Name: in vivo surface electrocardiography for adult zebrafish
Uploaded: 2019-08-01T15:00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health R01 HL141452 to TPN. ADInstruments har venligt givet generøse midler til at afholde omkostningerne ved åben adgang udgivelse, men havde ingen rolle i hverken eksperimentel design, dataindsamling, dataanalyse af denne undersøgelse eller nogen adgang til manuskriptet forud for offentliggørelsen.

Alle eksperimenter i denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med den amerikanske National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr. Alle dyre protokoller i denne undersøgelse blev godkendt af UCLA Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse.
1. klargøring af forsøgs sættet
<ol><li>Vedligehold Zebra i gennemstrømnings akvarie systemer på en 14 h lys, 10 h mørk fotoperiode ved 28 °c ± 0,5 °c. Feed med flake mad dagligt og levende saltlage rejer (artemia nauplii) to gange dagligt. Zebrafish i denne undersøgelse blev vedligeholdt og fodret af UCLA Zebrafish kerne.</li>
	<li>På dagen for forsøget, transport Zebra fra akvariet til laboratoriet.</li>
	<li>Konfigurer in vivo-EKG-optagelses systemet ved at forbinde de essentielle stykker udstyr og indsætte de tre farvekodede elektroder i rustfrit stål i forstærkeren på tre farve matchede adgangsportaler (figur 3). Start systemet ved starten af en EKG-optagelse og/eller-analyse session.</li>
	<li>Skaf nødvendige værktøjer, såsom en timer/stopur, en våd svamp med en slids til at holde fisken, pincet, saks, Pasteur pipetter og kultur retter (100 mm x 20 mm).</li>
</ol>2. induktion af anæstesi
<ol><li>Forbered fordybelse anæstesi til smertekontrol og fisk immobilisering for at undgå bevægelse artefakter under EKG data erhvervelse. De fleste laboratorier bruger nedsænkning tricain (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonat, MS-222).<ol>
<li>For at gøre tricain 0,4% stamopløsning, kombinere følgende elementer i en skrue-udjævnet mørk glas flaske: 400 mg tricain pulver, 98 mL dobbeltdestilleret vand, og 2 mL af 1 M tris (pH 9). Justér til pH 7,0 med 1 N NaOH eller 1 N HCl efter behov8.</li>
		<li>For at gøre tricain endelig nedsænkning løsning, bestemme den mindste koncentration, der er passende for Zebra alder9, størrelse, metaboliske tilstand, stamme, sygdomsmodel, videnskabelige mål, og proceduremæssige varighed.</li>
		<li>Udfør en koncentration-respons undersøgelse af tricain, der titrerer op eller ned fra den anbefalede koncentration på 168 mg/L (eller 0,0168%)9 , hvis det er nødvendigt, for at opnå niveau 4 af anæstesi inden for 3 minutter med færrest mulige kardiorespiratoriske toksiciteter. For eksempel, i denne undersøgelse, nedsænkning af vildtype AB Zebra af 12-18 måneder i en 0,02-0,04% tricain opløsning vil inducere niveau 4 af anæstesi inden for 3 min. Bemærk: på niveau 4 af anæstesi, ligevægt og muskeltonus er helt tabt og opereret bevægelse sats er reduceret8.</li>
		<li>Hvis det er nødvendigt, konsultere dyrlægen i den institutionelle Animal Care og brug Udvalget (IACUC) for yderligere vejledning om hensigtsmæssigheden af udvælgelsen af bedøvelsesmidler og administrationsvej.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nedsænk en voksen Zebra i en skål, der indeholder tricain opløsning af den laveste forudbestemte og iacuc-godkendte koncentration (f. eks. 0,02-0,04% i dette studie) for at inducere niveau 4 af anæstesi inden for 3 min (figur 2).<ol>
<li>For overlevelse EKG protokol, holde EKG optagelse session så kort som muligt (under 10 min). For korte EKG optagelse sessioner varig mindre end 15 min, anæstesivedligeholdelse er ikke nødvendig.</li>
		<li>Ved lange EKG-optagelses sessioner med varige timer, brug en langtidsvirkende intramuskulær paralytisk og et oralt perfusions system til at give rigelig hydrering og iltning6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. placering af EKG-bly
<ol><li>Når Zebra bevarer niveau 4 af anæstesi for 3 s, skal du bruge et par stumpe pincet til at overføre fisken straks til den fugtige svamp spalte med dens ventrale overflade, der er øverste for placering af EKG-bly elektroder (figur 4).</li>
	<li>Indsæt forsigtigt de tre EKG-elektroder i fiskens muskulatur til ca. 1 mm i dybden for at etablere en bipolær bly i det forreste plan, som paralleller til venstre-højre kranie retning af hjertets hovedakse.</li>
	<li>Placer den positive (røde) elektrode i den ventrale midterlinje på niveauet af bulbus arteriosus, dvs., ved 1-2 mm over en imaginær linje, som forbinder de to nedre kanter af operculums (figur 4a).</li>
	<li>Den negative (sorte) elektrode skal placeres i hale og 0,5-1,0 mm fra venstre side til den positive elektrode ved en afstand, der er større end den maksimale apicobasal længde for den voksne zebrafiskventrikel (figur 4a).</li>
	<li>Placer reference elektroden (grøn) hale, i nærheden af analregionen. Bemærk: da hjertets hovedakse varierer noget fra fisk til fisk, for at maksimere R og T bølge amplituer, justere de ledende stillinger ved at gøre kun små, systematiske ændringer gennem trial and error. For eksempel ændre en elektrode (positiv eller negativ), i stedet for begge elektroder, ad gangen og foretage gradvise ændringer i en bestemt retning, før du skifter til en anden retning i stedet for at foretage uregelmæssige ændringer i tilfældige retninger.</li>
</ol>4. EKG-optagelse
<ol><li>Åbn programmet til indsamling af EKG-data. Vælg en ønsket indstilling i rullemenuerne for område, lavpass og High Pass. F. eks. giver følgende indstilling i det in vivo-EKG-optagelses system, der anvendes i dette eksperiment, et konsistent, tilfredsstillende signal-støj-forhold for en normal voksen zebrafish: interval "2 mV", lavpass "120 Hz" og High Pass "0,03 s".</li>
	<li>Tryk på Start for at starte kontinuerlig Gap-fri EKG-optagelse med en samplingfrekvens på 1 kHz.</li>
	<li>For at optimere positions positionering for maksimalt signal-støj-forhold skal du trykke på stop for at stoppe EKG-optagelsen og gennemgå EKG-sporet kort efter det allerførste optagelses forsøg for hvert hjerte.  For at diagnosticere, at et voksent Zebra-EKG er normalt, skal du bekræfte, at alle følgende fire validerende kriterier er opfyldt (figur 1):<ol>
<li>Kriterium 1: Sørg for, at alle EKG-bølgeformer (P, QRS og T) er særskilte og let synlige.</li>
		<li>Kriterium 2: Sørg for, at P-bølgen er positiv.</li>
		<li>Kriterium 3: Sørg for, at netto QRS-komplekset er positivt (dvs. R-bølge amplitude er større end summen af Q-og S-bølge amplituder).</li>
		<li>Kriterium 4: Sørg for, at T-bølgen er positiv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hvis der forventes et normalt EKG, Flyt elektroderne (Prøv den negative elektrode først), hvis det er nødvendigt, indtil alle fire validerende kriterier er opfyldt.</li>
	<li>Hvis en normal T bølge forventes, men T bølge er for lille, skal du flytte elektroderne for at maksimere T bølge amplitude.</li>
	<li>Genoptag EKG-optagelsen efter optimering af blyplaceringen. Gem EKG-fejer til efterfølgende analyse.</li>
</ol>5. inddrivelse af anæstesi
<ol><li>I slutningen af EKG-indspilnings sessionen fjernes elektroderne forsigtigt uden at beskadige fisken. Overfør fisken til frisk, ilet fiskvand fri for tricain.</li>
	<li>For at lette inddrivelse fra anæstesi, sprøjt vand over gællerne energisk med en Pasteur pipette, indtil fisken genoptager regelmæssig Gill bevægelse eller svømning.</li>
	<li>Overvåge fiskene for fuld helbredelse fra anæstesi (typisk 1-2 min), som angivet af fiskene evne til at svømme oprejst i mindst 5 s.</li>
</ol>6. EKG-tolkning
<ol><li>Definer analyse indstillingerne.<ol>
<li>Kend softwaregrænsefladen (tabel over materialer) ved at læse betjeningsvejledningen til EKG-dataanalyse softwaren. Bemærk: selv om nedenstående anvisninger er specifikke for den kommercielle software, der anvendes i vores laboratorium, de grundlæggende opgaver at udføre, er stort set den samme i enhver softwarepakke til EKG-analyse.</li>
		<li>Åbn programmet EKG-dataanalyse. I menuen filer skal du vælge Åbn for at åbne EKG-filen af interesse og få vist hele EKG-sporet. Brug musen til at trække en del af interessen i EKG-sporet ud for at analysere.</li>
		<li>I menuen EKG-analyse skal du vælge Indstillinger for EKG for at åbne en dialogboks for at foruddefinere forskellige parameterindstillinger for software-automatisk analyse (figur 5a).</li>
	</ol></li>
	<li>Analysér hjerterytmen og hastigheden. Bemærk: puls afhænger af flere faktorer, herunder Zebra alder og stamme, anæstesimidler (f. eks. tricain, isofluran osv.) og koncentration, anæstesi brug (enkelt stof5,7 vs. kombinerede midler5) og eksponeringstid5. For eksempel i denne undersøgelse pulsen på 12-18 måneder gammel vild-type AB Zebra efter 3-5 min fordybelse i 0,02-0,04% tricain opløsning var 116 ± 17 slag pr minut (n = 9), i overensstemmelse med litteratur rapporter om puls for denne aldersgruppe og bedøvelse5,7.<ol>
<li>Afgøre, om hjerterytmen er sinus eller ej, regelmæssig eller uregelmæssig. Bemærk: tilstedeværelsen (eller fraværet) af sinusrytme er baseret på tilstedeværelsen (eller fraværet) af en opretstående P-bølge før hver QRS med et normalt pr-interval (f. eks. 60-65 MS for Liu et al. 's 10-12 måneder gamle7 og 12-18 måneder gamle vild-type AB Zebra i dette studie). Den formelle rigtighed af atrieflimren og ventrikel rytmen (eller uregelmæssigheden) er baseret på henholdsvis den formelle rigtighed (eller uregelmæssigheden) af de efterfølgende PP-eller RR-intervaller.</li>
		<li>For at bestemme pulsen skal du sørge for, at softwaren korrekt identificerer alle P-og R-bølger. Baseret på disse automatiske identifikationer (eller manuelle korrektioner) af P og R bølger, softwaren automatisk måler alle PP og RR intervaller i EKG udvælgelse, beregner intervallet gennemsnit til at generere atrieflimren og ventrikel sats. Bemærk: atrialraten er det gennemsnitlige PP-interval, hvorimod ventrikel hastigheden er det gennemsnitlige RR-interval. For at bestemme hjertefrekvensen er korrekt identifikation af P-og R-bølgerne kritisk.</li>
		<li>Ret eventuelle Auto-identifikationsfejl ved at flytte de fejlplacerede markører til de relevante P-og R-bølger (figur 5b). Bemærk: Hvis hjertet er i sinusrytme, er atriefastigheden og ventrikel raten de samme på grund af en-til-en-korrespondancen mellem sinus P-bølgerne og QRS-komplekserne. I tilfælde af atrioventrikulært dissociation (f. eks. i ventrikulær takykardi eller tredjegrads atrioventrikulær blok) er denne en-til-en-korrespondance mellem P-bølgerne og QRS-komplekserne tabt; Derfor er der to puls rater, fordi atriefastighed er forskellig fra ventrikel hastigheden.</li>
		<li>Bestem hjertefrekvensen baseret på mindst fem på hinanden følgende komplette hjerte cyklusser, hvis hjerterytmen er regelmæssig, eller en strimmel på mindst seks sekunder, hvis hjerterytmen er uregelmæssig.</li>
	</ol></li>
	<li>Beregn intervaller og bølge varigheder.<ol>
<li>Gå til EKG-analyse &Gt; gennemsnits visning for at sammenkoble n (f. eks. 5) på hinanden følgende kardiale cyklusser i et enkelt gennemsnitligt signal (figur 5c). Bemærk: Hvis EKG-bølge formerne for en individuel hjerte cyklus afviger væsentligt fra det gennemsnitlige signal, så studér den pågældende hjerte cyklus separat uden sammenkædning.</li>
		<li>Sørg for, at softwaren korrekt identificerer start og på den P-bølge, QRS-kompleks og T-bølge, der vises i vinduet gennemsnits visning (figur 5c). Baseret på disse automatiske identifikationer (eller manuelle korrektioner) af disse bølger og intervaller, softwaren automatisk måler varigheder som defineret konventionelt. Bemærk: PR-intervallet strækker sig fra starten af P-bølgen til starten af QRS-komplekset (eller RS-komplekset, hvis Q-bølgen ikke er synlig). QRS-varigheden strækker sig fra starten af Q-bølgen (eller R-bølgen, hvis Q-bølgen ikke er synlig) til slutningen af S-bølgen (dvs. J-punktet; Figur 1). QT-intervallet strækker sig fra starten af Q-bølgen (eller R-bølgen, hvis Q-bølgen ikke er synlig) til enden af T-bølgen. For at beregne intervaller og varigheder er korrekt identifikation af start-og slutdato for P-bølge, QRS-kompleks og R-bølge derfor kritisk.</li>
		<li>Ret eventuelle fejl ved automatisk identifikation ved at flytte de fejlplacerede markører til de relevante positioner.</li>
		<li>Vælg den negative top af s bølge som slutningen af QRS Complex7 fordi Zebra J punkt, der signalerer enden af s-bølgen kan være særligt vanskeligt at identificere præcist. Dette vil medføre en mindre Undervurder ingen af den sande QRS varighed. Bemærk: EKG-analysesoftwaren korrigerer automatisk QT-intervallet til ventrikel hastigheden (eller RR-intervallet) for at generere det korrigerede QT-interval QTc ved hjælp af den metode, som brugeren på forhånd har valgt i trin 6.1.3, for eksempel Bazett (figur 5a). Bazett's formel (1920) QTc = QT/√ RR er den mest populære og den første af flere metoder, der foreslås for at korrigere det humane QT-interval for hjertefrekvens. Da man har sat spørgsmålstegn ved rigtigheden af bazett's formel, henvises til andre metoder foreslået for mennesker10,11 og Zebra6 (figur 5D).</li>
	</ol></li>
	<li>Fortolke EKG-abnormiteter ved at genkende undtagelser for de fire validerende kriterier i trin 4,3.<ol>
<li>Genkende undtagelser for kriterium 1. I mangel af nogen P bølger (som indikerer fravær af sinusrytme), stole på RR intervaller og QRS varighed til at diagnosticere hjerterytmen. For eksempel, hvis RR intervaller er uregelmæssigt uregelmæssige, diagnosticere atrieflimren; Hvis RR intervaller er regelmæssige og QRS er normalt smal, diagnosticere supplerende flugt rytme; på den anden side, hvis RR intervaller er regelmæssige og QRS er unormalt langvarig, diagnosticere ventrikel flugt rytme.</li>
		<li>Genkende undtagelser for kriterium 2. Når P-bølge er negativ (eller inverteret), diagnosticere tilbage atrieflimren aktivering fra en ektopisk pacemaker (såsom en atrieflimet sted nedstrøms for sinus node, atrioventrikulært knude, eller ventrikel).</li>
		<li>Genkende undtagelser for kriterium 3. Når høje og smalle Q bølger til stede med negative P og negative T bølger, diagnosticere bly tilbageførsel på grund af en fejlagtig switch af de positive og negative elektrode positioner, fordi disse høje og smalle Q bølger var sande R bølger fejlagtigt inverteret (figur 6d ). I modsætning, når brede Q bølger til stede med positive P bølger efter signifikant hjerte skade, diagnosticere myokardieinfarkt, fordi disse brede Q bølger er sande patologiske Q bølger.</li>
		<li>Anerkend undtagelser for kriterium 4. Når T bølge er inverteret, inspicere ventrikel aktivering at identificere, om ventrikel repolarisering abnormitet er primær eller sekundær. Stole på det kliniske scenario til at indsnævre den korrekte diagnose fra en differentieret liste over primær ventrikel repolarisering abnormitet (fra narkotika virkninger eller myokardieiskæmi; Figur 6c) vs. sekundær ventrikel repolarisering abnormitet (på grund af afvigende ventrikel aktivering fra præ-excitation, ventrikulær ectopy, eller ventrikel pacing).</li>
	</ol></li>
	<li>Eksporter EKG-resultater.<ol>
<li>Vælg tabel visning for at gennemgå alle EKG-målinger. Vælg de mål af interesse at kopiere og indsætte i det ønskede dokument (f. eks Excel-regneark).</li>
		<li>Hvis du vil eksportere et EKG-spor, skal du markere et afsnit af interesse i EKG-fejeren ved hjælp af ikonet Forstørrelsesglas. Kopiér og Indsæt i det ønskede dokument (f. eks. Word eller PowerPoint).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome.">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li><li>Hassel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+zebrafish+ether-a-go-go-related+gene+channel+gating+causes+short-QT+syndrome+in+zebrafish+reggae+mutants.">Deficient zebrafish ether-a-go-go-related gene channel gating causes short-QT syndrome in zebrafish reggae mutants.</a> Circulation. 117 (7), 866-875 (2008).</li><li>Meder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+defective+protein+trafficking+rescues+Long-QT+syndrome+in+zebrafish.">Reconstitution of defective protein trafficking rescues Long-QT syndrome in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 408 (2), 218-224 (2011).</li><li>Sieber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+preclinical+in+vivo+screening+model+for+nanomedicines.">Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , (2019).</li><li>Lin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+and+economic+in+vivo+electrocardiogram+platform+for+cardiovascular+drug+assay+and+electrophysiology+research+in+adult+zebrafish.">Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish.</a> Science Reports. 8 (1), 15986 (2018).</li><li>Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+of+adult+zebrafish+electrocardiogram+and+assessment+of+drug-induced+QT+prolongation.">In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 291 (1), H269-H273 (2006).</li><li>Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+surface+ECG+recording+in+adult+zebrafish+reveals+that+the+value+of+this+model+exceeds+our+expectation.">Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation.</a> Science Reports. 6, 25073 (2016).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Ilar Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Sagie, A., Larson, M. G., Goldberg, R. J., Bengtson, J. R., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+adjusting+the+QT+interval+for+heart+rate+(the+Framingham+Heart+Study).">An improved method for adjusting the QT interval for heart rate (the Framingham Heart Study).</a> American Journal of Cardiology. 70 (7), 797-801 (1992).</li><li>Luo, S., Michler, K., Johnston, P., Macfarlane, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commonly+used+QT+correction+formulae:+the+effect+of+heart+rate+on+the+QTc+of+normal+ECGs.">A comparison of commonly used QT correction formulae: the effect of heart rate on the QTc of normal ECGs.</a> Journal of Electrocardiology. 37 Suppl, 81-90 (2004).</li><li>Vornanen, M., Hassinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+heart+as+a+model+for+human+cardiac+electrophysiology.">Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology.</a> Channels (Austin). 10 (2), 101-110 (2016).</li><li>Tsai, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+recording+of+adult+zebrafish+heart+electrocardiogram+-+a+platform+for+pharmacological+testing).">In-vitro recording of adult zebrafish heart electrocardiogram - a platform for pharmacological testing).</a> Clinica Chimica Acta. 412 (21-22), 1963-1967 (2011).</li><li>Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+5+anesthetics+in+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio).</a> Journal of American Association of Lab Animal Sciences. 53 (2), 198-203 (2014).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Nkx2.5-Calr-p53+signaling+pathway+by+hyperglycemia+induces+cardiac+remodeling+and+dysfunction+in+adult+zebrafish.">Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish.</a> Disease Model and Mechanism. 10 (10), 1217-1227 (2017).</li><li>Franz, M. R., Bargheer, K., Rafflenbeul, W., Haverich, A., Lichtlen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monophasic+action+potential+mapping+in+human+subjects+with+normal+electrocardiograms:+direct+evidence+for+the+genesis+of+the+T+wave.">Monophasic action potential mapping in human subjects with normal electrocardiograms: direct evidence for the genesis of the T wave.</a> Circulation. 75 (2), 379-386 (1987).</li><li>Chiale, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+electrocardiographic+manifestations+of+ventricular+repolarization+memory.">The multiple electrocardiographic manifestations of ventricular repolarization memory.</a> Current Cardiology Reviews. 10 (3), 190-201 (2014).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+multifunctional+integumentary+membranes+for+spatiotemporal+cardiac+measurements+and+stimulation+across+the+entire+epicardium.">3D multifunctional integumentary membranes for spatiotemporal cardiac measurements and stimulation across the entire epicardium.</a> Nature Communications. 5, 3329 (2014).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Ved optagelse in vivo EKG for voksne zebrafisk ved hjælp af en enkelt bly, som vi viste i denne undersøgelse, er der en række forbehold vedrørende kvaliteten og validiteten af EKG-optagelsen resultater. Først, ved at vælge de passende anæstesi og bestemme den minimale nødvendige anæstesi koncentration, dybde, og varighed, balance bedøvelsesmiddel kardiotoksiniteter mod det kritiske behov for at undertrykke motion artefakter og a priori beslutsomhed for en overlevelse vs. Terminal eksperimentel design. Kapitalisering på den synergistiske potens af en kombination af flere anæstetika fra forskellige lægemiddelklasser5,14 og paralytiske1,6 at sænke dosis af individuelle agenter5 eller administration en lav vedligeholdelsesdosis efter en højere induktionsdosis er typiske strategier. Men på trods af sin velkendte potentielle kardiorespiratoriske toksiciteter, herunder død8, tricain er stadig den mest udbredte, den bedste tilgængelige, og den eneste bedøvelsesmiddel godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) for Zebra Anæstesi. Tricain er blevet populært anvendt i EKG-optagelse af voksne Zebra enten som en enkelt agent eller i kombination med andre anæstetika eller paralytika.
For det andet kan bly placering nøjagtighed sikres i det mindste for sund normal Zebra ved hjælp af vores fire validerende kriterier for en normal voksen Zebra EKG. Af de fire validerende kriterier, som vi foreslår her, bekræfter de to sidste kriterier sammen den grundlæggende overensstemmelse mellem R-bølgen og T-bølgen i et normalt EKG på5,7og15. Denne R-og T-bølge konkordance er en fortuitøs, men kritisk, lighed mellem Zebra og human16,17 normal EKG, der bidrager til den kliniske relevans af Zebra Heart model som et surrogat for humant hjerte Elektrofysiologi. Flere godartede eller ondartede forhold kan dog medføre, at et af de fire validerende kriterier bortfalder. For eksempel, R og T bølge konkordance er tabt i Myokardie iskæmi7,15. Dette tab af R og T bølge konkordance i myokardieiskæmi er en anden slående lighed mellem Zebra og humant EKG, der bidrager til den kliniske relevans af den Zebra myokardieinfarkt model.
Endelig anbefaler vi en standardpraksis i EKG-analyse. Med fremkomsten af teknologi kan EKG-analyse software generere automatisk EKG-tolkning. Vi anbefaler dog på det kraftigste, at uddannede mennesker altid skal genfortolke og verificere alle ECGs baseret på det respektive kliniske scenario, der fører til EKG-optagelse. Rutinemæssig over-afhængighed udelukkende på automatisk fortolkning af en EKG-analyse software er tilrådeligt, især i nærværelse af almindelige normale EKG-varianter, kardielle patologier, eller suboptimale bly placering.
Denne undersøgelse fokuserer på den minimalt invasive metode til korte EKG optagelses sessioner. Men, hvis behovet opstår for Terminal langvarig EKG optagelse sessioner varige timer, ændringer er nødvendige for at give tilstrækkelig iltning, hydrering, og anæstesi ved kontinuerlig perfusion6.
Derudover skal signal-støj-forholdet forbedres med en af mindst tre måder. At vælge en kraftigere forstærker er ofte en bekostelig, hvis ikke upraktisk, mulighed. Åbning af perikardiet SAC for at reducere volumen lederen er en fornuftig, men invasiv tilgang, der er blevet vedtaget7. Strategisk bly placering at justere den ledende akse i en retning parallelt med den vigtigste hjerte akse (figur 4b) vil maksimere EKG-spændings signalerne, men kan kræve trial and error, især i fravær af pericardiotomi.
In vivo EKG forhør metode til voksne zebra, som vi præsenterede her, tilbyder fire store fordele. For det første kræver vores minimalt invasive tilgang kun elektrode indsættelse, men ingen fiske skala fjernelse eller thoracotomy-pericardiotomi. Derfor, ved at minimere smerten for fiskene, vores tilgang muliggør gentagne EKG forhør i longitudinale overlevelse undersøgelser. For det andet, når anæstetika tilstrækkeligt undertrykke fisk bevægelse, in vivo EKG-optagelse system i vores undersøgelse konsekvent giver et tilfredsstillende signal-til-støj-forhold med støj-fri rå signaler. For det tredje sikrer den kvalitets validering med fire kriterier, som vi foreslår her, data nøjagtighed og-robusthed tidligt i EKG-dataindsamlingen og minimerer operatør afhængige variationer. Endelig er det især vores sidste validerende kriterium (den normale T-bølge er oprejst), der er i overensstemmelse med R-bølgen og T-bølgen, et vigtigt menneskelignende træk ved zebra normal EKG (figur 1).
Der findes dog stadig fire store begrænsninger for den nuværende in vivo-EKG-metodologi for voksne Zebra af vores gruppe og andre.
For det første, manglen på emne samarbejde nødvendiggør behovet for anæstesi med sin begrænsende kardiorespiratoriske toksicitet konsekvenser. For in vivo-EKG-forhør, hvorimod humane patienter aldrig har behov for sedation, kræver Zebra altid anæstetika eller paralytika, som alle forårsager variable kardiorespiratoriske toksiciteter.
For det andet, behovet for at sikre den vedlagte EKG fører lidt hæver invasivitet af en ellers ikke-invasiv procedure. Der henviser til, at bly i kroppens overflade-EKG-optagelse af mennesker er fuldstændig ikke-invasiv, fordi elektroder overholder det humane epidermis, er blyplacering til in vivo-EKG-optagelse af Zebra mere invasiv, fordi stål elektroder som minimum skal punktere fiske huden for sikker indsættelse i fiskens muskulatur.
De sidste to begrænsninger stammer fra de anatomiske begrænsninger af Zebra brystet og hjertet. For det tredje, den minuscule størrelse af den voksne Zebra hjerte nødvendiggør en drastisk reduktion i antallet af EKG-ledninger. Mens mennesker let kan rumme tolv leads i en standard EKG-optagelse, vil voksne Zebra typisk kun kunne rumme en enkelt unipolær eller bipolar bly. Forgreningen af et enkelt EKG-bly er udfordringen med at optimere samtidig amplituder af alle tre P-, R-og T-bølger. Derfor kan det ikke overvurderes, hvor vigtig en optimal og præcis blyplacering i Zebra-EKG-forhør er. I zebrafish præsenterer T Wave en unik afsløring udfordring, fordi det er ofte den mindste af disse tre bølger. Derfor, den Zebra T bølge amplitude bør modtage optimering prioritet over de typisk større P og R bølger.
Fjerde, bestemmelse af Zebra vigtigste hjerte akse til at maksimere R bølge amplitude kan være udfordrende. Årsagen er, at Zebra Heart har mere bevægelsesfrihed inden for sin løse perikardiesac i forhold til det menneskelige hjerte i sin form-fitting handske-lignende periicardium.
Samlet set vil disse begrænsninger stimulere fremtidig metode innovation. Med fremkomsten af 3D-print og deformerbar elektronik18, er der håb for direkte bly implantation en dag i vågen, Alert, svømning Zebra ved hjælp af en "hjerte sok" af trådløse elektrode sensorer.

Den Zebra (Danio rerio) hjerte er placeret anteroventrally til thorax hulrum mellem operculum og bryst girdles. Hjertet er omgivet temmelig løst inden for en sølvfarvet perikardia SAC. Anatomisk, den Zebra hjerte er forskellig fra de fire-Chambered menneskelige og andre pattedyr hjerter på grund af sin diminutiv skala (100-fold mindre end det menneskelige hjerte) og dens to-kammer ed struktur bestående af kun et atrium og en ventrikel. Ikke desto mindre er elektrokardiogram (EKG) bølgeformer og varigheden af QT-intervallet af begge arter er bemærkelsesværdigt ens (figur 1). Derfor, zebra er dukket op som en populær model for at studere menneskelige nedarvede arytmias1,2,3 og for high-gennemløb Drug screening af potentielle humane kardiotoksiniteter4,5 , såsom QT-forlængelse.
I den rutinemæssige evaluering af menneskelige hjertesygdomme, kroppen-overflade EKG er blevet den mest udbredte første-line ikke-invasiv diagnostisk værktøj siden sin opfindelse af Einthoven i 1903. I modsætning hertil, siden den første tilpasning af kroppen-overflade EKG optagelsesmetode for voksne Zebra i 20066 og flere modifikationer derefter7, denne teknik har været stort set utilgængelige for mange forskere på området på trods populariteten af denne dyremodel. For andre forskere, der optrådte in vivo EKG-forhør for voksne zebrafish, førte store variationer blandt operatørerne til inkonsistens i EKG-fund fra forskellige undersøgelser. Almindelige årsager omfatter besværlige og dyre specialiserede enheder og software, lavt signal-støj-forhold, og forvirring om elektrodeplacering, alle yderligere forværret af en ufuldstændig forståelse af den voksne Zebra EKG-funktioner og underliggende vævs mekanismer. I betragtning af, at in vivo EKG er det eneste diagnostiske værktøj til elektrisk fænotype levende zebrafish, der er et klart behov for en standardiseret metode til at forbedre følsomhed og specificitet, reproducerbarhed og tilgængelighed.
Her præsenterer vi en praktisk, pålidelig og valideret tilgang til registrering og fortolkning af Zebra in vivo elektrokardiogrammer (figur 2). Ved hjælp af et enkelt bipolært bly i frontal planet undersøgte vi ændringerne i EKG-bølgeformer og intervalvarigheder af levende bedøvet sund vildtype AB voksen zebrafish.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB087571</td>
			<td>100 mm x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td>0.1 x 0.06 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE136 Animal Bio Amp&#160;</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>FE231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>11064-07</td>
			<td>0.6 x 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart 8 Pro</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software with ECG Module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle electrodes for Animal Bio Amp&#160;</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLA1213</td>
			<td>29 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td>6 in., 1.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 4/35</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>4//35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm, 0.075 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo surface electrocardiography for adult zebrafish

Elektrokardiogram bølgeformer af voksne Zebra og dem af mennesker er bemærkelsesværdigt ens. Disse elektrokardiogram ligheder øge værdien af Zebra ikke kun som en forskningsmodel for menneskelig kardiel Elektrofysiologi og myopatier, men også som en surrogat model i høj hastighed farmaceutisk screening for potentielle kardiotoksiniteter til mennesker, såsom QT-forlængelse. Som sådan, in vivo elektro kardiografi for voksne Zebra er et elektrisk fænotypebestemmelse værktøj, der er nødvendig, hvis ikke uundværlig, for tværsnits-eller langsgående in vivo elektrofysiologiske karakterisering. Men alt for ofte er manglen på en pålidelig, praktisk og omkostningseffektiv optagelsesmetode stadig en stor udfordring, der forhindrer, at dette in vivo-Diagnosticeringsværktøj bliver lettere tilgængeligt. Her beskriver vi en praktisk, ligetil tilgang til in vivo elektro kardiografi for voksne Zebra ved hjælp af en lav vedligeholdelse, omkostningseffektiv, og omfattende system, der giver ensartede, pålidelige optagelser. Vi illustrerer vores protokol ved hjælp af sunde voksne mandlige Zebra på 12-18 måneder af alder. Vi introducerer også en hurtig realtids fortolknings strategi for kvalitets validering for at sikre data nøjagtighed og robusthed tidligt i elektrokardiogram optagelsesprocessen.

Figur 1 illustrerer den kliniske relevans af den metode, der præsenteres her. In vivo overflade elektro kardiografi for voksne Zebra er et vigtigt elektrisk fænotypebestemmelse værktøj på grund af de bemærkelsesværdige ligheder mellem Zebra og humant EKG på trods af deres store anatomiske forskelle. Den Zebra hjerte har kun et atrium og en ventrikel i modsætning til det menneskelige hjerte med to Atria og to ventrikler (øverste række, henholdsvis højre og venstre). Men på trods af sin tilsyneladende anatomiske enkelhed, har Zebra hjerte flere EKG funktioner med det menneskelige hjerte (nederste række; højre og venstre, henholdsvis) Zebra Heart er derfor dukket op som en surrogat model for humant hjerte Elektrofysiologi5,12,13. Figur 1 illustrerer en lille, men distinkt Q-bølge fra en levende, sund 14-måneders-gammel zebrafish. Men i Zebra EKG, er bly positionering ikke almindeligt optimeret til at demonstrere Q Wave. Derfor er Q-bølgen almindeligt usynlig, og et RS-kompleks er mere almindeligt set end det komplette QRS-kompleks i Zebra EKG.
Figur 2 opsummerer de fire væsentlige skridt til at gennemføre minimalt invasiv in vivo elektro kardiografi for voksne zebrafish. Efter anæstesi induktion (trin 1) og elektrodeplacering (trin 2) indspillede vi EKG-signaler (trin 3) fra sund vildtype AB Zebra i alderen 12 til 18 måneder (n = 9). Vores elektrode indsættelses teknik var kun minimalt invasiv, fordi vi ikke behøvede at skrælle fiske skalaer eller udføre pericardiotomi. Efter dataindsamlingen gennemgik og kontrollerede vi manuelt hver EKG-optagelse (trin 4) for at undgå potentiel fejlfortolkning af software automatisk analyse.
Figur 3 viser de tre uundværlige komponenter i et typisk EKG-dataindsamlings-og databehandlingssystem: en højtydende hardware til data anskaffelse, en højforstærknings differentialforstærker og en computer, der uploades med software til EKG-data erhvervelse og analyse. I vores laboratorium tilpassede vi et eksisterende kommercielt in vivo-EKG-optagelses system, der oprindeligt var designet til små pattedyr modeller (såsom mus, rotter og kaniner) for at imødekomme den voksne Zebra-model.
Figur 4 viser, at korrekt blyplacering kræver, at føringen justeres med den formodede hjertets hovedakse. I Zebra in vivo EKG-optagelse, fordi der kun anvendes én enkelt bly, korrekt bly positionering at maksimere samtidig både R og T bølge amplituder er kritisk. For at maksimere R og T bølge amplituer, vi justeret de positive og negative bly elektroderne med hjertets hovedakse, formentlig i venstre hale til højre kranie orientering. Efter thoracotomi og pericardiotomi at åbne perikardielle SAC og udsætte hjertet, hjertets hovedakse bliver tydelig (figur 4b hvid stiplede linje). Faktisk, pericardiotomi at udsætte hjertet er en almindeligt anvendt strategi for at øge signal-til-støjforhold7 på bekostning af konvertering af EKG-optagelsen fra en minimalt invasiv i en meget invasiv procedure.
Figur 5 illustrerer kritiske trin i EKG-analysen. Først definerede vi de forskellige parameterindstillinger for automatisk analyse af software ved hjælp af dialogboksen Indstillinger for EKG (figur 5a). Da vi genbruge et eksisterende EKG-optagelsesudstyr designet til pattedyrs modeller til at rumme voksne zebra, er detekterings-og analyse indstillingen for Zebra ikke tilgængelig. Vi valgte den menneskelige forudindstilling i stedet, i betragtning af den bemærkelsesværdige lighed med Zebra EKG til humant EKG (figur 5a). For det andet, vi manuelt verificeret software automatisk EKG identifikation (i sort) af R bølgetoppe og korrekt (i rødt) enhver R Wave Auto-identifikation fejl før kommanderede softwaren til at genberegne den gennemsnitlige ventrikel sats. For eksempel, i figur 5b, en stor P bølge i forhold til r bølge narret softwaren til at fejl kende r bølger, fører til den efterfølgende automatisk fejlberegning af RR interval eller ventrikel hastighed. Derfor er menneskelig verifikation og passende korrektioner efter behov afgørende for EKG-analyser. For det tredje vurderede vi hurtigt rytme regelmæssighed og beregnede den gennemsnitlige varighed af bølger og intervaller ved hjælp af gennemsnits visningen (figur 5c) for at sammenkoble flere på hinanden følgende hjerte cyklusser (grøn) til et enkelt gennemsnitligt signal (sort). Her i figur 5c, den ubetydelige afvigelse mellem hver af de ni hjerte cyklusser og den gennemsnitlige signal argumenterer for den fremragende rytme regelmæssighed af denne Zebra hjerte. Endelig har vi gjort det muligt for softwaren automatisk at korrigere QT-intervallet for puls ved hjælp af Bazett, en af de syv forskellige tilgængelige metoder (figur 5D).
Figur 6a -C viser, hvordan dybden af elektrodeplacering påvirker AMPLITUDEN af EKG-signalerne. Når vi fejlagtigt indsat elektroderne for overfladisk i dermis (figur 6a), føringen var "indirekte"-lignende (mere end to hjerte diametre fra hjertet, svarende til indirekte standard menneskelige EKG lemmer bly i, II, og III) og spænding signalerne var små. Da vi på passende vis indsatte elektroderne 1 mm dybere ind i pectoralis muskulatur (figur 6b), blev føringen "semidirect" (i umiddelbar nærhed, men ikke i direkte kontakt med hjertet), og spændings signalerne steg. EKG-bølge formerne blev let synlige. Men da vi fejlagtigt indsatte elektroderne endnu dybere ind i ventriklen (figur 6c), blev føringen "direkte" (i direkte kontakt med hjertet), og spændings signalerne steg yderligere. R-bølge amplitude i figur 6c steg med otte gange sammenlignet med figur 6a og med fire gange sammenlignet med figur 6b. EKG-sporet i figur 6c afslørede imidlertid nye tegn på skade på ventrikel myokardiet, såsom ny St-depression og ny T-bølge inversion.
Figur 6d viser, hvordan de usædvanlige inversioner af alle EKG-bølgeformer (P, Q, R, S og T) skal signalere en fejl i blytilbageførsel, hvor de positive og negative elektroder skiftede sted. Bemærk, at Q og S efter definition altid er negative, hvorimod R altid er positiv.
Figur 6E -F viser, hvordan uhensigtsmæssig anæstesidybde kan forringe kvaliteten af in vivo EKG-optagelse. I figur 6e, utilstrækkelig anæstesi (0,017% tricain) førte til manglende immobilisere Zebra helt. De resulterende bevægelses artefakter sænkede signal-til-støj-forholdet ved både at kontaminere signalet (Asterisk) og øge støjen (pilene). I modsætning hertil inducerede overdoseret anæstesi (0,08% tricain) i figur 6Fsvær sinus bradyarytmi samt ændringer af St-segmentet og T-bølge.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig1.jpg"> Figur 1: kontrast til anatomi og EKG af menneskelige og Zebra hjerter. I modsætning til det menneskelige hjerte med to Atria og to ventrikler, har Zebra hjertet kun et atrium og en ventrikel (øverste række). Forkortelser: RA, højre atrium; LA, venstre atrium; RV, højre ventrikel; LV: venstre ventrikel. Zebra Heart deler flere almindelige EKG-funktioner med menneskets hjerte (nederste række). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig2.jpg"> Figur 2: minimalt invasiv in vivo EKG-optagelses protokol. Et skematisk flowdiagram illustrerer fire kritiske trin i gennemførelsen af en in vivo EKG-forhør: Fremkald anæstesi, Placer EKG-bly-elektroder, Optag EKG, og analysér EKG-optagelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig3.jpg"> Figur 3: System til indsamling og behandling af EKG-data. De tre nøglekomponenter i et integreret in vivo-EKG-optagelses system omfatter en hardware til at erhverve data, en forstærker og computer software til dataindsamling og-analyse. Forstærkeren leveres med tre klar-til-brug 29-gauge rustfrit stål mikroelektroder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig4.jpg"> Figur 4: Placering af EKG-bly. 3 29-gauge farvekodede elektroder i rustfrit stål indsættes sikkert i fiskens muskulatur til ca. 1 mm i dybden. Placeringen af den negative (sorte) elektrode og den positive (røde) elektrode etablerer et bipolært bly i det forreste plan langs en venstre hale til højre kranie orientering. Forkortelse: ref, referenceelektrode <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig5.jpg"> Figur 5: C ritiske trin i EKG-analysen. (A) pre-definere de forskellige parameterindstillinger for software automatisk analyse. (B) manuelt korrigere (rød) to automatiske fejlrettelser af softwaren (sort) af P og R bølger til at korrigere software fejlberegning af atrieflimren og ventrikel hastigheden. (C) sammenkoble ni på hinanden følgende hjerte cyklusser (grøn) i et enkelt gennemsnitligt signal (sort) for hurtigt at vurdere rytme regularitet/uregelmæssigheder og beregne gennemsnitlige varigheder af bølger og intervaller. (D) korrigere QT-intervallet for puls ved hjælp af en af de forskellige metoder, såsom bazett. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig6.jpg"> Figur 6: virkninger af bly placering og anæstesidybde på EKG-signaler. To mest kritiske trin, der afgør succesen af in vivo EKG-optagelse er bly placering (A-D) og anæstesidybde (E-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

Her præsenterer vi en pålidelig, minimalt invasiv og omkostningseffektiv metode til at registrere og fortolke elektrokardiogrammer i levende bedøvet voksne zebrafish.

In vivo overflade elektro Kardiografi til voksne Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

In vivo elektrisk kardografi er det eneste diagnostiske værktøj til elektrisk fænotypebestemmelse i levende zebrafisk i tværsnits- og langsgående undersøgelser. Vores tilgang er praktisk, minimalt invasiv, og omkostningseffektiv, fordi vi repurpose et dataindsamlingssystem for pattedyr. Vi lægger vægt på strategien med eKG-fortolkning i realtid til tidlig validering af datakvalitet.Fordi humane og zebrafisk EKG'er er ens, in vivo elektrokardiografi letter brugen af zebrafisk i modellering menneskelige hjertefysiologi samt høj gennemløb lægemiddelscreening for kardiotoksikaliteter, såsom QT forlængelse. Korrekt placering af kundeemne er nøglen til succes. Fordi den normale zebrafisk T bølge er den mindste, prioritere optimere sin amplitude over de større P og R bølger.Undersøgelse normale og patologiske EKG mønstre til at fortolke dine EKG resultater jer selv. Stol ikke udelukkende på automatisk fortolkning af EKG-analysesoftware. På dagen for eksperimentet, transport zebrafisk fra akvariet til laboratoriet.For at oprette in vivo EKG-registreringssystemet skal du tilslutte de væsentlige stykker udstyr og indsætte de tre farvekodede elektroder i rustfrit stål på EKG-led'en i forstærkerens tre farvematchede adgangsportaler. Ved induktion af niveau 4-anæstesi nedsænkes en voksen zebrafisk i en skål, der indeholder en opløsning af bedøvelsesmidler, i de laveste forudbestemte koncentrationer, der er godkendt af udvalget for institutionspleje og -anvendelse. Når zebrafisken har opretholdt niveau 4 anæstesi i tre sekunder, skal du bruge et par stumpe kraftanger til straks at overføre fisken på en fugtig svamp med en slids, ventral overflade op, til placering af de tre EKG-elektroder.Sæt forsigtigt den positive elektrode i ventrale midterlinjen på niveau med bulbus arteriosus en til to millimeter over en imaginær linje, der forbinder de to nederste kanter af operculums. Placer den negative elektrode caudally og 0,5 til en millimeter tilbage sideværts til den positive elektrode i en afstand større end den maksimale apicobasale længde af den voksne zebrafisk ventrikel, derefter placere reference elektrode caudally nær anal regionen. Til EKG-optagelse skal du starte systemet og åbne EKG-dataindsamlingsprogrammet.Vælg en ønsket indstilling i rullemenuerne for rækkevidde, lavt gennemløb og højt gennemløb. Tryk på Start for at starte kontinuerlig gap-free EKG-registrering med en samplinghastighed på en kilohertz. For at optimere ledningspositionering for maksimalt signal-støj-forhold skal du trykke på Stop for at stoppe optagelsen og gennemgå sporingen kort efter det allerførste optagelsesforsøg for hvert hjerte.Hvis EKG forventes at være normal, bekræfte, at alle EKG bølgeformer er forskellige og let synlige, og at P bølge, netto QRS kompleks, og T bølge er alle positive. Det mest kritiske trin er ledningspositionering for at maksimere signal-støj-forholdet. Anvend vores fire valideringskriterier efter det allerførste EKG-registreringsforsøg for hver fisk for at opnå korrigerende feedback.Hvis der forventes et normalt EKG, skal elektroderne efter behov flyttes, indtil alle disse fire valideringskriterier er opfyldt. Hvis der forventes en normal T-bølge, men T-bølgen er for lille, skal elektroderne flyttes for at maksimere T-bølgeforstærkeren. Genoptag EKG-optagelsen efter optimering af kundeemnepositioneringen, hvor EKG-søgningerne gemmes til efterfølgende analyse.Ved afslutningen af EKG-optagelsen fjernes elektroderne forsigtigt uden at skade fisken. I overlevelsesundersøgelser overføres fisken til frisk, iltet fiskevand fri for tricain. Bemærk venligst, at i denne video, for at lette læsernes visning af fisk opsving fra anæstesi, iltning afbrydes.For at lette inddrivelse fra anæstesi i overlevelse undersøgelser, bruge en Pasteur pipette til kraftigt sprøjte vand over gællerne, indtil fiskene genoptager regelmæssig gælle bevægelse eller svømning, derefter overvåge fisk for fuld genopretning fra anæstesi, før du returnerer fisk til akvariet. Fisken anses for fuldt ud inddrives fra anæstesi, når den kan svømme oprejst i mindst fem sekunder. Hvis du vil definere analyseindstillingerne, skal du åbne EKG-dataanalyseprogrammet og åbne eKG-filen af interesse for at få vist hele EKG-sporingen.Brug musen til at trække et afsnit af interesse i EKG spor til at analysere. Vælg EKG-indstillinger i menuen EKG-analyse for at åbne en dialogboks for at foruddefinere forskellige parameterindstillinger til automatisk softwareanalyse. Analysere hjerterytme og sats og afgøre, om hjerterytmen er sinus eller ej, regelmæssig eller uregelmæssig.For at bestemme pulsen skal du sikre dig, at softwaren korrekt identificerer alle P- og R-bølgerne, fordi atrie- og ventrikelhastigheden er baseret på henholdsvis PP- og RR-intervallet. Ret eventuelle fejl i automatisk identifikation ved at flytte de fejlplacerede markører til de relevante P- og R-bølger. For at beregne intervaller og bølgevarigheder skal du åbne EKG-analyse og gennemsnitsvisning for at sammenkæde flere på hinanden følgende hjertecyklusser i et enkelt gennemsnitligt signal.Sørg for, at softwaren korrekt identificerer starten og slutningen af P-bølgen, QRS-komplekset og T-bølgen, og flyt derefter de fejlplacerede markører til de relevante positioner for at rette eventuelle fejl i automatisk identifikation. Hvis du vil eksportere EKG-målingerne, skal du vælge Tabelvisning for at gennemse alle EKG-målingerne og kopiere og indsætte målinger af interesse i et regneark til efterfølgende analyse. Hvis du vil eksportere en EKG-sporing, skal du bruge forstørrelsesglasset til at fremhæve et afsnit af interesse for EKG-søgning og kopiering og indfiske feje i det ønskede dokument.I kontrakt med det menneskelige hjerte, som har to atria og to hjertekamre, zebrafisk hjerte har kun én atrium og en hjertekammer. På trods af sin tilsyneladende anatomiske enkelhed deler zebrafiskhjertet flere EKG-træk med det menneskelige hjerte. Korrekt placering af bly kræver, at ledføringen flugter med den formodede hjertestarter.Når elektroderne indsættes for overfladisk i dermis, anses blyn for indirekte-lignende, og spændingssignalerne er små. Når elektroderne indsættes i den relevante en millimeter dybde i pectoralis muskulaturen, bliver blysingen semi-direkte, og spændingssignalerne øges. Hvis elektroderne indsættes dybere end en millimeter i hjertekammer, bliver blyn imidlertid direkte, og spændingssignalerne stiger yderligere, med R-bølgens amplitude stige med fire gange i forhold til, når elektroderne indsættes ved den rette dybde.EKG spor fra alt for dybt indsat elektroder afslører også nye tegn på skade på ventrikulære myokardiet, såsom en ny ST depression og en ny T bølge inversion. Hvis de positive og negative elektroder skiftes i deres placering, observeres usædvanlige inversioner af alle EKG-bølgeforme. En uhensigtsmæssig grad af sedation dybde kan også forringe kvaliteten af in vivo EKG optagelse.Husk at bedøve dybt nok til at immobilisere fisken uden at dræbe den. Placer elektroderne for at maksimere signal-støj-forholdet, og undgå overdreven afhængighed af automatisk softwareanalyse. Efter denne minimalt invasive overlevelse procedure, er det muligt at udføre andre procedurer såsom delvis ablation, resektion af hjertet, eller seriel EKG undersøgelser i narkotika reaktioner eller langsgående undersøgelser.Systemiske toksiciteter er potentielle komplikationer af bedøvelsesmiddel, herunder tricain. Disse toksiciteter kan reduceres ved at udnytte synergien af flere bedøvelsesmidler til at sænke dosis af de enkelte agenser.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporation af Morpholinos i den voksne zebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo elektroporation af Morpholinos i Regenerating Adult zebrafisk Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blodprøvetagningssystem for Biokemisk Analyse i Voksen Zebrafisk

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Voksen Zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

En analyse for sidelinje Regeneration i Voksen Zebrafisk

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Inddrivelse af voksne zebrafisk Hearts for high-throughput applikationer

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Gentagen Blodprøvetagning for blodprøver Voksen Zebrafisk

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...