Name: in vivo surface electrocardiography for adult zebrafish
Uploaded: 2019-08-01T15:00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health R01 HL141452 naar TPN. ADInstruments verleende vriendelijk genereuze financiering om de kosten van Open Access Publishing te bekostigen, maar had geen rol in experimenteel ontwerp, data-acquisitie, gegevensanalyse van deze studie of enige toegang tot het manuscript vóór publicatie.

Alle experimenten in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met de US National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren. Alle dier protocollen in deze studie zijn goedgekeurd door de UCLA Institutional Animal Care and use Committee.
1. bereiding van de experimentele opstelling
<ol><li>Handhaaf zebravis in flow-through Aquarium systemen op een licht van 14 uur, 10 h donkere fotoperiode bij 28 °c ± 0,5 °c. Voer dagelijks met vlok voedsel en levende pekel garnalen (Artemia nauplii) tweemaal daags. Zebravis werd in deze studie onderhouden en gevoed door de UCLA Zebrafish core.</li>
	<li>Op de dag van het experiment, transport zebravis van het aquarium naar het laboratorium.</li>
	<li>Stel het in vivo ECG-opnamesysteem in door de essentiële uitrustingsstukken aan te sluiten en de drie roestvrijstalen elektroden met kleurcodering in de drie op kleur afgestemde toegangs portals van de versterker te plaatsen (Figuur 3). Start het systeem aan het begin van een ECG-opname en/of-analyse sessie.</li>
	<li>Het aanschaffen van de nodige gereedschappen, zoals een timer/stopwatch, een natte spons met een spleet om de vis te houden, Tang, schaar, Pasteur pipetten, en cultuur gerechten (100 mm x 20 mm).</li>
</ol>2. anesthesie inductie
<ol><li>Bereid onderdompeling anesthesie voor pijn controle en vis immobilisatie om te voorkomen dat bewegings artefacten tijdens het verzamelen van ECG-gegevens. De meeste laboratoria gebruiken onderdompeling tricaïne (ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonaat, MS-222).<ol>
<li>Om de tricaïne 0,4% voorraadoplossing te maken, combineert u de volgende items in een met schroef afgetopte donkere glazen fles: 400 mg tricaïne poeder, 98 mL dubbel gedestilleerd water en 2 mL 1 M Tris (pH 9). Aanpassen aan pH 7,0 met 1 N NaOH of 1 N HCl indien nodig8.</li>
		<li>Om de tricaïne laatste onderdompeling oplossing te maken, bepalen van de minimale concentratie die geschikt is voor de zebravis leeftijd9, grootte, metabole toestand, stam, ziekte model, wetenschappelijke doelstellingen, en procedurele duur.</li>
		<li>Voer een tricaïne concentratie-respons onderzoek uit, titreren omhoog of omlaag van de aanbevolen concentratie van 168 mg/L (of 0,0168%)9 indien nodig, om niveau 4 anesthesie binnen 3 minuten te bereiken met de minste mogelijke Cardiorespiratoire toxiciteiten. Bijvoorbeeld, in deze studie, de onderdompeling van wild-type AB zebravis van 12-18 maanden van leeftijd in een 0,02-0,04% tricaïne oplossing zal induceren niveau 4 van anesthesie binnen 3 min. Opmerking: op niveau 4 van de anesthesie, evenwicht en spierspanning zijn volledig verloren en operculaire beweging snelheid wordt verlaagd8.</li>
		<li>Raadpleeg indien nodig de dierenarts van het Comité voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC) voor aanvullende richtsnoeren voor de geschiktheid van de selectie van anestheticum (s) en toedieningsweg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dompel een volwassen zebravis onder in een schotel met tricaïne oplossing van de laagste vooraf bepaalde en IACUC-goedgekeurde concentratie (bijv. 0,02-0,04% in deze studie) om niveau 4 anesthesie binnen 3 minuten te induceren (Figuur 2).<ol>
<li>Voor het Survival ECG-protocol houdt u de ECG-opnamesessie zo kort mogelijk (minder dan 10 minuten). Voor korte ECG-opnamesessies die minder dan 15 minuten duren, is anesthesie onderhoud niet nodig.</li>
		<li>Voor lange ECG opnamesessies urenlang, gebruik maken van een lange-acteren intramusculaire Paralytische en een oraal perfusie systeem om voldoende hydratatie en oxygenatie6te bieden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ECG lood plaatsing
<ol><li>Zodra de zebravis niveau 4 van de anesthesie voor 3 s handhaaft, gebruikt u een paar stompe tang om de vis onmiddellijk over te brengen op de vochtige spons spleet met het ventrale oppervlak bovenaan voor het plaatsen van ECG-lood elektroden (Figuur 4).</li>
	<li>Breng de drie ECG-lood elektroden zachtjes in de vismusculatuur tot ongeveer 1 mm in diepte om een bipolaire lood in het frontale vlak te vestigen dat parallel loopt aan de linker caudal-rechter schedel oriëntatie van de cardiale hoofdas.</li>
	<li>Plaats de positieve (rode) elektrode in de ventrale middenlijn op het niveau van de bulbus arteriosus, d.w.z. op 1-2 mm boven een denkbeeldige lijn die de twee onderste randen van de operculums verbindt (figuur 4a).</li>
	<li>Plaats de negatieve (zwarte) elektrode caudally en 0,5-1,0 mm links lateraal naar de positieve elektrode, op een afstand groter dan de maximale apicobasal lengte van de volwassen zebravis ventrikel (figuur 4a).</li>
	<li>Plaats de referentie (groene) elektrode caudally, in de buurt van het anale gebied. Let op: aangezien de hart hoofdas enigszins varieert van vis tot vis, om de R-en T-golf amplituden te maximaliseren, past u de lead posities aan door alleen kleine, systematische veranderingen door middel van trial and error te maken. Verander bijvoorbeeld een elektrode (positief of negatief), in plaats van beide elektroden, op een tijdstip en maak geleidelijke veranderingen in een bepaalde richting voordat u naar een andere richting gaat in plaats van onregelmatige wijzigingen in willekeurige richtingen te maken.</li>
</ol>4. ECG-opname
<ol><li>Open het ECG-gegevensverwervings programma. Selecteer een gewenste instelling in de vervolgkeuzemenu's voor Range, low pass en High Pass. De volgende instelling in het in vivo ECG-opnamesysteem dat in dit experiment wordt gebruikt, levert bijvoorbeeld een consistente, bevredigende signaal-ruis verhouding op voor een normale volwassen zebravis: bereik "2 mV", low pass "120 Hz" en High Pass "0,03 s".</li>
	<li>Druk op Start om continue gap-Free ECG-opname te starten bij een samplingfrequentie van 1 kHz.</li>
	<li>Om de lood positionering te optimaliseren voor de maximale signaal-ruis verhouding, drukt u op Stop om de ECG-opname te stoppen en de ECG-tracering te controleren kort na de allereerste opname poging voor elk hart.  Om te diagnosticeren dat een ECG voor volwassen zebravis normaal is, bevestigt u dat aan alle volgende vier validerende criteria is voldaan (Figuur 1):<ol>
<li>Criterium 1: Zorg ervoor dat alle ECG-golfvormen (P, QRS en T) verschillend zijn en gemakkelijk zichtbaar zijn.</li>
		<li>Criterium 2: Zorg ervoor dat de P-golf positief is.</li>
		<li>Criterium 3: Zorg ervoor dat het netto QRS-complex positief is (d.w.z. de R-Golf amplitude is groter dan de som van Q-en S-golf amplitudes).</li>
		<li>Criterium 4: Zorg ervoor dat de T-golf positief is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als een normaal ECG wordt verwacht, herpositioneer de elektroden (Probeer eerst de negatieve elektrode), indien nodig, totdat aan alle vier de validerende criteria is voldaan.</li>
	<li>Als een normale T-golf wordt verwacht, maar de T-golf is te klein, plaats de elektroden om de T-Golf amplitude te maximaliseren.</li>
	<li>Hervat de ECG-opname na optimalisatie van de lood positionering. Sla de ECG-veegmachine op voor daaropvolgende analyse.</li>
</ol>5. herstel van de anesthesie
<ol><li>Aan het einde van de ECG-opnamesessie, verwijder voorzichtig de elektroden zonder de vis te inwonden. Breng de vis over naar vers, zuurstofvrij viswater met tricaïne.</li>
	<li>Om het herstel van anesthesie te vergemakkelijken, spuit het water over de kieuwen krachtig met een Pasteur-pipet totdat de vis de reguliere Gill-beweging of zwemmen hervat.</li>
	<li>Monitor de vis voor volledig herstel van de anesthesie (meestal 1-2 min), zoals aangegeven door de vis vermogen om rechtop te zwemmen voor ten minste 5 s.</li>
</ol>6. ECG-interpretatie
<ol><li>Definieer de analyse-instellingen.<ol>
<li>Ken de software-interface (tabel met materialen) door het lezen van de gebruiksaanwijzing van de ECG data analysis software. Opmerking: Hoewel de onderstaande aanwijzingen specifiek zijn voor de commerciële software die in ons laboratorium wordt gebruikt, zijn de basistaken die moeten worden uitgevoerd in essentie hetzelfde in elk softwarepakket voor ECG-analyse.</li>
		<li>Open het ECG data-analyseprogramma. Selecteer in het menu bestand de optie openen om het ECG-bestand van belang te openen en de volledige ECG-tracering weer te geven. Gebruik de muis om een deel van de interesse in de ECG-tracering te slepen om te analyseren.</li>
		<li>Selecteer in het menu ECG-analyse de optie ECG-instellingen om een dialoogvenster te openen voor het vooraf definiëren van verschillende parameterinstellingen voor automatische analyse van software (figuur 5a).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer het hartritme en de snelheid. Opmerking: hartslag is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder leeftijd en stam van de zebravis, anesthesie middelen (bijv. tricaïne, Isofluraan, enz.) en concentratie, anesthesie gebruik (enkelvoudige agent5,7 versus gecombineerde agenten5) en belichtingstijd5. Bijvoorbeeld, in deze studie was de hartslag van 12-18 maand-oude wild-type AB zebravis na 3-5 minuten onderdompeling in 0,02-0,04% tricaïne oplossing was 116 ± 17 slagen per minuut (n = 9), consistent met literatuur rapporten van de hartslag voor deze leeftijdsgroep en anestheticum5,7.<ol>
<li>Bepaal of het hartritme sinus of niet, regelmatig of onregelmatig is. Opmerking: de aanwezigheid (of afwezigheid) van sinusritme is gebaseerd op de aanwezigheid (of afwezigheid) van een rechtopstaande P-golf voorafgaand aan elke QRS met een normaal PR-interval (bijv. 60-65 MS voor de 10-12 maand oude7 en 12-18 maand oude wild-type AB zebravis in deze studie). De regelmatigheid van de atriale en ventriculaire ritme (of onregelmatigheid) is gebaseerd op de regelmatigheid (of onregelmatigheid) van respectievelijk opeenvolgende PP-of RR-intervallen.</li>
		<li>Om de hartslag te bepalen, moet u ervoor zorgen dat de software alle P-en R-golven correct identificeert. Op basis van deze automatische identificaties (of handmatige correcties) van de P-en R-golven meet de software automatisch alle PP-en RR-intervallen in de ECG-selectie, berekent de interval gemiddelden om de atriale en ventriculaire snelheid te genereren. Opmerking: het atriale tarief is het gemiddelde PP-interval, terwijl de ventriculaire snelheid het gemiddelde RR-interval is. Om de hartslag te bepalen, is de juiste identificatie van de P-en R-golven van cruciaal belang.</li>
		<li>Corrigeer eventuele fouten met automatische identificatie door de misplaatste cursors naar de juiste P-en R-golven te verplaatsen (Figuur 5b). Opmerking: als het hart in sinusritme is, zijn het atriale tarief en de ventriculaire snelheid hetzelfde vanwege de één-op-één correspondentie tussen de sinus-P-golven en de QRS-complexen. In het geval van Atrioventriculaire dissociatie (bijv. in ventriculaire tachycardie of derde-graad Atrioventriculaire blok), gaat deze één-op-één correspondentie tussen de P-golven en QRS-complexen verloren; Daarom zijn er twee hartfrequenties omdat het atriale tarief verschilt van de ventriculaire snelheid.</li>
		<li>Bepaal de hartslag op basis van ten minste vijf opeenvolgende volledige hart cycli als het hartritme regelmatig is, of een strook van ten minste zes seconden als het hartritme onregelmatig is.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereken intervallen en Golf duur.<ol>
<li>Ga naar ECG-analyse &Gt; Middelings weergave om n (bijv. 5) opeenvolgende cardiale cycli in één gemiddeld signaal (figuur 5c) samen te voegen. Opmerking: als de ECG-golfvormen van een individuele cardiale cyclus aanzienlijk afwijken van het gemiddelde signaal, bestudeer die cardiale cyclus afzonderlijk zonder aaneenvoeging.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de software correct het begin en einde van de P Wave, QRS complex en T Wave weergegeven in de Gemiddeldenweergave venster (figuur 5c) identificeert. Op basis van deze automatische identificaties (of handmatige correcties) van deze golven en intervallen meet de software automatisch de duur zoals deze conventioneel is gedefinieerd. Opmerking: het PR-interval loopt van het begin van de P-golf tot het begin van het QRS-complex (of het RS-complex als de Q-Golf niet zichtbaar is). De duur van de QRS loopt van het begin van de Q-Golf (of de R-golf als de Q-Golf niet zichtbaar is) tot aan het einde van de S-Golf (d.w.z. het J-punt; Figuur 1). Het QT-interval loopt van het begin van de Q-Golf (of de R-golf als de Q-Golf niet zichtbaar is) tot het einde van de T-golf. Daarom is voor het berekenen van intervallen en duur, de juiste identificatie van het begin en het einde van de P Wave, QRS complex en R Wave van cruciaal belang.</li>
		<li>Corrigeer eventuele fouten met automatische identificatie door de misplaatste cursors naar de juiste posities te verplaatsen.</li>
		<li>Selecteer de negatieve piek van de S Wave als het einde van het QRS complex7 omdat het zebravis J-punt dat het einde van de s-Golf signaleert, bijzonder moeilijk kan zijn om nauwkeurig te identificeren. Dit zal leiden tot een lichte onderschatten van de werkelijke duur van de QRS. Opmerking: de ECG-analyse software corrigeert automatisch het QT-interval op de ventriculaire snelheid (of RR-interval) om het gecorrigeerde QT-interval QTc te genereren met behulp van de methode die vooraf door de gebruiker is geselecteerd in stap 6.1.3, bijvoorbeeld Bazett (figuur 5a). De formule van de Bazett (1920) QTc = qt/√ RR is de meest populaire en de eerste van verschillende methoden die worden voorgesteld om het humaan QT-interval voor hartslag te corrigeren. Omdat de juistheid van de formule van de Bazett in twijfel is getrokken, verwijzen we naar andere methoden die worden voorgesteld voor mensen10,11 en zebravis6 (figuur 5d).</li>
	</ol></li>
	<li>Interpreteer ECG-afwijkingen door uitzonderingen te herkennen voor de vier validerende criteria in stap 4,3.<ol>
<li>Uitzonderingen voor criterium 1 herkennen. Bij afwezigheid van enige P-golven (die de afwezigheid van sinusritme aangeeft), vertrouw op de RR-intervallen en QRS-duur om het hartritme te diagnosticeren. Bijvoorbeeld, als de RR-intervallen irregulier onregelmatig zijn, diagnose Boezemfibrillatie; Als de RR-intervallen regelmatig zijn en de QR'S normaalgesproken smal zijn, diagnosticeer dan het ritme van de vlucht; aan de andere kant, als de RR-intervallen regelmatig zijn en de QRS abnormaal verlengd is, diagnosticeer dan het ventriculaire Escape ritme.</li>
		<li>Uitzonderingen voor criterium 2 herkennen. Wanneer de P-golf negatief (of omgekeerd) is, diagnosticeer dan een retrograde atriale activering van een ectopische pacemaker (zoals een atriale site stroomafwaarts van de sinus node, het Atrioventriculaire knooppunt of de ventrikel).</li>
		<li>Uitzonderingen voor criterium 3 herkennen. Wanneer hoge en smalle Q-golven aanwezig zijn met negatieve P-en negatieve T-golven, diagnosticeren ze de lead omkering vanwege een foutieve schakelaar van de positieve en negatieve elektrode posities, omdat die hoge en smalle Q-golven de ware R-golven ten onrechte omgekeerd waren (figuur 6d ). Daarentegen, wanneer brede Q-golven aanwezig zijn met positieve P-golven na significant hart letsel, een myocardinfarct diagnosticeren omdat die brede Q-golven echte pathologische Q-golven zijn.</li>
		<li>Uitzonderingen voor criterium 4 herkennen. Wanneer de T-golf omgekeerd is, Inspecteer dan de ventriculaire activering om vast te stellen of de abnormaliteit van de ventriculaire repolarisatie primair of secundair is. Vertrouw op het klinische scenario te verfijnen van de juiste diagnose van een differentiële lijst van primaire ventriculaire repolarisatie abnormaliteit (van drug effecten of myocardiale ischemie; Figuur 6C) versus secundaire ventriculaire repolarisatie afwijking (als gevolg van afwijkende ventriculaire activering van pre-excitatie, ventriculaire ectopy, of ventriculaire pacing).</li>
	</ol></li>
	<li>Export ECG bevindingen.<ol>
<li>Selecteer tabel weergave om alle ECG-metingen te bekijken. Selecteer de metingen van de interesse die u wilt kopiëren en plakken in het gewenste document (bijvoorbeeld Excel-spreadsheet).</li>
		<li>Als u een ECG-trace wilt exporteren, markeert u een deel van de interesse in de ECG-sweep met het vergrootglaspictogram. Kopiëren en plakken in het gewenste document (bijvoorbeeld Word of PowerPoint).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome.">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li><li>Hassel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+zebrafish+ether-a-go-go-related+gene+channel+gating+causes+short-QT+syndrome+in+zebrafish+reggae+mutants.">Deficient zebrafish ether-a-go-go-related gene channel gating causes short-QT syndrome in zebrafish reggae mutants.</a> Circulation. 117 (7), 866-875 (2008).</li><li>Meder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+defective+protein+trafficking+rescues+Long-QT+syndrome+in+zebrafish.">Reconstitution of defective protein trafficking rescues Long-QT syndrome in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 408 (2), 218-224 (2011).</li><li>Sieber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+preclinical+in+vivo+screening+model+for+nanomedicines.">Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , (2019).</li><li>Lin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+and+economic+in+vivo+electrocardiogram+platform+for+cardiovascular+drug+assay+and+electrophysiology+research+in+adult+zebrafish.">Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish.</a> Science Reports. 8 (1), 15986 (2018).</li><li>Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+of+adult+zebrafish+electrocardiogram+and+assessment+of+drug-induced+QT+prolongation.">In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 291 (1), H269-H273 (2006).</li><li>Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+surface+ECG+recording+in+adult+zebrafish+reveals+that+the+value+of+this+model+exceeds+our+expectation.">Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation.</a> Science Reports. 6, 25073 (2016).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Ilar Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Sagie, A., Larson, M. G., Goldberg, R. J., Bengtson, J. R., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+adjusting+the+QT+interval+for+heart+rate+(the+Framingham+Heart+Study).">An improved method for adjusting the QT interval for heart rate (the Framingham Heart Study).</a> American Journal of Cardiology. 70 (7), 797-801 (1992).</li><li>Luo, S., Michler, K., Johnston, P., Macfarlane, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commonly+used+QT+correction+formulae:+the+effect+of+heart+rate+on+the+QTc+of+normal+ECGs.">A comparison of commonly used QT correction formulae: the effect of heart rate on the QTc of normal ECGs.</a> Journal of Electrocardiology. 37 Suppl, 81-90 (2004).</li><li>Vornanen, M., Hassinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+heart+as+a+model+for+human+cardiac+electrophysiology.">Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology.</a> Channels (Austin). 10 (2), 101-110 (2016).</li><li>Tsai, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+recording+of+adult+zebrafish+heart+electrocardiogram+-+a+platform+for+pharmacological+testing).">In-vitro recording of adult zebrafish heart electrocardiogram - a platform for pharmacological testing).</a> Clinica Chimica Acta. 412 (21-22), 1963-1967 (2011).</li><li>Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+5+anesthetics+in+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio).</a> Journal of American Association of Lab Animal Sciences. 53 (2), 198-203 (2014).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Nkx2.5-Calr-p53+signaling+pathway+by+hyperglycemia+induces+cardiac+remodeling+and+dysfunction+in+adult+zebrafish.">Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish.</a> Disease Model and Mechanism. 10 (10), 1217-1227 (2017).</li><li>Franz, M. R., Bargheer, K., Rafflenbeul, W., Haverich, A., Lichtlen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monophasic+action+potential+mapping+in+human+subjects+with+normal+electrocardiograms:+direct+evidence+for+the+genesis+of+the+T+wave.">Monophasic action potential mapping in human subjects with normal electrocardiograms: direct evidence for the genesis of the T wave.</a> Circulation. 75 (2), 379-386 (1987).</li><li>Chiale, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+electrocardiographic+manifestations+of+ventricular+repolarization+memory.">The multiple electrocardiographic manifestations of ventricular repolarization memory.</a> Current Cardiology Reviews. 10 (3), 190-201 (2014).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+multifunctional+integumentary+membranes+for+spatiotemporal+cardiac+measurements+and+stimulation+across+the+entire+epicardium.">3D multifunctional integumentary membranes for spatiotemporal cardiac measurements and stimulation across the entire epicardium.</a> Nature Communications. 5, 3329 (2014).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bij het opnemen in vivo ECG voor volwassen zebravis door middel van één lood zoals we in deze studie hebben aangetoond, zijn er een aantal kanttekeningen met betrekking tot de kwaliteit en geldigheid van de ECG-opnameresultaten. Ten eerste, bij het kiezen van de juiste anesthetica en het bepalen van de minimaal benodigde anesthesie concentratie, diepte, en duur, balanceren de anesthetische cardiotoxiciteit tegen de kritieke noodzaak om bewegings artefacten te onderdrukken en a priori bepaling voor een Survival versus een terminaal experimenteel ontwerp. Het kapitaliseren op de synergetische potentie van een combinatie van meerdere anesthetica van verschillende geneesmiddelen klassen 5,14 en paralytics1,6om de dosis van individuele agenten te verlagen5 of toedienen een lage onderhoudsdosis na een hogere inductie dosis zijn typische strategieën. Ondanks de bekende potentiële Cardiorespiratoire toxiciteiten, waaronder Death8, is tricaïne echter nog steeds de meest gebruikte, de best beschikbare, en de enige verdoving goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor zebravis Anesthesie. Tricaïne is in de volksmond gebruikt in ECG-opname van volwassen zebravis, hetzij als een enkele agent of in combinatie met andere anesthetica of verlamming.
Ten tweede kan de nauwkeurigheid van de lood plaatsing worden verzekerd ten minste voor gezonde normale zebravis met behulp van onze vier validerende criteria voor een normaal volwassen zebravis-ECG. Van de vier validerende criteria die wij hier voorstellen, bevestigen de laatste twee criteria samen de fundamentele concordantie tussen de polariteit van de R-golf en die van de T-golf in een normaal ECG5,7,15. Deze R-en T-golf concordantie is een toevallige, maar toch kritische gelijkenis tussen zebravis en humane16,17 normaal ECG dat bijdraagt aan de klinische relevantie van het zebravis hart model als surrogaat voor menselijke cardiale Elektrofysiologie. Verschillende goedaardige of kwaadaardige omstandigheden kunnen echter een van de vier validerende criteria ongeldig verklaren. De R-en T-golf concordantie gaat bijvoorbeeld verloren in myocardiale ischemie7,15. Dit verlies van R en T golf concordantie in myocardiale ischemie is een andere opvallende gelijkenis tussen zebravis en menselijk ECG dat bijdraagt aan de klinische relevantie van het zebravis myocardinfarct model.
Ten slotte bevelen we een standaard praktijk aan in ECG-analyse. Met de opkomst van technologie kan ECG-analyse software automatische ECG-interpretatie genereren. We raden echter sterk aan dat getrainde mensen altijd opnieuw moeten interpreteren en alle Ecg's moeten verifiëren op basis van het respectieve klinische scenario dat leidt tot ECG-opname. Routine matige overafhankelijkheid uitsluitend op automatische interpretatie door een ECG-analyse software wordt afgeraden, met name in de aanwezigheid van gemeenschappelijke normale ECG-varianten, cardiale pathologieën of suboptimale lood plaatsing.
Deze studie richt zich op de minimaal invasieve methode voor korte ECG-opnamesessies. Echter, moet de noodzaak voor Terminal langdurige ECG opnamesessies uren duren, wijzigingen zijn nodig om voldoende oxygenatie, hydratatie, en anesthesie door continue perfusie6.
Verbeter bovendien de signaal-ruis verhouding met een van de ten minste drie manieren. Het kiezen van een krachtigere versterker is vaak een dure, zo niet onpraktische, optie. Het openen van de pericardiale SAC om de volume geleider te verminderen is een redelijke, hoewel invasieve, benadering die is aangenomen7. Strategische lead plaatsing om de lead-as uit te lijnen in een richting parallel aan de belangrijkste cardiale as (figuur 4b) zal de ECG-spannings signalen maximaliseren, maar kan trial and error vereisen, vooral bij afwezigheid van pericardiotomie.
De in vivo ECG ondervrachting voor volwassen zebravis die we hier hebben gepresenteerd, biedt vier belangrijke voordelen. Ten eerste, onze minimaal invasieve aanpak vereist alleen elektrode inbrengen, maar geen visschaal verwijdering of Thoracotomie-pericardiotomie. Daarom, door het minimaliseren van pijn voor de vis, onze aanpak maakt herhaalde ECG ondervragingen in longitudinale overleving studies. Ten tweede, wanneer anesthetica de beweging van de vissen adequaat onderdrukken, levert het in vivo ECG-opnamesysteem in onze studie consequent een bevredigende signaal-ruis verhouding met ruisvrije RAW-signalen. Ten derde, de vier-criterium kwaliteits validatie die wij hier voorstellen, waarborgt de nauwkeurigheid en robuustheid van gegevens in het begin van de ECG-gegevensverwerving en minimaliseert operator afhankelijke variaties. Tot slot omvat ons laatste validerende criterium (de normale T-golf is rechtop) de concordantie van de R-golf en T-golf, een belangrijk mensachtig kenmerk van zebravis normaal ECG (Figuur 1).
Er bestaan echter nog vier belangrijke beperkingen voor de huidige in vivo ECG-methodologie voor volwassen zebravis door onze groep en anderen.
Ten eerste vereist het gebrek aan samenwerking tussen de onderwerpen de noodzaak van anesthesie met de beperkende gevolgen voor de cardiorespiratoire toxiciteit. Voor in vivo ECG ondervraging, terwijl menselijke patiënten nooit sedatie nodig hebben, vereist zebravis altijd verdoving of verlamming, die allemaal een variabele Cardiorespiratoire toxiciteit veroorzaken.
Ten tweede, de noodzaak om de bijgevoegde ECG-leidingen te beveiligen licht verheft de invasiviteit van een anders niet-invasieve procedure. Overwegende dat lood plaatsing in de lichaamsoppervlakte ECG-opname van mensen volledig niet-invasief is omdat elektroden zich houden aan de menselijke epidermis, lood plaatsing voor in vivo ECG-opname van zebravis is meer invasief omdat, minimaal, stalen elektroden moeten Prik de visschil voor een veilige plaatsing in de visspieren.
De laatste twee beperkingen vloeien voort uit de anatomische beperkingen van de zebravis kist en het hart. Ten derde vereist de minuscule grootte van het volwassen zebravis hart een drastische vermindering van het aantal ECG-leads. Terwijl mensen gemakkelijk plaats bieden aan twaalf leads in een standaard ECG-opname, kan volwassen zebravis meestal slechts één unipolaire of bipolaire lead herbergen. De vertachting van een enkele ECG-lood is de uitdaging om gelijktijdig de amplitudes van alle drie de P, R, en T golven te optimaliseren. Daarom kan het belang van een optimale en accurate lood plaatsing in de zebravis ECG-ondervraging niet worden overschat. In zebravis presenteert de T Wave een unieke detectie uitdaging omdat het vaak de kleinste van deze drie golven is. Daarom moet de zebravis T Wave amplitude optimalisatie prioriteit krijgen over de meestal grotere P-en R-golven.
Ten vierde kan het bepalen van de zebravis belangrijkste cardiale as om de R-Golf amplitude te maximaliseren een uitdaging zijn. De reden hiervoor is dat het zebravis-hart meer bewegingsvrijheid heeft binnen zijn losse pericardiale SAC in vergelijking met het menselijk hart in zijn nauwsluitende handschoen-achtige pericardium.
Over het geheel genomen zullen deze beperkingen toekomstige methode-innovatie stimuleren. Met de komst van 3D-printen en vervormbare elektronica18, is er hoop voor directe lood implantatie op een dag in wakker, alert, zwemmen zebravis met behulp van een ' cardiale sok ' van draadloze elektrode sensoren.

Het hart van de zebravissen (Danio rerio) ligt anteroventraal in de thoracische holte tussen de Operculum en de borst gordel. Het hart is vrij losjes ingesloten in een zilverkleurige pericardiale SAC. Anatomisch gezien is het zebravis hart verschillend van de vier-Chambered mens en andere zoogdier harten vanwege zijn verkleinde schaal (100-fold kleiner dan het menselijk hart) en zijn twee-Chambered structuur bestaande uit slechts één atrium en één ventrikel. Niettemin zijn de golfvormen van het elektrocardiogram (ECG) en de duur van het QT-interval van beide soorten opmerkelijk gelijkaardig (Figuur 1). Daarom is zebravis ontstaan als een populair model voor het bestuderen van menselijk geërfd aritmie1,2,3 en voor high-throughput drug screening van potentiële menselijke cardiotoxiteiten4,5 , zoals qt-verlenging.
Bij de routinematige evaluatie van menselijke hartziekten is het lichaam-oppervlakte ECG sinds de uitvinding door Einthoven in 1903 uitgegroeid tot het meest gebruikte eerste-regel niet-invasieve diagnose hulpmiddel. Aangezien de eerste aanpassing van de lichaamsoppervlakte ECG-opnamemethode voor volwassen zebravis in 20066 en enkele wijzigingen daarna7, is deze techniek echter grotendeels ontoegankelijk gebleven voor veel onderzoekers op het gebied, ondanks de populariteit van dit diermodel. Voor andere onderzoekers die in vivo ECG ondervraging voor volwassen zebravissen uitvoerde, leidden grote variaties tussen operatoren tot inconsistenties in ECG-bevindingen uit verschillende studies. Veelvoorkomende redenen zijn onder andere omslachtige en dure gespecialiseerde apparaten en software, lage signaal-ruis verhouding en verwarring over de plaatsing van de elektrode, alle verder verergerd door een onvolledig begrip van de volwassen zebravis ECG-functies en onderliggende weefsel mechanismen. Gezien het feit dat in vivo ECG het enige diagnostische instrument is voor elektrisch fenotype levende zebravis, is er een duidelijke behoefte aan een gestandaardiseerde methode om de gevoeligheid en specificiteit, reproduceerbaarheid en toegankelijkheid te verbeteren.
Hier presenteren we een praktische, betrouwbare en gevalideerde aanpak voor het opnemen en interpreteren van zebravis in vivo elektrocardiogrammen (Figuur 2). Met behulp van een enkele bipolaire lood in het frontale vlak, onderzochten we de veranderingen in ECG-golfvormen en interval duur van levende verdoemde gezonde wild-type AB volwassen zebravis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB087571</td>
			<td>100 mm x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td>0.1 x 0.06 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE136 Animal Bio Amp&#160;</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>FE231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>11064-07</td>
			<td>0.6 x 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart 8 Pro</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software with ECG Module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle electrodes for Animal Bio Amp&#160;</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLA1213</td>
			<td>29 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td>6 in., 1.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 4/35</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>4//35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm, 0.075 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo surface electrocardiography for adult zebrafish

Het elektrocardiogram golfvormen van volwassen zebravis en die van de mens zijn opmerkelijk gelijkaardig. Deze gelijkenissen met elektrocardiogrammen versterken de waarde van zebravis niet alleen als een onderzoeksmodel voor menselijke cardiale elektrofysiologie en myopathieën, maar ook als surrogaat model in een hoge doorvoer van farmaceutische screening op mogelijke cardiotoxiciteiten mensen, zoals QT-verlenging. Als zodanig is in vivo elektrocardiografie voor volwassen zebravis een elektrisch fenotyping-instrument dat noodzakelijk, zo niet onmisbaar, is voor transversale of langsin vivo elektrofysiologische karakterisaties. Maar te vaak blijft het ontbreken van een betrouwbare, praktische en kosteneffectieve opnamemethode een belangrijke uitdaging om te voorkomen dat dit in vivo diagnostische instrument gemakkelijker toegankelijk wordt. Hier beschrijven we een praktische, eenvoudige benadering van in vivo elektrocardiografie voor volwassen zebravis met een onderhoudsarme, kosteneffectieve en uitgebreide systeem dat consistente, betrouwbare opnames oplevert. We illustreren ons protocol met behulp van gezonde volwassen mannelijke zebravis van 12-18 maanden oud. We introduceren ook een snelle real-time interpretatie strategie voor kwaliteits validatie om de nauwkeurigheid en robuustheid van gegevens vroegtijdig in het opnameproces van het elektrocardiogram te garanderen.

Figuur 1 illustreert de klinische relevantie van de hier gepresenteerde methode. In vivo oppervlakte elektrocardiografie voor volwassen zebravis is een essentiële elektrische fenotyping tool vanwege de opmerkelijke gelijkenissen tussen de zebravis en menselijke ECG ondanks hun enorme anatomische verschillen. Het zebravis hart heeft slechts één atrium en een ventrikel in tegenstelling tot het menselijk hart met twee atria en twee ventrikels (bovenste rij; respectievelijk rechts en links). Echter, ondanks zijn schijnbare anatomische eenvoud, het zebravis hart deelt verschillende ECG functies met het menselijk hart (onderste rij; respectievelijk rechts en links) het zebravis hart is daarom ontstaan als surrogaat model voor menselijke cardiale elektrofysiologie5,12,13. Figuur 1 illustreert een kleine maar duidelijke Q Wave van een levende, gezonde 14 maanden oude zebravis. Echter, in zebravis ECG, lood positionering is niet algemeen geoptimaliseerd om te demonstreren de Q Wave. Daarom is de Q-Golf vaak onzichtbaar en wordt een RS-complex vaker gezien dan het volledige QRS-complex in zebravis-ECG.
Figuur 2 vat de vier essentiële actiestappen samen om minimaal invasieve in vivo elektrocardiografie voor volwassen zebravis uit te voeren. Na anesthesie inductie (stap 1) en elektrode plaatsing (stap 2), hebben we Baseline ECG-signalen opgenomen (stap 3) van gezonde wild-type AB-zebravis van 12 tot 18 maanden oud (n = 9). Onze elektrode invoegings techniek was slechts minimaal invasief omdat we geen visweegschalen nodig hadden of pericardiotomie moesten uitvoeren. Na het verzamelen van gegevens hebben we elke ECG-opname handmatig beoordeeld en geverifieerd (stap 4) om mogelijke verkeerde interpretatie door automatische analyse van software te voorkomen.
Figuur 3 toont de drie onmisbare componenten van een typisch ECG data-acquisitie-en verwerkingssysteem: een High-Performance Data Acquisition hardware, een High-Gain differentiële versterker en een computer die is geupload met software voor ECG-gegevens acquisitie en analyse. In ons laboratorium hebben we een bestaand commercieel in vivo ECG-opnamesysteem aangepast dat oorspronkelijk is ontworpen voor kleine zoogdier modellen (zoals muizen, ratten en konijnen) om tegemoet te komen aan het volwassen zebravis-model.
Figuur 4 toont aan dat de juiste lood plaatsing het lood moet uitlijnen met de veronderstelde cardiale hoofdas. In zebravis in vivo ECG-opname, omdat er slechts één enkele lood wordt gebruikt, is de juiste lood positionering om gelijktijdig zowel R-als T-golf amplituden te maximaliseren essentieel. Om R-en T-Wave amplituden te maximaliseren, hebben we de positieve en negatieve lood elektroden uitgelijnd met de cardiale hoofdas, vermoedelijk in de linker caudal naar de juiste craniale oriëntatie. Na Thoracotomie en pericardiotomie om de pericardiale SAC te openen en het hart bloot te leggen, wordt de hart hoofdas zichtbaar (figuur 4b witte stippellijn). In feite is pericardiotomie om het hart bloot te leggen een veelgebruikte strategie om de signaal-ruis verhouding7 te verhogen ten koste van het omzetten van de ECG-opname van een minimaal invasieve in een zeer invasieve ingreep.
Figuur 5 illustreert de kritieke stappen in ECG-analyse. Eerst hebben we de verschillende parameterinstellingen voor software automatische analyse vooraf gedefinieerd met behulp van het dialoogvenster ECG-instellingen (figuur 5a). Omdat we een bestaand ECG-opnameapparaat dat ontworpen is voor zoogdier modellen voor volwassen zebravissen hergebruiken, is de detectie-en analyse-instelling voor zebravis niet beschikbaar. We selecteerden de menselijke preset in plaats daarvan, gezien de opmerkelijke gelijkenis van zebravis ECG tot menselijke ECG (figuur 5a). Ten tweede, we handmatig geverifieerd de software automatische ECG-identificatie (in het zwart) van de R Wave pieken en corrigeren (in rood) eventuele R Wave auto-identificatie fouten voordat het bevel over de software om de gemiddelde ventriculaire snelheid te herberekenen. Bijvoorbeeld, in Figuur 5bheeft een grote P-golf ten opzichte van de r-Golf de software misleiden om de r-golven te misidentificeren, wat leidt tot de daaropvolgende automatische misberekening van het RR-interval of de ventriculaire snelheid. Daarom zijn menselijke verificatie en passende correcties zo nodig kritisch in ECG-analyse. Ten derde hebben we snel de ritme-regelmatigheid geëvalueerd en de gemiddelde duur van golven en intervallen berekend met behulp van de Gemiddeldenweergave (figuur 5c) om verschillende opeenvolgende cardiale cycli (groen) samen te voegen tot één gemiddeld signaal (zwart). Hier in figuur 5c, de verwaarloosbare afwijking tussen elk van de negen cardiale cycli en het gemiddelde signaal pleit voor de uitstekende ritme regelmatigheid van dit zebravis hart. Ten slotte hebben we de software in staat stelde om het QT-interval voor hartslag automatisch te corrigeren met behulp van Bazett, een van de zeven verschillende methoden die beschikbaar zijn (Figure 5d).
Figuur 6a -C demonstreert hoe de diepte van de elektrode plaatsing de amplitudes van de ECG-signalen beïnvloedt. Wanneer we verkeerd de elektroden te oppervlakkig geplaatst in de dermis (Figuur 6a), de leiding was "indirecte"-achtige (meer dan twee hart diameters van het hart, vergelijkbaar met de indirecte standaard menselijke ECG ledemaat I, II, en III) en de spanning signalen waren klein. Toen we op de juiste wijze de elektroden 1 mm dieper in de spieren van de pectoralis ingebracht (Figuur 6b), de lood werd "semidirect" (in de nabijheid, maar niet in direct contact met het hart) en de spannings signalen verhoogd. De ECG-golfvormen werden gemakkelijk zichtbaar. Echter, toen we verkeerd ingebracht de elektroden nog dieper in de ventrikel (figuur 6C), de lood werd "direct" (in direct contact met het hart) en de spanning signalen verder toegenomen. De R-Golf amplitude in figuur 6C steeg met acht-voudige in vergelijking met Figuur 6a en door viervoudige vergelijking met Figuur 6b. De ECG-trace in figuur 6C onthulde echter nieuwe tekenen van letsel aan het ventriculaire myocardium, zoals nieuwe St-depressie en nieuwe T-Wave-inversie.
Figuur 6d demonstreert hoe de ongewone inversies van alle ECG-golfvormen (P, Q, R, S en T) een fout in de lead omkering zouden moeten signaleren, waarbij de positieve en negatieve elektroden van plaats gewisseld werden. Merk op dat Q en S per definitie altijd negatief zijn, terwijl R altijd positief is.
Figuur 6e -F laat zien hoe ongepaste anesthesie diepte de kwaliteit van de in vivo ECG-opname kan aantasten. In figuur 6e, ontoereikende anesthesie (0,017% tricaïne) leidde tot falen om de zebravis volledig te immobiliseren. De resulterende bewegings artefacten hebben de signaal-ruis verhouding verlaagd door zowel het signaal (sterretje) te vervuveren als het lawaai (pijlen) te verhogen. Daarentegen, in figuur 6F, overgedoseerde anesthesie (0,08% tricaïne) geïnduceerde ernstige sinus bradyaritmie, alsmede veranderingen van het St-segment en T-golf.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig1.jpg"> Figuur 1: contrasterende anatomie en ECG van menselijke en zebravis harten. In tegenstelling tot het menselijk hart met twee atria en twee ventrikels, heeft het zebravis hart slechts één atrium en één ventrikel (bovenste rij). Afkortingen: RA, rechter Atrium; LA, linker Atrium; RV, rechter ventrikel; LV: linker ventrikel. Het zebravis-hart deelt verschillende gemeenschappelijke ECG-functies met het menselijk hart (onderste rij). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig2.jpg"> Figuur 2: minimaal invasief in vivo ECG opname protocol. Een schematische stroomdiagram illustreert vier kritische actiestappen bij het uitvoeren van een in vivo ECG ondervraging: induceren van anesthesie, plaats ECG lead elektroden, record ECG, en analyseren van de ECG-opnames. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig3.jpg"> Figuur 3: ECG-systeem voor gegevensverwerving en-verwerking. De drie belangrijkste componenten van een geïntegreerd in vivo ECG-opnamesysteem omvatten een hardware voor het verkrijgen van gegevens, een versterker en computer software voor het verzamelen en analyseren van gegevens. De versterker wordt geleverd met drie gebruiksklare 29-gauge roestvrijstalen micro elektroden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig4.jpg"> Figuur 4: ECG lood plaatsing. 3 29-gauge kleurgecodeerde roestvrijstalen elektroden worden stevig in de vismusculatuur gestoken tot ongeveer 1 mm diep. Plaatsing van de negatieve (zwarte) elektrode en de positieve (rode) elektrode brengt een bipolaire lood in het frontale vlak, langs een linker caudal naar rechts craniale oriëntatie. Afkorting: Ref, referentie-elektrode <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig5.jpg"> Figuur 5: C riticale stappen in ECG-analyse. (A) Definieer vooraf de verschillende parameterinstellingen voor automatische analyse van software. (B) handmatig corrigeren (rood) twee automatische verkeerde identificatie door de software (zwart) van de P-en R-golven om de onjuiste berekening van de Atrium-en ventriculaire snelheid van de software te corrigeren. (C) negen opeenvolgende hart cycli (groen) samenvoegen tot één gemiddeld signaal (zwart) om snel de ritme regulaties/onregelmatigheden te beoordelen en de gemiddelde duur van golven en intervallen te berekenen. (D) CORRIGEER het QT-interval voor hartslag met behulp van een van de verschillende methoden, zoals Bazett. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig6.jpg"> Figuur 6: effecten van lood plaatsing en anesthesie diepte op ECG-signalen. Twee meest kritische stappen die bepalend zijn voor het succes van in vivo ECG-opnames zijn lood plaatsing (a-D) en anesthesie diepte (E-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

Hier presenteren we een betrouwbare, minimaal invasieve en kosteneffectieve methode om elektrocardiogrammen op te nemen en te interpreteren in levende verdoemde volwassen zebravis.

In vivo oppervlakte elektrocardiografie voor volwassen zebravis

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

In vivo elektrische cardiografie is het enige diagnostische instrument voor elektrische fenotypering bij levende zebravissen in cross-sectionele en longitudinale studies. Onze aanpak is praktisch, minimaal invasief en kosteneffectief omdat we een data-acquisitiesysteem voor zoogdieren hergebruiken. We benadrukken de strategie van real-time ECG-interpretatie voor vroegtijdige validatie van de gegevenskwaliteit.Omdat de ECG's van menselijke en zebravissen vergelijkbaar zijn, vergemakkelijkt in vivo elektrocardiografie het gebruik van zebravissen bij het modelleren van de menselijke hartfysiologie en een screening van een hoge doorvoerdrug op cardiotoxiciteiten, zoals QT-verlenging. Correcte lead positionering is de sleutel tot succes. Omdat de normale zebravis T golf is de kleinste, prioriteren het optimaliseren van de amplitude over die van de grotere P en R golven.Bestudeer normale en pathologische ECG-patronen om je ECG-bevindingen zelf te interpreteren. Vertrouw niet alleen op automatische interpretatie van ECG-analysesoftware. Op de dag van het experiment vervoer je de zebravis van het aquarium naar het laboratorium.Om het in vivo ECG-opnamesysteem op te zetten, sluit u de essentiële apparatuur aan en voegt u de drie kleurgecodeerde, roestvrijstalen elektroden van de ECG-lood in de drie op kleur afgestemde toegangsportalen van de versterker. Voor inductie van verdoving van verdoving van niveau 4 dompel een volwassen zebravis onder in een schaal met een oplossing van verdoving bij de laagste vooraf bepaalde concentraties die zijn goedgekeurd door het comité voor de institutionele dierverzorging en -gebruik. Zodra de zebravis heeft gehandhaafd niveau 4 anesthesie gedurende drie seconden, gebruik maken van een paar botte tangen om onmiddellijk de vis over te brengen op een vochtige spons met een spleet, ventrale oppervlak omhoog, voor de plaatsing van de drie ECG-elektroden.Steek de positieve elektrode voorzichtig in de ventrale middellijn op het niveau van de bulbus arteriosus een tot twee millimeter boven een denkbeeldige lijn die de twee onderste randen van de operculums verbindt. Plaats de negatieve elektrode caudally en 0,5 tot een millimeter lateraal gelaten aan de positieve elektrode op een afstand groter dan de maximale apicobasale lengte van de volwassen zebravis ventrikel, plaats dan de referentie-elektrode caudally in de buurt van de anale regio. Start voor ECG-opname het systeem en open het ECG-programma voor gegevensverwerving.Selecteer een gewenste instelling in de vervolgkeuzemenu's voor bereik, lage pass en hoge pass. Druk op Start om continue gap-vrije ECG-opname te starten met een samplingsnelheid van één kilohertz. Druk op Stop om de opname te stoppen en het spoor kort na de allereerste opnamepoging voor elk hart te bekijken om de leadpositionering voor de maximale signaal-ruisverhouding te optimaliseren.Als de ECG naar verwachting normaal is, bevestig dan dat alle ECG-golfvormen duidelijk en gemakkelijk zichtbaar zijn en dat de P-golf, het NETTO QRS-complex en de T-golf allemaal positief zijn. De meest kritieke stap is leadpositionering om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren. Pas onze vier valideringscriteria toe na de allereerste ECG-opnamepoging voor elke vis om corrigerende feedback te verkrijgen.Als een normale ECG wordt verwacht, herpositioneren van de elektroden indien nodig totdat aan al deze vier valideringscriteria is voldaan. Als een normale T-golf wordt verwacht, maar de T-golf is te klein, herpositioneren van de elektroden om de T golf amplitude te maximaliseren. Hervat de ECG-opname na het optimaliseren van de leadpositionering, waardoor de ECG-sweeps worden opgeslagen voor latere analyses.Verwijder aan het einde van de ECG-opnamesessie de elektroden voorzichtig zonder de vissen te verwonden. Breng de vis in overlevingsstudies over op vers, zuurstofrijk viswater zonder tricaine. Houd er rekening mee dat, in deze video, om lezers te vergemakkelijken het bekijken van de vis herstel van anesthesie, oxygenatie wordt stopgezet.Om het herstel van de anesthesie in overlevingsstudies te vergemakkelijken, gebruikt u een Pasteur-pipet om krachtig water over de kieuwen te spuiten totdat de vis regelmatig kieuwbeweging of zwemmen hervat, controleer vervolgens de vis op volledig herstel van anesthesie voordat u de vissen terugstuurt naar het aquarium. De vis wordt beschouwd als volledig hersteld van anesthesie wanneer het kan zwemmen rechtop voor ten minste vijf seconden. Als u de analyse-instellingen wilt definiëren, opent u het ECG-gegevensanalyseprogramma en opent u het ECG-bestand dat van belang is om het volledige ECG-spoor weer te geven.Gebruik de muis om een gedeelte van belang in het ECG-spoor te slepen om te analyseren. Selecteer ECG-instellingen in het menu ECG-analyse om een dialoogvak te openen om verschillende parameterinstellingen voor automatische software-analyse vooraf te definiëren. Analyseer het hartritme en de snelheid en bepaal of het hartritme sinus is of niet, regelmatig of onregelmatig.Om de hartslag te bepalen, moet u ervoor zorgen dat de software alle P- en R-golven correct identificeert, omdat de atrium- en ventriculaire snelheid is gebaseerd op respectievelijk het PP- en RR-interval. Corrigeer fouten bij automatische identificatie door de verkeerd geplaatste cursors naar de juiste P- en R-golven te verplaatsen. Om intervallen en golfduur te berekenen, open ECG-analyse en gemiddelde weergave om meerdere opeenvolgende hartcycli te concatenate tot één gemiddeld signaal.Zorg ervoor dat de software het begin en einde van de P-golf, het QRS-complex en de T-golf correct identificeert en beweeg vervolgens de misplaatste cursors naar de juiste posities om fouten in automatische identificatie te corrigeren. Als u de ECG-metingen wilt exporteren, selecteert u Tabelweergave om alle ECG-metingen te bekijken en de metingen van belang in een spreadsheet te kopiëren en plakken voor latere analyses. Als u een ECG-spoor wilt exporteren, gebruikt u de vergrootglas om een gedeelte van de belangstelling voor de ECG-sweep te markeren en de sweep in het gewenste document te kopiëren en te plakken.In opdracht van het menselijk hart, dat twee atria en twee ventrikels heeft, heeft het zebravishart slechts één atrium en één ventrikel. Ondanks zijn schijnbare anatomische eenvoud deelt het zebravishart verschillende ECG-kenmerken met het menselijk hart. Een goede leadplaatsing vereist het uitlijnen van het lood met de veronderstelde hart hoofdas.Wanneer de elektroden te oppervlakkig in de dermis worden ingebracht, wordt het lood als indirect-achtig beschouwd en zijn de spanningssignalen klein. Wanneer de elektroden worden ingevoegd op de juiste een millimeter diepte in de pectoralis spierstelsel, het lood wordt semi-direct en de spanning signalen toenemen. Als de elektroden dieper dan een millimeter in de ventrikel worden ingebracht, wordt het lood echter direct en nemen de spanningssignalen nog verder toe, waarbij de R-golfamplitude met viervoudige toename toeneemt in vergelijking met wanneer de elektroden op de juiste diepte worden ingebracht.De ECG spoor van te diep ingevoegde elektroden onthult ook nieuwe tekenen van letsel aan de ventriculaire myocard, zoals een nieuwe ST depressie en een nieuwe T golf inversie. Als de positieve en negatieve elektroden worden geschakeld in hun plaatsing, worden ongebruikelijke inversies van alle ECG-golfvormen waargenomen. Een ongepast niveau van sedatiediepte kan ook de kwaliteit van de in vivo ECG-opname aantasten.Vergeet niet om diep genoeg te verdoven om de vis te immobiliseren zonder het te doden. Plaats de elektroden om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren en te veel afhankelijkheid van automatische softwareanalyse te voorkomen. Na deze minimaal invasieve overlevingsprocedure is het mogelijk om andere procedures uit te voeren, zoals gedeeltelijke ablatie, resectie van het hart of seriële ECG-onderzoeken in medicijnreacties of longitudinale studies.Systemische toxiciteiten zijn mogelijke complicaties van een verdoving, met inbegrip van tricaine. Deze toxiciteiten kunnen worden verminderd door te profiteren van de synergie van meerdere verdovingsmiddelen om de dosis individuele agentia te verlagen.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Bloedafname voor biochemische analyse bij volwassen zebravis

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult zebravis

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Herstel van de Adult zebravis Harten voor High-throughput Toepassingen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Herhaalde bloedafname voor Blood Tests in Adult zebravis

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...