Name: in vivo surface electrocardiography for adult zebrafish
Uploaded: 2019-08-01T15:00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health R01 HL141452 to TPN. ADInstruments vänligt gav generös finansiering för att täcka kostnaderna för Open Access-publicering men hade ingen roll i antingen experimentell design, datainsamling, dataanalys av denna studie eller någon tillgång till manuskriptet före offentliggörandet.

Alla experiment i denna studie genomfördes i enlighet med US National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur. Alla djur protokoll i denna studie godkändes av UCLA institutionella djuromsorg och användning kommittén.
1. förberedelse av försöks uppsättningen
<ol><li>Underhåll zebrafisk i genomflödesbaserade akvarium system på en 14 h ljus, 10 h mörk fotoperiod vid 28 ° c ± 0,5 ° c. Foder med flingmat dagligen och levande saltlake räkor (Artemia följande) två gånger dagligen. Zebrafish i denna studie upprätthölls och utfodrades av UCLA Zebrafish Core.</li>
	<li>På dagen för experimentet, transportera zebrafiskar från akvariet till laboratoriet.</li>
	<li>Ställ in vivo-systemet för EKG-registrering genom att ansluta de viktigaste delarna av utrustningen och sätta in de tre färgkodade elektroderna i rostfrittstål i förstärkarens tre färgmatchade åtkomst portaler (figur 3). Starta systemet i början av en EKG-inspelning och/eller analyssession.</li>
	<li>Upphandla nödvändiga verktyg, såsom en timer/stoppur, en våt svamp med en slits för att hålla fisken, pinpetter, sax, Pasteur pipetter och kultur rätter (100 mm x 20 mm).</li>
</ol>2. anestesi induktion
<ol><li>Förbered Immersion anestesi för smärtkontroll och fisk immobilisering att undvika rörelse artefakter under EKG datainsamling. De flesta laboratorier använder Immersion tricaine (etyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222).<ol>
<li>För att göra tricaine 0,4% Stock lösning, kombinera följande objekt i en skruv-utjämnade mörk glas flaska: 400 mg tricaine pulver, 98 mL dubbelt destillerat vatten, och 2 mL 1 M tris (pH 9). Justera till pH 7,0 med 1 N NaOH eller 1 N HCl vid behov8.</li>
		<li>För att göra tricaine Final Immersion lösning, bestämma den lägsta koncentrationen som är lämplig för zebrafiskar ålder9, storlek, metabola tillstånd, stam, sjukdoms modell, vetenskapliga mål, och processuella varaktighet.</li>
		<li>Utföra en studie av trikain koncentration-svar, titrering upp eller ner från den rekommenderade koncentrationen av 168 mg/L (eller 0,0168%)9 om nödvändigt, för att uppnå nivå 4 av anestesi inom 3 min med minsta möjliga kardiorespiratoriska toxiciteter. Till exempel, i denna studie, nedsänkning av vild typ AB zebrafiskar av 12-18 månaders ålder i en 0,02-0,04% tricaine lösning kommer att inducera nivå 4 av anestesi inom 3 min. Obs: på nivå 4 av anestesi, jämvikt och muskeltonus är helt förlorad och opercular rörelsehastighet reduceras8.</li>
		<li>Om det behövs, konsultera veterinären i den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) för ytterligare vägledning om lämpligheten av valet av anestesi (s) och administreringsväg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sänk ned en sebrafisk i en skål som innehåller trikain lösning av den lägsta förutbestämda och IACUC-godkända koncentrationen (t. ex. 0,02-0,04% i denna studie) för att inducera nivå 4 av anestesi inom 3 minuter (figur 2).<ol>
<li>För överlevnad EKG-protokollet, hålla EKG-inspelningssessionen så kort som möjligt (under 10 min). För korta EKG-inspelning sessioner som varar mindre än 15 min, anestesi underhåll är inte nödvändigt.</li>
		<li>För långa EKG-inspelning sessioner varar timmar, använda en långverkande intramuskulär paralytisk och ett oralt perfusion system för att ge riklig hydrering och syresättning6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. placering av EKG-bly
<ol><li>När zebrafiskar upprätthåller nivå 4 av anestesi för 3 s, Använd ett par trubbiga Pink för att överföra fisken omedelbart på fuktig svamp slits med sin ventrala yta överst för placering av EKG-bly elektroder (figur 4).</li>
	<li>Sätt försiktigt in de tre EKG-elektroderna i fisk muskulaturen till cirka 1 mm på djupet för att upprätta en bipolär ledning i frontallen som paralleller vänster caudal-höger kraniell orientering av hjärtats huvudaxel.</li>
	<li>Placera den positiva (röda) elektroden i den ventrala mittlinjen på nivån för Bulbus arteriosus, dvs vid 1-2 mm över en imaginär linje som förbinder de två nedre kanterna av operculums (figur 4a).</li>
	<li>Placera den negativa (svarta) elektroden caudally och 0.5-1.0 mm vänster i sidled till den positiva elektroden, på ett avstånd större än den maximala apikobasala längden av den vuxna zebrafiskar ventrikeln (figur 4a).</li>
	<li>Placera referens (grön) elektrod caudally, nära anala regionen. Obs: eftersom hjärtats huvudaxel varierar något från fisk till fisk, för att maximera R-och T-vågamplituderna, justera bly positionerna genom att göra endast små, systematiska förändringar genom försök och misstag. Till exempel ändra en elektrod (positiv eller negativ), i stället för båda elektroderna, i taget och göra gradvisa förändringar i en angiven riktning innan du byter till en annan riktning i stället för att göra oregelbundna förändringar i slumpmässiga riktningar.</li>
</ol>4. EKG-inspelning
<ol><li>Öppna datainsamlingsprogrammet för EKG. Välj önskad inställning i rullgardinsmenyerna för intervall, låg pass och hög pass. Till exempel ger följande inställning i det in vivo-EKG-inspelningssystem som används i detta experiment konsekvent, tillfredsställande signal-brus-förhållande för en normal vuxen Zebrafish: intervall "2 mV", låg pass "120 Hz" och hög pass "0,03 s".</li>
	<li>Tryck på Start för att starta kontinuerlig gap-fri EKG-inspelning med en samplingsfrekvens på 1 kHz.</li>
	<li>För att optimera bly positionering för maximal signal-brus-förhållande, tryck Stop för att stoppa EKG-inspelningen och granska EKG-spårningen strax efter det allra första inspelnings försöket för varje hjärta.  För att diagnostisera att ett vuxen sebrafiskekg är normalt, bekräfta att alla följande fyra valideringskriterier är uppfyllda (figur 1):<ol>
<li>Kriterium 1: se till att alla EKG-vågformer (P, QRS och T) är distinkta och lätt synliga.</li>
		<li>Kriterium 2: se till att P-vågen är positiv.</li>
		<li>Kriterium 3: se till att net QRS-komplexet är positivt (dvs. R-vågamplituden är större än summan av Q-och S-vågamplituder).</li>
		<li>Kriterium 4: se till att T-vågen är positiv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om ett normalt EKG förväntas, flytta elektroderna (prova den negativa elektroden först) om det behövs, tills alla fyra validerar kriterierna är uppfyllda.</li>
	<li>Om en normal T-våg förväntas, men T-vågen är för liten, ompositionera elektroderna för att maximera T-vågamplituden.</li>
	<li>Återuppta EKG-inspelningen efter optimering av leadpositionering. Spara EKG-svep för efterföljande analys.</li>
</ol>5. återhämtning från anestesi
<ol><li>I slutet av EKG-inspelningssessionen, ta försiktigt bort elektroderna utan att skada fisken. Överför fisken till färskt, syrat fisk vattenfritt från trikain.</li>
	<li>För att underlätta återhämtning från anestesi, spruta vatten över gälarna kraftigt med en Pasteur pipett tills fisken återupptar regelbunden Gill rörelse eller simning.</li>
	<li>Övervaka fisken för full återhämtning från anestesi (typiskt 1-2 min), vilket indikeras av fisk förmåga att simma upprätt i minst 5 s.</li>
</ol>6. EKG-tolkning
<ol><li>Definiera analys inställningarna.<ol>
<li>Känn till programvarans gränssnitt (tabell över material) genom att läsa bruksanvisningen för dataanalysprogrammet för EKG. Obs: även om anvisningarna nedan är specifika för kommersiell programvara som används i vårt laboratorium, de grundläggande uppgifterna att utföra är i huvudsak desamma i alla programpaket för EKG-analys.</li>
		<li>Öppna dataanalysprogrammet för EKG. Välj Öppna på Arkiv -menyn för att öppna EKG-filen av intresse och Visa hela EKG-spårningen. Använd musen för att dra ut ett avsnitt av intresse i EKG-spårningen för att analysera.</li>
		<li>På menyn EKG-analys väljer du EKG-inställningar för att öppna en dialogruta för att fördefiniera olika parameterinställningar för automatisk analys av programvara (figur 5a).</li>
	</ol></li>
	<li>Analysera hjärtrytmen och hastigheten. Obs: hjärtfrekvens beror på flera faktorer, inklusive zebrafiskar ålder och stam, anestesimedel (t. ex., trikain, isofluran, etc.) och koncentration, anestesi användning (Single agent5,7 vs. kombinerade agenter5) och exponeringstid5. Till exempel, i denna studie hjärtfrekvensen av 12-18 månad gammal vildtyp AB zebrafiskar efter 3-5 min av nedsänkning i 0,02-0,04% tricaine lösning var 116 ± 17 slag per minut (n = 9), i enlighet med litteraturen rapporter om hjärtfrekvens för denna åldersgrupp och anestesimedel5,7.<ol>
<li>Avgöra om hjärtrytmen är sinus eller inte, regelbunden eller oregelbunden. Obs: närvaron (eller frånvaron) av sinusrytm baseras på närvaron (eller frånvaron) av en upprätt P-våg före varje QRS med ett normalt PR-intervall (t. ex. 60-65 MS för LiU et al. ' s 10-12 månad gamla7 och 12-18 månad gamla vildtyp AB zebrafiskar i denna studie). Den förmaksflimmer och ventrikulär rytm regelbundenhet (eller oegentligheter) är baserad på regelbundenhet (eller oegentligheter) av successiva PP eller RR intervall, respektive.</li>
		<li>För att bestämma pulsen, se till att programvaran korrekt identifierar alla P-och R-vågor. Baserat på dessa automatiska identifieringar (eller manuella korrigeringar) av P-och R-vågor, mäter programvaran automatiskt alla PP och RR intervall i EKG-urvalet, beräknar intervallet medelvärden för att generera den förmaksflimmer och ventrikulär hastighet. Obs: den förmaksflimmer är den genomsnittliga PP intervall medan ventrikulär hastighet är den genomsnittliga RR intervallet. För att bestämma hjärtfrekvensen, är korrekt identifiering av P-och R-vågor kritisk.</li>
		<li>Korrigera eventuella fel vid automatisk identifiering genom att flytta de felplacerade markörerna till lämpliga P-och R-vågor (Figur 5b). Obs: om hjärtat är i sinus rytm, den förmaksflimmer hastighet och ventrikulär hastighet är desamma på grund av en-till-en korrespondens mellan sinus P vågor och QRS komplex. Emellertid, i fallet med atrioventrikulär dissociation (t. ex., i ventrikulär takykardi eller tredje gradens atrioventrikulärt block), denna en-till-en korrespondens mellan P vågor och QRS komplex förloras; Därför, det finns två hjärtfrekvens eftersom förmaksvärdet skiljer sig från ventrikulär hastighet.</li>
		<li>Bestäm pulsen baserat på minst fem på varandra följande kompletta hjärtcykler om hjärtrytmen är regelbunden, eller en remsa på minst sex sekunder om hjärtrytmen är oregelbunden.</li>
	</ol></li>
	<li>Beräkna intervall och vågvaraktigheter.<ol>
<li>Gå till EKG-analys &Gt; medelvärdes visning för att sammanfoga n (t. ex. 5) sammanhängande hjärtcykler till en enda genomsnittlig signal (figur 5c). Anmärkning: om EKG-vågformer av en individuell hjärt cykel avviker avsevärt från den genomsnittliga signalen, studera att hjärt cykeln separat utan sammanfogning.</li>
		<li>Se till att programvaran korrekt identifierar början och slutet av P-vågen, QRS-komplexet och T-vågen som visas i fönstret för medelvärdes visning (figur 5c). Baserat på dessa automatiska identifieringar (eller manuella korrigeringar) av dessa vågor och intervaller, mäter programvaran automatiskt de varaktigheter som definieras konventionellt. Obs: PR-intervallet sträcker sig från början av P-vågen till början av QRS-komplexet (eller RS-komplexet om Q-vågen inte syns). QRS-varaktigheten sträcker sig från början av Q-vågen (eller R-vågen om Q-vågen inte är synlig) till slutet av S-vågen (dvs. J-punkten; Figur 1). QT-intervallet sträcker sig från början av Q-vågen (eller R-vågen om Q-vågen inte syns) i slutet av T-vågen. Därför, för att beräkna intervall och varaktigheter, är korrekt identifiering av början och slutet av P-vågen, QRS-komplexet och R-vågen kritisk.</li>
		<li>Korrigera eventuella fel vid automatisk identifiering genom att flytta de felplacerade markörerna till lämpliga positioner.</li>
		<li>Välj den negativa toppen av s-vågen som slutet av QRS-komplexet7 eftersom zebrafiskar J punkt som signalerar slutet av s-vågen kan vara särskilt svårt att identifiera exakt. Detta kommer att orsaka en liten underskattning av den sanna QRS varaktighet. Anmärkning: programmet för EKG-analys korrigerar automatiskt QT-intervallet till ventrikulär hastighet (eller RR-intervall) för att generera det korrigerade QT-intervallet QTc med den metod som valts i förväg av användaren i steg 6.1.3, till exempel Bazett (figur 5a). Den Bazett formel (1920) QTc = qt/√ RR är den mest populära och den första av flera metoder som föreslås för att korrigera det humana QT-intervallet för hjärtfrekvens. Eftersom noggrannheten i Bazetts formel har ifrågasatts, hänvisa till andra metoder som föreslagits för människor10,11 och zebrafiskar6 (figur 5D).</li>
	</ol></li>
	<li>Tolka EKG-avvikelser genom att erkänna undantag för de fyra validerar kriterierna i steg 4,3.<ol>
<li>Identifiera undantag för kriterium 1. I avsaknad av några P-vågor (som indikerar frånvaron av sinus rytm), förlita sig på RR intervall och QRS varaktighet för att diagnostisera hjärtrytmen. Till exempel, om RR intervallen är oregelbundet oregelbunden, diagnostisera förmaksflimmer; om RR intervallen är regelbundna och QRS är normalt smala, diagnostisera av Escape rytm; å andra sidan, om RR intervallen är regelbundna och QRS är onormalt långvarig, diagnostisera ventrikulär flykt rytm.</li>
		<li>Identifiera undantag för kriterium 2. När P-vågen är negativ (eller inverterad), diagnostisera retrograd förmaksflimmer aktivering från en ektopisk pacemaker (såsom en förmaksflimmer plats nedströms sinus noden, den atrioventrikulärt nod, eller ventrikeln).</li>
		<li>Identifiera undantag för kriterium 3. När höga och smala Q vågor närvarande med negativa P och negativa T vågor, diagnostisera bly återföring på grund av en felaktig switch av de positiva och negativa elektroderna positioner eftersom de höga och smala Q vågor var sanna R vågor av misstag inverterad (figur 6D ). I motsats, när breda Q vågor närvarande med positiva P vågor efter betydande hjärtskada, diagnostisera hjärtinfarkt eftersom dessa breda Q vågor är sanna patologiska Q vågor.</li>
		<li>Identifiera undantag för kriterium 4. När T-vågen är inverterad, inspektera ventrikulär aktivering för att identifiera om ventrikulär repolarisering avvikelse är primär eller sekundär. Förlita sig på det kliniska scenariot för att begränsa den korrekta diagnosen från en differentiell lista över primär ventrikulär repolarisering avvikelse (från läkemedels effekter eller myokardischemi; Figur 6C) vs. sekundär ventrikulär repolarisering avvikelse (på grund av avvikande ventrikulär aktivering från pre-excitation, ventrikulär ektopy, eller ventrikulär pacing).</li>
	</ol></li>
	<li>Exportera EKG-fynd.<ol>
<li>Välj tabellvy för att granska alla EKG-mätningar. Välj de mätningar av intresse att kopiera och klistra in i önskat dokument (t. ex. Excel-kalkylblad).</li>
		<li>Om du vill exportera ett EKG-spår markerar du ett avsnitt av intresse i EKG-svepet med förstoringsglaset. Kopiera och klistra in i önskat dokument (t. ex. Word eller PowerPoint).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome.">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li><li>Hassel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+zebrafish+ether-a-go-go-related+gene+channel+gating+causes+short-QT+syndrome+in+zebrafish+reggae+mutants.">Deficient zebrafish ether-a-go-go-related gene channel gating causes short-QT syndrome in zebrafish reggae mutants.</a> Circulation. 117 (7), 866-875 (2008).</li><li>Meder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+defective+protein+trafficking+rescues+Long-QT+syndrome+in+zebrafish.">Reconstitution of defective protein trafficking rescues Long-QT syndrome in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 408 (2), 218-224 (2011).</li><li>Sieber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+preclinical+in+vivo+screening+model+for+nanomedicines.">Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , (2019).</li><li>Lin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+and+economic+in+vivo+electrocardiogram+platform+for+cardiovascular+drug+assay+and+electrophysiology+research+in+adult+zebrafish.">Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish.</a> Science Reports. 8 (1), 15986 (2018).</li><li>Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+of+adult+zebrafish+electrocardiogram+and+assessment+of+drug-induced+QT+prolongation.">In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 291 (1), H269-H273 (2006).</li><li>Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+surface+ECG+recording+in+adult+zebrafish+reveals+that+the+value+of+this+model+exceeds+our+expectation.">Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation.</a> Science Reports. 6, 25073 (2016).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Ilar Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Sagie, A., Larson, M. G., Goldberg, R. J., Bengtson, J. R., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+adjusting+the+QT+interval+for+heart+rate+(the+Framingham+Heart+Study).">An improved method for adjusting the QT interval for heart rate (the Framingham Heart Study).</a> American Journal of Cardiology. 70 (7), 797-801 (1992).</li><li>Luo, S., Michler, K., Johnston, P., Macfarlane, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commonly+used+QT+correction+formulae:+the+effect+of+heart+rate+on+the+QTc+of+normal+ECGs.">A comparison of commonly used QT correction formulae: the effect of heart rate on the QTc of normal ECGs.</a> Journal of Electrocardiology. 37 Suppl, 81-90 (2004).</li><li>Vornanen, M., Hassinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+heart+as+a+model+for+human+cardiac+electrophysiology.">Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology.</a> Channels (Austin). 10 (2), 101-110 (2016).</li><li>Tsai, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+recording+of+adult+zebrafish+heart+electrocardiogram+-+a+platform+for+pharmacological+testing).">In-vitro recording of adult zebrafish heart electrocardiogram - a platform for pharmacological testing).</a> Clinica Chimica Acta. 412 (21-22), 1963-1967 (2011).</li><li>Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+5+anesthetics+in+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio).</a> Journal of American Association of Lab Animal Sciences. 53 (2), 198-203 (2014).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Nkx2.5-Calr-p53+signaling+pathway+by+hyperglycemia+induces+cardiac+remodeling+and+dysfunction+in+adult+zebrafish.">Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish.</a> Disease Model and Mechanism. 10 (10), 1217-1227 (2017).</li><li>Franz, M. R., Bargheer, K., Rafflenbeul, W., Haverich, A., Lichtlen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monophasic+action+potential+mapping+in+human+subjects+with+normal+electrocardiograms:+direct+evidence+for+the+genesis+of+the+T+wave.">Monophasic action potential mapping in human subjects with normal electrocardiograms: direct evidence for the genesis of the T wave.</a> Circulation. 75 (2), 379-386 (1987).</li><li>Chiale, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+electrocardiographic+manifestations+of+ventricular+repolarization+memory.">The multiple electrocardiographic manifestations of ventricular repolarization memory.</a> Current Cardiology Reviews. 10 (3), 190-201 (2014).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+multifunctional+integumentary+membranes+for+spatiotemporal+cardiac+measurements+and+stimulation+across+the+entire+epicardium.">3D multifunctional integumentary membranes for spatiotemporal cardiac measurements and stimulation across the entire epicardium.</a> Nature Communications. 5, 3329 (2014).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Vid inspelning in vivo-EKG för vuxna zebrafiskar med hjälp av en enda ledning som vi visade i denna studie, det finns ett antal varningar om kvaliteten och giltigheten av EKG-Inspelningsresultat. Först, i valet av lämpliga anestetika och bestämma den minimala behov anestesi koncentration, djup, och varaktighet, balansera bedövningsmedel kardiotoxiciteter mot det kritiska behovet av att undertrycka rörelse artefakter och a priori beslutsamhet för en överlevnad kontra Terminal experimentell design. Kapitalisera på den synergistiska potensen av en kombination av flera anestetika från olika läkemedelsklasser5,14 och paralytika1,6 för att sänka dosen av enskilda agenter5 eller administrera en låg underhållsdos efter en högre induktionsdos är typiska strategier. Men trots dess välkända potentiella kardiorespiratoriska toxicitet, inklusive död8, tricaine är fortfarande den mest använda, den bästa tillgängliga, och den enda bedövningsmedel som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) för zebrafisk Anestesi. Tricaine har populärt används i EKG-inspelning av vuxna zebrafiskar antingen som en enda agent eller i kombination med andra anestetika eller paralytika.
För det andra, bly placering noggrannhet kan säkerställas åtminstone för friska normal zebrafiskar med våra fyra validerar kriterier för en normal vuxen zebrafiskar EKG. Av de fyra validerar kriterier som vi föreslår här, de två sista kriterierna tillsammans bekräfta den grundläggande överensstämmelse mellan polariteten av R-vågen och att T-vågen i ett normalt EKG5,7,15. Denna R och T våg konkordans är en slumpartad, men ändå kritisk, likhet mellan zebrafisk och humant16,17 normalt EKG som bidrar till den kliniska relevansen av zebrafiskar hjärt modell som ett surrogat för mänskliga hjärt Elektrofysiologi. Flera godartade eller maligna tillstånd kan dock ogiltigförklara något av de fyra valideringskriterierna. Till exempel, R och T våg konkordans är förlorad i myokardischemi7,15. Denna förlust av R och T våg konkordans i myokardischemi är en annan slående likhet mellan zebrafiskar och humant EKG som bidrar till den kliniska relevansen av zebrafiskar hjärtinfarkt modell.
Slutligen rekommenderar vi en standard praxis i EKG-analys. Med tillkomsten av teknik, kan EKG-analysprogram generera automatisk EKG-tolkning. Vi rekommenderar dock starkt att utbildade människor alltid omtolkar och verifierar alla EKG baserat på respektive kliniskt scenario som leder till EKG-inspelning. Rutinmässig övertillit enbart på automatisk tolkning av ett EKG analysprogram är olämpligt, särskilt i närvaro av vanliga normala EKG-varianter, hjärtsjukdomar, eller suboptimala bly placering.
Denna studie fokuserar på den minimalt invasiva metoden för korta EKG-inspelningssessioner. Men om behovet uppstår för Terminal långvarig EKG-inspelning sessioner varar timmar, ändringar är nödvändiga för att ge adekvat syresättning, hydrering, och anestesi genom kontinuerlig perfusion6.
Dessutom, förbättra signal-brus-förhållandet med en av minst tre sätt. Välja en mer kraftfull förstärkare är ofta en kostsam, om inte opraktiskt, alternativ. Öppna perikardiell SAC att minska volymen ledaren är en rimlig, även invasiva, tillvägagångssätt som har antagits7. Strategisk bly placering för att rikta in bly axeln i en riktning parallellt med den huvudsakliga hjärt axeln (figur 4b) maximerar EKG-spänningssignalerna, men kan kräva försök och fel, särskilt i avsaknad av perikardiotomi.
Den in vivo EKG förhörs metoden för Adult zebrafiskar som vi presenterade här erbjuder fyra huvudsakliga fördelar. För det första, vår minimalt invasiva tillvägagångssätt kräver endast elektrod insättning, men ingen fisk skala avlägsnande eller torakotomi-pericardiotomy. Därför, genom att minimera smärta för fisken, vår metod möjliggör upprepade EKG förhör i longitudinella överlevnads studier. För det andra, när bedövningsmedel tillräckligt undertrycka fisk rörelse, in vivo EKG-inspelningssystem i vår studie ger konsekvent en tillfredsställande signal-brus-förhållande med brus fria RAW-signaler. För det tredje garanterar den kvalitets validering med fyra kriterier som vi föreslår här data noggrannhet och robusthet tidigt i EKG-datainhämtningen och minimerar operatörsberoende variationer. Slutligen, i synnerhet, vårt sista validerar kriterium (den normala T-vågen är upprätt) kapslar in konkordans av R-vågen och T-vågen, en viktig människa-liknande egenskap hos zebrafiskar normalt EKG (figur 1).
Emellertid, det finns fortfarande fyra stora begränsningar till aktuell in vivo EKG-metod för vuxna zebrafiskar av vår grupp och andra.
För det första kräver bristen på ämnes samarbete behovet av anestesi med dess begränsande kardiorespiratoriska toxicitet konsekvenser. För in vivo EKG-förhör, medan mänskliga patienter aldrig behöver sedering, zebrafiskar kräver alltid bedövningsmedel eller paralytika, som alla orsakar variabla kardiorespiratoriska toxiciteter.
För det andra, behovet av att säkra bifogade EKG leder något höjer invasivitet av en annars icke-invasiva förfarande. Bly placering i kroppsyta EKG-inspelning av människor är helt icke-invasiv eftersom elektroder följa den mänskliga epidermis, bly placering för in vivo-EKG-inspelning av zebrafiskar är mer invasiv eftersom stål elektroder åtminstone måste punktera fisken huden för säker insättning i fisken muskulatur.
De två sista begränsningarna härrör från den anatomiska begränsningar av zebrafiskar bröstet och hjärtat. För det tredje, den minimala storleken på den vuxna zebrafiskar hjärtat kräver en drastisk minskning av antalet EKG leder. Medan människor lätt rymma tolv leder i en vanlig EKG-inspelning, Adult zebrafiskar kan normalt rymma endast en enda unipolär eller bipolär bly. Förgreningen av ett enda EKG-bly är utmaningen att optimera samtidigt amplituderna av alla tre P, R, och T vågor. Därför, vikten av optimal och noggrann bly placering i zebrafiskar EKG förhör kan inte överskattas. I Zebrafish presenterar T-vågen en unik detektions utmaning eftersom den ofta är den minsta av dessa tre vågor. Därför bör zebrafiskar T vågamplitud få optimerings prioritet över de typiskt större P-och R-vågor.
För det fjärde, bestämning av zebrafiskar huvudsakliga hjärt axeln för att maximera R-vågamplituden kan vara utmanande. Anledningen är att zebrafiskar Heart har mer rörelsefrihet inom sin lösa perikardiell SAC jämfört med det mänskliga hjärtat inom dess form-passande handske-liknande hjärtsäcken.
Sammantaget kommer dessa begränsningar att stimulera framtida metod innovation. Med tillkomsten av 3D-utskrifter och deformerbar elektronik18, det finns hopp om direkt bly implantation en dag i vaken, Alert, simning zebrafiskar med hjälp av en "hjärt strumpa" av trådlösa elektrod sensorer.

Den zebrafiskar (Danio rerio) hjärtat ligger anteroventrally till brösthålan mellan operculum och bröst girdles. Hjärtat är bifogat ganska löst inom en silverfärgad perikardiell SAC. Anatomiskt, den zebrafiskar hjärta skiljer sig från de fyra-chambered mänskliga och andra däggdjur hjärtan på grund av dess diminutiv skala (100-faldigt mindre än det mänskliga hjärtat) och dess två-chambered struktur bestående av endast en Atrium och en ventrikel. Icke desto mindre är elektrokardiogram (EKG) vågformer och varaktigheten av QT-intervallet för båda arterna anmärkningsvärt likartade (figur 1). Följaktligen har zebrafiskar vuxit fram som en populär modell för att studera mänskliga ärftliga arytmier1,2,3 och för hög genomflöde av läkemedels screening av potentiella humana kardiotoxiciteter4,5 , såsom QT-förlängning.
I den rutinmässiga utvärderingen av mänskliga hjärtsjukdomar, kroppen-ytan EKG har blivit den mest omfattande första linjens icke-invasiva diagnostiska verktyg sedan dess uppfinning av Einthoven i 1903. I motsats, sedan den första anpassningen av kroppsytan EKG inspelnings metod för vuxna zebrafiskar i 20066 och flera ändringar därefter7, denna teknik har varit i stort sett otillgängliga för många forskare inom området trots populariteten av denna djurmodell. För andra forskare som utförde in vivo EKG förhör för vuxna Zebrafish, stora variationer bland operatörerna ledde till inkonsekvens i EKG-fynd från olika studier. Vanliga orsaker är besvärliga och dyra specialiserade enheter och programvara, låg signal-brus-förhållande, och förvirring om elektrod placeringen, alla ytterligare förvärras av en ofullständig förståelse av den vuxna zebrafiskar EKG-funktioner och underliggande vävnadsmekanismerna. Med tanke på att in vivo EKG är det enda diagnostiska verktyg för elektriskt fenotyp levande zebrafisk, det finns ett tydligt behov av en standardiserad metod för att förbättra känslighet och specificitet, reproducerbarhet och tillgänglighet.
Här presenterar vi en praktisk, tillförlitlig och validerad metod för att registrera och tolka zebrafiskar in vivo elektrokardiogram (figur 2). Med hjälp av en enda bipolär bly i frontal planet, undersökte vi förändringar i EKG-vågformer och intervall varaktigheter av levande sövda friska vild-typ AB Adult Zebrafish.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB087571</td>
			<td>100 mm x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td>0.1 x 0.06 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE136 Animal Bio Amp&#160;</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>FE231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>11064-07</td>
			<td>0.6 x 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart 8 Pro</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Software with ECG Module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle electrodes for Animal Bio Amp&#160;</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLA1213</td>
			<td>29 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td>6 in., 1.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 4/35</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>4//35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Sciense Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>2.5 mm, 0.075 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>MS-222</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo surface electrocardiography for adult zebrafish

Den elektrokardiogram vågformer av Adult zebrafiskar och de av människor är anmärkningsvärt likartade. Dessa elektrokardiogram likheter öka värdet av zebrafiskar inte bara som en forskningsmodell för mänsklig kardiell elektrofysiologi och myopatier utan också som en surrogat modell i hög genomströmning farmaceutisk screening för potentiella kardiotoxicities till människor, såsom QT-förlängning. Som sådan är in vivo elektrokardiografi för vuxna zebrafiskar ett elektriskt fenotypnings verktyg som är nödvändigt, om inte nödvändigt, för tvärsnitts eller longitudinell in vivo elektrofysiologiska karakteriseringar. Bristen på tillförlitlig, praktisk och kostnadseffektiv inspelnings metod är dock alltför ofta en stor utmaning som hindrar detta in vivo-diagnostikverktyg från att bli mer lättillgängligt. Här beskriver vi en praktisk, enkel metod för in vivo elektrokardiografi för vuxna zebrafiskar med ett lågt underhåll, kostnadseffektivt och heltäckande system som ger konsekventa, pålitliga inspelningar. Vi illustrerar vårt protokoll med friska vuxna manliga zebrafiskar på 12-18 månaders ålder. Vi introducerar också en snabb realtids tolkning strategi för kvalitets validering för att säkerställa data noggrannhet och robusthet tidigt i elektrokardiogram inspelningsprocessen.

Figur 1 illustrerar den kliniska relevansen av den metod som presenteras här. In vivo ytelektrokardiografi för vuxna zebrafiskar är ett viktigt elektriskt fenotypning verktyg på grund av de anmärkningsvärda likheter mellan zebrafiskar och humant EKG trots deras stora anatomiska skillnader. Den zebrafiskar hjärtat har bara en Atrium och en kammare i motsats till det mänskliga hjärtat med två Atria och två ventriklar (översta raden, höger och vänster, respektive). Men trots sin skenbara anatomiska enkelhet, zebrafiskar Heart aktier flera EKG-funktioner med det mänskliga hjärtat (nedersta raden; höger och vänster, respektive) Därför har zebrafiskar Heart vuxit fram som en surrogat modell för Human hjärt elektrofysiologi5,12,13. Figur 1 illustrerar en liten men distinkt Q-våg från en levande, hälsosam 14 månader gammal zebrafisk. Men i zebrafiskar EKG, bly positionering är inte vanligtvis optimerad för att demonstrera Q vågen. Därför är Q Wave vanligtvis osynlig, och en RS-komplex är vanligare sett än hela QRS-komplexet i zebrafiskar EKG.
Figur 2 sammanfattar de fyra viktiga åtgärdsstegen för att genomföra minimalt invasiv in vivo-elektrokardiografi för vuxna zebrafiskar. Efter anestesi induktion (steg 1) och elektrodplacering (steg 2), registrerade vi baslinje EKG-signaler (steg 3) från friska vildtyp AB zebrafiskar på 12 till 18 månaders ålder (n = 9). Vår elektrod insättnings teknik var bara minimalt invasiva eftersom vi inte behövde skala fisk skalor eller utföra pericardiotomy. Efter datainsamling granskade och kontrollerade vi manuellt varje EKG-inspelning (steg 4) för att undvika eventuella feltolkningar av programvara automatisk analys.
Figur 3 visar de tre oumbärliga komponenterna i ett typiskt datainsamlings-och behandlingssystem för EKG: en högpresterande maskinvara för datainsamling, en differential förstärkare med hög förstärkning och en dator som laddats upp med programvara för EKG-data förvärv och analys. I vårt laboratorium anpassade vi ett befintligt kommersiellt in vivo-EKG-inspelningssystem som ursprungligen utformades för små däggdjurs modeller (såsom möss, råttor och kaniner) för att rymma den adulta zebrafiskar-modellen.
Figur 4 visar att korrekt bly placering kräver att ledningen är justerad med den förmodade hjärt huvudaxeln. I zebrafiskar in vivo -EKG-inspelning, eftersom endast en enda bly används, korrekt bly positionering för att maximera samtidigt både R och T våg amplituder är kritisk. För att maximera R och T våg amplituder, justerade vi de positiva och negativa bly elektroder med hjärtats huvudaxel, förmodligen i vänster caudal till höger kranial orientering. Efter thorakotomi och perikardiotomi för att öppna perikardiell SAC och exponera hjärtat, blir hjärtats huvudaxel uppenbar (figur 4b vit streckad linje). I själva verket, pericardiotomy att exponera hjärtat är en vanligt förekommande strategi för att öka signal-brus-förhållande7 på bekostnad av att omvandla EKG-inspelningen från en minimalinvasiv till en mycket invasiv förfarande.
Figur 5 illustrerar kritiska steg i EKG-analysen. Först fördefinierat vi de olika parameterinställningarna för programvara automatisk analys med hjälp av dialogrutan för EKG-inställningar (figur 5a). Eftersom vi återför en befintlig EKG-inspelningsutrustning avsedd för däggdjurs modeller för att rymma vuxna zebrafiskar är detekterings-och analys inställningen för zebrafisk inte tillgänglig. Vi valde den mänskliga förinställda istället, med tanke på den anmärkningsvärda likheten av zebrafiskar EKG till humant EKG (figur 5a). För det andra, vi kontrollerade manuellt programvaran automatisk EKG-identifiering (i svart) av R Wave toppar och korrekt (i rött) alla R Wave Auto-identifiering misstag innan befallande programvaran för att räkna om den genomsnittliga ventrikulär hastighet. Till exempel, i Figur 5b, en stor P-våg i förhållande till r-vågen luras programvaran till att felidentifiera r-vågorna, vilket leder till efterföljande automatisk felberäkning av RR-intervallet eller ventrikulär hastighet. Därför är mänsklig verifiering och lämpliga korrigeringar som behövs kritiska i EKG-analys. För det tredje bedömde vi snabbt rytm regelbundenhet och beräknade den genomsnittliga varaktigheten av vågor och intervaller med medelvärdes visning (figur 5c) för att sammanfoga flera på varandra följande hjärt cykler (grön) till en enda genomsnittlig signal (svart). Här i figur 5c, den försumbara avvikelsen mellan var och en av de nio hjärtcykler och den genomsnittliga signalen argumenterar för utmärkt rytm regelbundenhet av detta zebrafiskar hjärta. Slutligen gjorde vi det möjligt för programvaran att automatiskt korrigera QT-intervallet för hjärtfrekvens med Bazett, en av de sju olika metoder som finns (figur 5D).
Figur 6a -C visar hur djupet av elektrod placeringen påverkar AMPLITUDERNA av EKG-signalerna. När vi felaktigt satt in elektroderna alltför ytligt i dermis (figur 6a), var bly "indirekta"-liknande (mer än två hjärt diameter från hjärtat, liknande den indirekta standarden mänskliga EKG leder i, II, och III) och spänningen signalerna var små. När vi på lämpligt sätt in elektroderna 1 mm djupare in i pectoralis muskulatur (figur 6b), blev bly "semidirect" (i nära närhet men inte i direkt kontakt med hjärtat) och spännings signalerna ökade. EKG-vågformerna blev lätt synlig. Men när vi felaktigt in elektroderna ännu djupare in i ventrikeln (figur 6C), blev ledningen "direkt" (i direkt kontakt med hjärtat) och spännings signalerna ökade ytterligare. R-vågamplituden i figur 6C ökade med åtta gånger jämfört med figur 6a och fyrfaldigt jämfört med figur 6b. Emellertid, EKG-spår i figur 6C avslöjade nya tecken på skada på ventrikulära hjärtmuskeln, såsom nya St depression och nya T-vågen inversion.
Figur 6D visar hur de ovanliga Inversionerna av alla EKG-vågformer (P, Q, R, S och T) ska signalera en bly återföring misstag, där de positiva och negativa elektroderna bytte plats. Observera att Q och S alltid är negativa, medan R alltid är positivt.
Figur 6E -F visar hur olämpligt anestesidjup kan försämra kvaliteten på in vivo -EKG-inspelningen. I figur 6e, otillräcklig anestesi (0,017% tricaine) ledde till misslyckande att immobilisera zebrafiskar helt. De resulterande rörelse artefakterna sänkte signal-brus-förhållandet genom att både kontaminera signalen (asterisk) och öka bullret (pilar). I kontrast, i figur 6F, överdoserad anestesi (0,08% tricaine) inducerade svår sinus bradyarytmi samt förändringar av St-segmentet och T-vågen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig1.jpg"> Figur 1: kontrasterande anatomi och EKG för mänskliga och zebrafiskar hjärtan. I motsats till det mänskliga hjärtat med två Atria och två ventriklar, har zebrafiskar hjärtat bara en Atrium och en ventrikel (översta raden). Förkortningar: RA, höger förmak; LA, vänster förmak; RV, höger kammare; LV: vänster kammare. Den zebrafiskar Heart aktier flera gemensamma EKG-funktioner med det mänskliga hjärtat (nedersta raden). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig2.jpg"> Figur 2: minimalt invasivt in vivo-protokoll för EKG-inspelning. Ett schematiskt flödesschema illustrerar fyra kritiska åtgärder steg för att genomföra en in vivo EKG förhör: inducera anestesi, placera EKG bly elektroder, registrera EKG, och analysera EKG-inspelningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig3.jpg"> Figur 3: Datainsamlings-och behandlingssystem för EKG. De tre viktigaste komponenterna i ett integrerat in vivo-EKG-inspelningssystem inkluderar en maskinvara för att hämta data, en förstärkare och datorprogramvara för datainsamling och analys. Förstärkaren levereras med tre färdiga att använda 29-gauge rostfrittstål mikroelektroder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig4.jpg"> Figur 4: EKG-ledplaceringen. 3 29-gauge färgkodade rostfria elektroder sätts in säkert i fisken muskulaturen till ca 1 mm på djupet. Placeringen av den negativa (svarta) elektroden och den positiva (röda) elektroden upprättar en bipolär ledning i det främre planet, längs en vänster caudal till höger kranial orientering. Förkortning: ref, referenselektrod <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig5.jpg"> Figur 5: C steg i EKG-analys. (A) fördefiniera de olika parameterinställningarna för automatisk analys av programvara. (B) manuellt korrigera (röd) två automatiska felidentifiering av programvaran (svart) av P-och R-vågor för att korrigera programvara felaktig beräkning av förmaks-och ventrikulär hastighet. (C) sammanfoga nio på varandra följande hjärt cykler (grön) till en enda genomsnittlig signal (svart) för att snabbt bedöma rytm regulariteter/oegentligheter och beräkna genomsnittliga varaktigheten av vågor och intervaller. (D) korrigera QT-intervallet för hjärtfrekvens med hjälp av en av de olika metoderna, såsom Bazett. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60011/60011fig6.jpg"> Figur 6: effekter av bly placering och anestesidjup på EKG-signaler. Två mest kritiska steg som avgör framgången för in vivo-EKG-inspelning är bly placering (A-D) och anestesidjup (E-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60011/60011fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Surface Electrocardiography for Adult Zebrafish

Här presenterar vi en tillförlitlig, minimalt invasiv och kostnadseffektiv metod för att registrera och tolka elektrokardiogram i levande sövda vuxna zebrafiskar.

In vivo Ytelektrokardiografi för vuxna Zebrafish

The electrocardiogram waveforms of adult zebrafish and those of humans are remarkably similar. These electrocardiogram similarities enhance the value of ...

In vivo elektrisk kardiografi är det enda diagnostiska verktyget för elektrisk fenotypning i levande zebrafisk i tvärsnitts- och longitudinella studier. Vårt tillvägagångssätt är praktiskt, minimalt invasivt och kostnadseffektivt eftersom vi använder ett datainsamlingssystem för däggdjur. Vi betonar strategin för realtids-EKG-tolkning för tidig validering av datakvalitet.Eftersom mänskliga och zebrafisk EKG är liknande, in vivo elektrokardiografi underlättar användningen av zebrafisk i modellering mänskliga hjärt fysiologi samt hög genomströmning drog screening för kardiotoxicities, såsom QT förlängning. Korrekt leadpositionering är nyckeln till framgång. Eftersom den normala zebrafisken T-vågen är den minsta, prioritera optimera sin amplitud över de större P och R vågor.Studera normala och patologiska EKG-mönster för att tolka dina EKG-fynd själva. Förlita dig inte enbart på automatisk tolkning av EKG-analysprogramvara. På dagen för experimentet, transportera zebrafisken från akvariet till laboratoriet.För att ställa in in vivo EKG-inspelningssystemet, anslut de väsentliga delar av utrustning och sätt in de tre färgkodade, rostfria elektroderna i EKG-ledningen i de tre färgmatchade åtkomstportalerna i förstärkaren. För induktion av anestesi på nivå 4, sänk ner en vuxen zebrafisk i en rätt som innehåller en lösning av anestetika vid de lägsta förutbestämda koncentrationerna som godkänts av kommittén för vård och användning av institutionella djur. När zebrafisken har bibehållit anestesi nivå 4 i tre sekunder, använd ett par trubbiga tång för att omedelbart överföra fisken till en fuktig svamp med en slits, ventral yta upp, för placering av de tre EKG-elektroderna.Sätt försiktigt in den positiva elektroden i den ventrala mittlinjen i höjd med bulbus arteriosus en till två millimeter över en tänkt linje som förbinder de två nedre kanterna av operculums. Placera den negativa elektroden caudally och 0,5 till en millimeter vänster i laterled till den positiva elektroden på ett avstånd större än den maximala apicobasal längd av den vuxna zebrafisk ventrikel, sedan placera referenselektroden caudally nära analregionen. För EKG-registrering, starta systemet och öppna programmet för ekg-dataanskaffning.Välj en önskad inställning från rullgardinsmenyerna för räckvidd, lågpass och högpass. Tryck på Start för att initiera kontinuerlig gapfri EKG-inspelning med en samplingsfrekvens på en kilohertz. För att optimera leadpositionering för maximal signal-brus-förhållande trycker du på Stopp för att stoppa inspelningen och granska spårningen snart efter det allra första inspelningsförsöket för varje hjärta.Om EKG förväntas vara normalt, bekräfta att alla EKG vågformer är distinkta och lätt synliga och att P-vågen, netto QRS-komplex, och T våg är alla positiva. Det enskilt mest kritiska steget är blypositionering för att maximera signal-brusförhållandet. Tillämpa våra fyra validerande kriterier efter det allra första EKG-inspelningsförsöket för varje fisk att få korrigerande feedback.Om ett normalt EKG förväntas, placera om elektroderna efter behov tills alla dessa fyra valideringskriterier är uppfyllda. Om en normal T våg förväntas, men T-vågen är för liten, flytta om elektroderna för att maximera T våg amplituden. Återuppta EKG-registreringen efter att ha optimerat leadpositioneringen, spara EKG-svepen för efterföljande analys.I slutet av EKG-inspelningssessionen, ta försiktigt bort elektroderna utan att fisken skadas. I överlevnadsstudier överför du fisken till färskt, syresatt fiskvatten fritt från trikain. Observera att i denna video, för att underlätta readers'visning av fisken återhämtning från anestesi, syresättning avbryts.För att underlätta återhämtning från anestesin i överlevnadsstudier, använd en Pasteurpipett för att kraftigt spruta vatten över gälarna tills fisken återupptar regelbunden gälrörelse eller simning, sedan övervaka fisken för full återhämtning från anestesi innan du återvänder fisken till akvariet. Fisken anses helt återhämtat sig från anestesi när den kan simma upprätt i minst fem sekunder. Om du vill definiera analysinställningarna öppnar du programmet för EKG-dataanalys och öppnar EKG-filen av intresse för att visa den fullständiga EKG-spårningen.Använd musen för att dra ut ett avsnitt av intresse i EKG-spårningen för att analysera. Välj EKG-inställningar på EKG-menyn för att öppna en dialogruta för att fördefiniera olika parameterinställningar för automatisk analys av programvara. Analysera hjärtrytmen och pulsen och avgöra om hjärtrytmen är sinus eller inte, regelbunden eller oregelbunden.För att bestämma pulsen, se till att programvaran korrekt identifierar alla P- och R-vågorna eftersom förmaks- och ventrikulärhastigheten baseras på INTERVALLET PP respektive RR. Korrigera eventuella misstag med automatisk identifiering genom att flytta de felplacerade markörerna till lämpliga P- och R-vågor. För att beräkna intervall och våg varaktigheter, öppna EKG-analys och genomsnittsvy att concatenate flera på varandra följande hjärt cykler i en enda genomsnittlig signal.Se till att programvaran korrekt identifierar start och av P-vågen, QRS-komplexet och T-vågen, flytta sedan de felplacerade markörerna till lämpliga positioner för att korrigera eventuella misstag med automatisk identifiering. Om du vill exportera EKG-mätningarna väljer du Tabellvy för att granska alla EKG-mätningarna och kopiera och klistra in mätningarna av intresse i ett kalkylblad för efterföljande analys. Om du vill exportera ett EKG-spår, använd förstoringsglaset för att markera ett avsnitt av intresse för EKG-svepet och kopiera och klistra in svepet i det önskade dokumentet.I kontrakt till det mänskliga hjärtat, som har två atria och två ventriklar, zebrafisk hjärtat har bara ett atrium och en ventrikel. Trots sin skenbara anatomiska enkelhet delar zebrafiskhjärtat flera EKG-funktioner med det mänskliga hjärtat. Korrekt bly placering kräver att anpassa ledningen med den förmodade hjärt huvudaxeln.När elektroderna förs in för ytligt i dermis anses ledningen vara indirekt-liknande och spänningssignalerna är små. När elektroderna sätts in till anslå one-millimeterdjupet in i pectoralismuskulaturen, bly- blir semi-rikta, och spänningen signalerar förhöjning. Om elektroderna sätts in djupare än en millimeter in i ventrikeln, blir dock blyet direkt och spänningssignalerna ökar ännu mer, med R vågamplituden ökar med fyrfaldigt jämfört med när elektroderna sätts in på lämpligt djup.EKG-spåren från alltför djupt insatta elektroder avslöjar också nya tecken på skada på kammarmuskelmyokardiet, såsom en ny ST-depression och en ny T-vågsinversion. Om de positiva och negativa elektroderna växlas i sin placering observeras ovanliga inversioner av alla EKG-vågformer. En olämplig nivå av sederingsdjup kan också försämra kvaliteten på in vivo EKG-inspelningen.Kom ihåg att bedöva djupt nog för att immobilisera fisken utan att döda den. Placera elektroderna för att maximera signal-brusförhållandet och undvik övertro på automatisk mjukvaruanalys. Efter denna minimalt invasiva överlevnad förfarande, det är möjligt att utföra andra förfaranden såsom partiell ablation, samband av hjärtat, eller seriella EKG undersökningar i narkotika svar eller longitudinella studier.Systemiska toxiciteter är potentiella komplikationer av någon bedövningsmedel, inklusive trikain. Dessa toxiciteter kan minskas genom att kapitalisera på synergin av flera bedövningsmedel för att sänka dosen av enskilda medel.

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantation av hela Njure Marrow i vuxen Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbital injektionsvätska till vuxna Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneal injektion i vuxen Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo elektroporering av Morpholinos i Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporering av Morpholinos i Regenerating Adult Zebrafish stjärtfenan

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blodinsamling för biokemisk analys i vuxen Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging vuxna zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

En analys för sidolinje Regeneration i vuxen Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Upprepad Blood Collection för Blodprov i vuxen Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...