçme24. Vezikül tahlilleri de bir proton gradyan25yanıt olarak kalsiyum taşıma aracılık bir kalsiyum taşıyıcı karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu deneyler bizi diğer poliamin eşanjörleri karakterizasyonu için bir strateji geliştirmek için istenir. Biz ilk PotE ve CadB değiştiriciler E. coli eksik bir gerginlik oluşturdu. Burada, modifiye E. coli suşunda heterlogous ifade ile bir bitki poliamin antiporter fonksiyonel karakterizasyonu göstermek, bir Fransız basın kullanarak membran vezikülüretimi, ve radiolabeled tahliller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-putrescine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET185001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3H-spermidine</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET522001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14C arginine</td>
			<td>Moravek Inc.</td>
			<td>MC137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-His (C-term)-HRP antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R931-25</td>
			<td>Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl 
			group for detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Pierce BCA protein asay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxypeptidase B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9584-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td>SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>LabGenome</td>
			<td>7777-7</td>
			<td>Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecoscint-H</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS275</td>
			<td>scintillation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration manifold</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>FH225V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>Glen Mills</td>
			<td>FA-080A120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>KROGER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS-6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>hawp02500</td>
			<td>0.45 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up kit</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td>QuickClean II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putrescine</td>
			<td>fluka</td>
			<td>32810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains :E. coli &#916;potE740(del)::kan, &#916;cadB2231::Tn10</td>
			<td>This manuscript</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td>Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Research Products</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall MTX 150</td>
			<td>46960</td>
			<td>Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>45237</td>
			<td>Centrifuge tubes for S150-AT rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector: pBAD-DEST49</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Gateway expression vector for E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of membrane transporters by heterologous expression in e. coli and production of membrane vesicles

Yeni membran taşıyıcıları işlevsel olarak karakterize etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Poliaminler tüm organizmalarda her yerde bulunur, ancak bitkilerdeki poliamin eşanjörleri tanımlanmamıştır. Burada, escherichia coli hücrelerinin lysis'inden üretilen membran vezikülleri kullanarak poliamin antiporterlarını karakterize eden bir yöntem inanışı bir bitki antiporterını heterologolarak ifade eder. İlk olarak, atbat1'i poliamin ve arginin değişim taşıyıcılarında eksik olan Bir E. coli süzmesinde heterolog olarak ifade ettik. Veziküller bir Fransız presi kullanılarak üretildi, ultrasantrifüj ile saflaştırılmış ve taşıyıcının substrat özgüllüğünü göstermek için etiketli substratların membran filtrasyon telinde kullanıldı. Bu tahliller AtBAT1 arginin bir proton aracılı taşıyıcı olduğunu gösterdi, γ-aminobutirik asit (GABA), putrescine ve spermidin. AtBAT1 tahlil için geliştirilen mutant suşu bitki ve hayvan poliamin eşanjörlerin diğer ailelerin fonksiyonel analizi için yararlı olabilir. Ayrıca bu proteinler bakteri hücre zarında ifade edilebildiği sürece, bu yaklaşımın diğer birçok antiporter türünü karakterize etmek için kullanılabileceğini de varsayız. E. coli, yerli taşıyıcıları susturmak için kullanılan birden fazla yöntem olduğundan, yeni taşıyıcıların karakterizasyonu için iyi bir sistemdir.

Bu protokoldeki önemli adımlar Şekil 1'deresimsel olarak özetlenmiştir. Kısaca, Tüm poliamin eşanjörleri eksik ve AtBAT1 ifade E. coli hücreleri kültürlü, santrifüj, bir tampon ile yıkanmış ve bir Fransız basın ıslatır tabi. Lysis çoğunlukla iç-dış veziküller üretmek ve hücrelerin dışında tampon tuzak eğilimindedir. Hücre enkazı santrifüj ile kaldırılır ve ikinci bir ultracentifugation adım bir membran...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles at JoVE.com

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

E. coli'de heterolog ekspresyon ve fransız presi kullanılarak hücrelerin lysis'inde üretilen membran vezikül preparatlarında proton-tahrikli membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için bir yöntem tanımladık.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Membran taşıyıcılarını karakterize etmek için bu tekniğin en önemli avantajlarından biri, taşıyıcının belirli yüzeyler için göreceli yakınlığını belirlemenin yanı sıra taşıma mekanizması hakkında bilgi edinmenizdir. Substrat naklini sağlamak için protein gradyanlarını kullanan membran proteinlerinin karakterizasyonu, burada gösterdiğimiz bu iç-dış vezikül teşrisi için özellikle uygundur. Bu tahlil bir Fransız basın ve ultracentrifuge erişim gibi bazı özel ekipman gerektirir iken, biz membran taşıyıcıları yapay lipozomlar içine yeniden gerekli tahliller daha teknik olarak daha kolay olabileceğini düşünüyorum.Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı yüzeylere ilişkin göreceli yakınlıkları ölçmemize ve rakip yüzeylerin taşıma ızgaraları üzerindeki etkisini test etmek için rekabet tahlilleri yapmamıza olanak sağlamasıdır. Bu titreyi göstermek için kullanılan BAT1 taşıyıcısı durumunda, biz de arginin tarafından taşıyıcı substrat aktivasyon göstermek başardık. Bu prosedüre başlamak için, kültür uygun antibiyotikler ile poliamin 3 medya beş mililitre tek bir koloni aşılama ve 37 santigrat derece bir gecede büyüyen hedef protein ifade hazırlanan E.coli mutant hücreleri.Ertesi gün, hücre kültürü 0.6 ve 0.8 arasında bir OD600 ulaşana kadar 0.0002% arabinose ile desteklenen taze poliamin 3 medya 500 mililitre bu kültürü aktarın. Bundan sonra, santrifüj 2000 kez G ve dört derece santigrat hücre pelet toplamak için 15 dakika. Peleti yeniden askıya alın ve her seferinde 15 dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüj ve dört santigrat derecede tampon bir ile üç kez yıkayın.Üçüncü dönüşten sonra Tampon bir hücrelerin son hacmi 10 mililitre olmalıdır. 35 mililitrelik bir Fransız basınç hücresi ortaya koyve hücre süspansiyonu hücrenin gövdesine dökün. Ünitenin arka tarafındaki RHS anahtarıyla makineyi açın ve oran seçici anahtarını yükseklere ayarlayın.Pompa düğmesini aç. Piston, odadaki havayı yerinden çıkarmak için üsten yükselmeye başlayacak. Gösterge 640 PSI'ya ulaşana kadar basınç artış valfi saat yönünde çevirerek basıncı artırın.Bu 10.000 PSI bir iç basınç yaratacak. Hücre hedef basınca ulaştıktan sonra, akış valfi tertibatını saat yönünün tersine çevirerek hafifçe açın. Dakikada sadece yaklaşık 10 damla bir akış hızı sağlamak için vana nın açılmasını ayarlayın.Piston gövdesindeki stop hattı akış hücresinin üst bölümüne ulaştığında pompa kapatın. Oran seçici anahtarını aşağıya yerleştirerek alt plakayı indirin ve pompa anahtarını açın. Alt plaka tamamen geri çekildiğinde, basınç artış valfini saat yönünün tersine çevirerek sistem basıncını sıfıra indirin.Pompayı kapatın ve makineyi kapatın. Fransız basını 10, 000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca kırılmamış hücreleri ve hücre enkazını yok etmek için ekspertiz. Pelet atın ve ultracentrifuge tüpler için supernatant aktarın.Ultracentrifuge membran veziküller pelet için bir saat için 150, 000 kez G ve dört derece santigrat elde supernatant. Membran vezikülleri tampon ikide yeniden süspansiyon olmadan bir kez yıkayın. Sonra, tampon iki membran vezikülleri yeniden askıya almak için bir Dounce doku öğütücü kullanın.Membran preparatlarının 100 mikrolitrelik aliquotlarını 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerde hazırlayın ve eksi-80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, pH 7.8'de Tris'in 30 milimolar'ındaki vezikülleri yıkayın ve yeniden askıya alın, bu da 0.1 milimolar kobalt II klorür içerir. Her 100 mikrolitre lik numuneye sodyum klorür, Tris ve kobalt II klorür de bir mikrolitre karboksipeptidaz ekleyin.20 derecede 20 dakika kuluçkaya yat. Sindirimi durdurmak için PH 7.5'te sodyum EDTA ve 2-Mercaptoetanol içeren bir çözeltinin beş mikrolitresini ekleyin. Enzimi tamamen inaktive etmek için çözeltiyi oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.Daha sonra, sıvı dodecyl sülfat, gliserol, bromofenol mavisi ve Tris içeren bir çözeltinin beş ila 10 mikrolitresini ekleyin ve numunenin pH 7,5 ila 100 mikrolitresini elektroforez ile analiz edin. Amino blotting gerçekleştirmek için, poliakrilamid jel üzerine 25 milimolar sodyum hidrojen fosfat ile nemlendirilmiş bir nitroselüloz filtre yatıyordu. İki nemlendirilmiş selüloz filtreler arasında yerleştirin, ve son olarak, iki nemlendirilmiş plastik ovma pedleri arasında.Bu derlemeyi 25 milimolar sodyum hidrojen fosfat içeren bir haznenin elektrotları arasına iki ila dört santigrat derece arasında bir sıcaklıkta yerleştirin. Proteinleri 20 voltta ve 2-3 amperde üç saat boyunca elektrotransfer edin. Nitroselüloz zarını bir gecede iki santigrat derecede tamponu bloke ederek kapatın.Ertesi gün, anti-His C-terminal HRP antikor 20 mililitre de nitroselüloz kuluçka, Anti-His C-terminal HRP antikor ve iki saat boyunca tampon engelleme ve tampon ile iki kez yıkama 50 mililitre tampon toplam 60 dakika. Amino lekegörselleştirmek için, denatüre alkol 20 mililitre 4-Chloro-1-naphthol altı miligram eritmek ve 15 milimolar Tris 80 mililitre ve% 30 hidrojen peroksit 50 mikrolitre ekleyin. Bu substrat çözeltisindeki filtre kağıdını 20 dakika yıka.Yeterli renk geliştiğinde, membranı suyla durulayın ve kurumasını bekleyin. Başlamak için, membran veziküllerin 100 mikrolitrelik aliquot'u 12 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Taşımabaşlatmak için membran veziküller için 50 mikromolar son konsantrasyonunda radyoetiketli poliaminler içeren tampon 3 ekleyin.12 santigrat derecede bir dakika boyunca nakil titresini yap. Bundan sonra reaksiyon karışımlarını filtrasyon manifolduna aktarın ve 0,45 mikrometre nitroselüloz membran filtresinden filtreleyin. Etiketlenmemiş poliaminlerin on kat daha yüksek konsantrasyoniçeren buz gibi araştırma tamponüç mililitre ekleyin, non-spesifik bağlama azaltmak için poliaminler olmadan üç mililitre saymama tampon izledi.Yıkanmış filtreleri 10 mililitre sintilasyon sıvısı içeren 20 mililitrelik tek kullanımlık sintilasyon şişelerine aktarın ve radyoaktiviteyi belirlemek için sıvı bir sintilasyon sayacı kullanın. Metin protokolünde belirtildiği gibi net poliamin alımını hesaplayın. Hedef proteini ifade eden veziküllere radyoetiketli substrat alımını ölçerek substrat için Km'yi belirleyin ve doğrusal olmayan bir regresyon yöntemi kullanarak Michaelis-Menten kinetiklerini hesaplayın.Yarışma deneyleri için, 12 santigrat derecede 100 mikrolitre vezikül içeren santrifüj tüpüne, aynı anda radyoetiketli poliaminin 50 mikromolar eklerken, deneme tamponunda yapılan etiketsiz rekabetçi substratı ekleyin. Veziküllerin içinde sıkışıp kalan radyoaktiviteyi daha önce açıklandığı gibi ölçün. Radiolabeled poliaminlerin alımını ve 100 mikromolar veya daha yüksek etiketli olmayan substrat varlığını ölçerek rekabetçi yüzeyler için bir üst KM belirleyin ve eğriyi çizmek için doğrusal olmayan bir regresyon yöntemi kullanın.Bu çalışmada, bir anti-hamal ilk E.coli protein ifade ile karakterizedir, ve daha sonra, heterologca ifade protein hücresiz bir sistemde titretilebilir böylece membran veziküller üreten. Batıda bir leke AtBAT1 vezikül e nakledilir doğrulamak için kullanılır. Bir Anti-His C-terminal antikor ile leke probing yaklaşık 72.3 kilodalton bir füzyon yapı proteini ortaya.SDS-PAGE'den önce veziküllerin sindirimi azalmaya yol açtı, ancak sonda sinyalinin tam bir kaybı olmadı. 12 santigrat derecede, veziküller tarafından radyoetiketli spermidin alımı bir dakika en yüksek ve üç dakika boyunca doğrusal kaldı. Bu nedenle, taşıma tsanının kuluçka süresi bir dakika içinde sabitlenir.Bir dakika sonra, vezikül membranı boyunca proton gradyanı olmadığı için pH 8.0'da hazırlanan ve depolanan membran vezikülleri ile izotopun net alımı yoktur. Yapay proton gradyanının dağılmasının etkisini göstermek için membran vezikülleri pH 8.0 tamponunda 10 dakika boyunca inkübiterek etiketli substrat ilave edilir ve radyoetiketli substratın minimum alımına yol açmaktadır. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar spermidin proton tahrikli alımı BAT1 proteini nedeniyle olduğunu göstermektedir.Proteinin substrat özgüllüğünü belirlemek için, Km değerleri farklı konsantrasyonlarda radyoetiketli substrat alımı ölçülerek hesaplanır. Spermidin, putrescine ve arginin için Km değerleri bu proteinin yüksek afiniteli poliamin ve arginin değiştirici olduğunu göstermektedir. Belirli bir alt tabaka için taşıyıcının affinity da dolaylı olarak rekabet tahlilleri kullanılarak tespit edilebilir.Bu tahliller GABA spermidin rekabetçi bir inhibitörü olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrıca, farklı amino asitlerin değişen konsantrasyonlarda varlığında radyoetiketli spermidin 50 mikromolar alımının ölçülmesi AtBAT1 de milimoler konsantrasyonlarda glutamat ve alanin taşıma yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Bu işlemi gerçekleştirirken, membran taşıyıcısının bakteri zarına entegrasyonu, belli ki, kritiktir.İlgi proteininin membrana entegre edildiğinin doğrulanması, C-terminal etiketlerine karşı yöneltilen antikorlar kullanılarak yapılabilir. İnsan ışınlayıcılarının genetik varyasyonu, hem metabolitlerin hem de belirli taşıyıcının alt tabakaları olan ilaçların taşınmasını etkileyebilir. Böylece, allelic varyasyon etkileyebilir, hem, alımı ve ilaçların atılımı.Birçok allelik varyantları hızlı bir ifade vektörü taşıyıcı genin yan yönettiği mutagenezi tarafından yapılabilir. Bu varyantların fonksiyonel tahlilleri daha sonra içten dış vezikül tahlilleri kullanılarak çok kontrollü koşullar altında test edilebilir. Membran taşıyıcıları tüm proteinlerin 8-10'undan oluşan ve çoğunluğu model organizmaların hiçbirinde tam olarak karakterize edilmemiştir.Organel membranlara lokalize olan taşıyıcılar, ökaryotik hücrelerde heterolog ifade ile karakterize etmek özellikle zordur. Değişim tipi veya proton aracılı taşıyıcılar bu E.coli membranlokalize edilebilir, bu taşıyıcılar fonksiyonel olarak bu in vitro tsay kullanılarak karakterize edilebilir. Veziküllerin kalitesi ve verimi Fransız basınından hücre parçalarının elüsasyon oranındaetkilenir.Izotopları ile veziküllerin taşıma tahlilleri yaparken, deneysel çoğaltmalar yapmayı kolaylaştıran deneysel bir kurulum olması önemlidir. Bunu yapmanın birçok yolu vardır, ancak bunu nasıl yaptığımızı size göstermenin bize yardımcı olacağını düşünüyoruz.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biochemistry

Cell Biology

Anatomy and Physiology

Unit 1

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Cell Membrane Structure and Functions

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...