Name: isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens at JoVE.com

该项目由华盛顿大学儿童探索研究所和圣路易斯儿童医院（CH-II-2015-462，CH-II-2017-628）、巴恩斯犹太医院基金会（8038-88）和NHLBI（R01）提供资金，使该项目得以实施。HL138466，R01 HL139714）。K.J.L.由NIH K08 HL123519和伯罗斯欢迎基金（1014782）提供支持。

提出的议定书已得到圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会（#201305086）的批准。所有受试者在采集样品前提供知情同意，实验按照批准的研究规程进行。提出的协议是在华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准下执行的，并遵循NIH《实验室动物护理和使用指南》中描述的准则。
1. 人类心脏组织标本的制备
<ol><li>通过排泄左右冠状动脉骨质，并注入200 mL的冷盐水，?...

<ol>
	<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart.">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction.">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction.">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li></ol>

该协议允许从人类心肌中提取各种巨噬菌体子集。该协议很简单，需要 3 到 4 小时准备单细胞悬浮液，为 FACS 分析做好准备。尽管该协议执行起来相对简单，但需要考虑某些技术方面，这将最大程度地降低可变性。首先，及时与人体组织合作是最佳细胞生存能力所必需的。保持组织在冷盐水/HBSS中，以尽量减少细胞死亡是很重要的。还需要从心肌标本中去除表皮脂肪和其他结缔组织。一致的组织?...

巨噬细胞是心脏中最丰富的免疫细胞类型，在心脏损伤1、2、3、4后产生强健的炎症和复原反应方面起着重要作用。此前，我们小组确定了从不同发育起源5、6的鼠心中产生的两个主要巨噬细胞子集。从广义上讲，根据CCR2（C-C型化学受体2）的细胞表面表达，可以识别组织驻留心脏巨噬细胞子集的不同群体。CCR2-巨噬细胞（细胞表面表达：CCR2-MHCII低和CCR2-MHCII高）是胚胎起源（原始和红霉素血统），能够自我更新，并代表在静息条件下占主导地位的种群。居民CCR2–巨噬细胞具有明确的造血原源，通过从循环单核细胞招募来维持，并在静息条件下代表一个未成年人群。功能上，CCR2-巨噬细胞产生最小的炎症，对冠状动脉发育新生儿心脏再生5，7至关重要。相反，CCR2–巨噬细胞在心脏侮辱后启动强健的炎症反应，并造成辅助性心肌细胞损伤、左心室的不良重塑和心力衰竭进展8、9。
最近，我们已经表明，人类心肌还包含两个不同的巨噬细胞子集，被类似地识别为CCR2-或CCR2=8。基因表达和功能分析表明，人类CCR2-和CCR2+巨噬细胞代表功能不同的子集，在功能上类似于CCR2-和CCR2–在小鼠心脏中发现的巨噬细胞。人类CCR2-巨噬细胞表达生长因子的稳健水平，包括IGF1、PDGF、Cyr61和HB-EGF。CCR2–巨噬细胞在促进炎症的化学素和细胞因子中富集，如IL-1b、IL-6、CCL-2、CCL-7和TNF-a。刺激的CCR2–巨噬细胞分泌明显升高的炎症细胞因子白细胞因子-1+（IL-1+）在培养中。这些子集如何差异地促进组织修复和左心室 （LV） 在心脏损伤背景下的重塑仍然是一个积极研究的领域。
基于流细胞学对小鼠和人心脏的巨噬细胞异质性的分析需要消化心脏组织并产生单个细胞悬浮液，然后进行流式细胞测量分析或细胞分拣，以便进一步进行下游过程，如散装RNA测序/单细胞RNA测序或培养细胞进行功能化检测。纳伦多夫等人2007年10日首次报道了从鼠心中分离单个细胞悬浮的最初协议。我们的实验室已经调整和修改了协议，从人类心肌中提取巨噬细胞。使用相同的协议，但在染色和门控方案略有修改，CD45-从人类心肌的基质细胞也可以收获。这里介绍，在文本和视频中，是一个协议，这是例行执行从人类心肌提取巨噬细胞或基质。
心脏组织标本从成人患者扩张性心肌病（DCM：特发性或家族性）或缺血性心肌病（ICM）接受左心室辅助装置（LVAD）植入或心脏移植。在开始消化程序之前，被切除的心脏或LVAD核心在血管内注入冷盐水。需要注意的是，根据疤痕或脂肪组织渗透程度确定的组织标本的"质量"可以极大地影响巨噬细胞的产量。大面积疤痕的心脏标本的细胞产量会低得多，当所需的下游分析方法需要体外细胞培养时，可能会造成严重的技术限制。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conocal Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-828-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH 8</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Deactivating Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63042-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase type 1-s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens

巨噬细胞代表了心脏中最异质和丰富的免疫细胞群，是心脏损伤后推动炎症和治疗反应的中心。巨噬细胞的各种子集如何协调心脏损伤后的免疫反应是一个活跃的研究领域。这里介绍的是一个简单的协议，我们的实验室执行常规，从小鼠和人类心肌标本从健康和患病个体提取巨噬细胞。简单地说，该协议涉及心脏组织的酶消化，以产生单个细胞悬浮液，然后是抗体染色和流动细胞测定。该技术适用于对已分拣的细胞进行的功能性检测以及散装和单细胞RNA测序。该协议的一个主要优点是其简单性、最小日常变化和广泛的适用性，允许研究各种小鼠模型和人类疾病实体的巨噬菌体异质性。

所述协议允许从小鼠和人类心肌分离巨噬细胞。使用相同的协议，但使用不同的染色和门控策略，基质细胞也可以从人类心肌收获。此处介绍的 FACS 结果是在 BD LSRII 或 BD FACS ARIA III 平台上获得的。补偿控制是从彩色血囊的单色控制样本生成的。图 1显示了未处理和处理的人类 LVAD 内核。图2显示了CCR2-CCR2+人巨噬细胞流量...

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Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

这里介绍的一个协议，通过酶消化制备单个细胞悬浮液，从人类和小鼠心肌中分离出巨噬细胞和其他非免疫细胞的各种子集。提出了基于流细胞学的识别与分离巨噬细胞表征的门控方案。

从人类和小鼠心肌标本中分离巨噬细胞子集和细胞位细胞

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

心脏包含免疫细胞的异构组，在心脏炎症和修复中起着至关重要的作用。为了了解免疫细胞的异质性，并进一步洞察其功能，重要的是要有一种方法，将允许这些细胞从心脏恢复。这种技术可以帮助发现存在于健康或患病心脏中的免疫和非免疫细胞多样性。这种技术有三个主要优点。首先，它是一个简单的单一工作流程，导致在三小时内生成各种细胞类型的单细胞悬浮液。其次，它导致活的免疫和非免疫细胞群的高恢复。第三，这是一种非常通用的方法，也可以应用于其他物种的心脏组织。注意用于单一消化反应的组织量很重要。使用无菌剪刀，在冷盐水或HSSS中从左心室的腹壁或横向壁解剖组织标本。小心地从标本中解剖出史诗般的脂肪和和弦肌腱。在无菌刀片或剪刀的帮助下，将组织块解剖成重约200毫克的碎片。对鼠标进行安乐死后，用锋利的剪刀打开胸腔。使用钝的底片将心脏向上抬起。使用连接到 5 毫升注射器的 25 量针将心脏用冷 PBS 填充。直到心脏出现颜色发白。取出心脏，放在冰上无菌的培养皿中。将200毫克的人体心脏组织块或穆林心脏放在无菌培养皿中。使用无菌刀片或剪刀将组织细小。为了建立消化，在15毫升的圆锥管中，准备每根人体心脏组织块或一个乳氨酸心脏的三毫升的最终消化量，其浓度为每毫升450、60和60个单位。在管中加入2.5毫升DMEM。在清洁钳的帮助下，将细小的切碎的组织放入每个反应管中。通过温和的漩涡混合良好。在37摄氏度的震动孵化器中消化一小时，以中低的搅拌速度。经过一个小时的消化，从培养箱中取出管子，放在冰上。设置 50 毫升锥形管，顶部有 40 微米电池过滤器。用两毫升酶停用缓冲液将过滤器弄湿。接下来，通过在每个消化管中加入八毫升酶停用缓冲液来停用消化酶酶。然后通过 40 微米细胞过滤器将产生的 13 毫升总混合物倒入 50 毫升锥形管中。将过滤过的样品在新鲜的 15 毫升锥形管中转移。在4摄氏度下以400倍g旋转样品6分钟。丢弃上一杯，留下0.5毫升的介质。通过温和移液重新填充细胞颗粒，并加入一毫升的 ACK 解合缓冲液。温和旋转管，在室温下孵育五分钟，进行红血球解。在 ACK 缓冲液中输入 5 分钟后，向样品中加入 9 毫升 DMEM。将盖子放回管子上，轻轻反转管子进行混合。通过 40 微米细胞过滤器过滤，并在 15 毫升锥形管中收集滤物。将管子以400倍g离心6分钟，然后丢弃上流液。加入一毫升的 FACS 缓冲液，然后重新暂停颗粒。然后将其转移到1.5毫升微离心管。再次以 400 次 g 离心，五分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新在 100 微升的 FACS 缓冲液中。单细胞悬浮液现已准备好进行抗体染色。在1至50次稀释时，将典型的人体抗体面板添加到心脏样本中。使用不同的抗体进行频闪细胞和穆林心脏巨噬细胞。在黑暗中4摄氏度下孵育30至40分钟。加入一毫升的 FACS 缓冲液，轻轻涡流，以 400 次 g 离心，5 分钟。再次重复此洗涤步骤。然后将样品重新在 350 微升的 FACS 缓冲液中重新暂停，并添加 DAPI 以达到一微摩尔的最终浓度。这些示例现已准备好进行 FACS 分析。在该协议中，实现了巨噬细胞与小鼠和人类心肌的分离。此图显示了未处理和加工的人类 LVAD 内核。介绍了CCR2阴性、CCR2阳性人类巨噬细胞从人体肌膜和CD45阴性肌细胞的流量分选方案。Wright 染色 FACS 排序 CD45 阳性和 CD45 负细胞的图像显示完整的细胞膜，表明生存能力。从老鼠心脏中分拣巨噬细胞的浇注方案也取得了成功。用于酶反应的组织的重量对于有效消化至关重要。对协议中所示的酶浓度使用不超过200毫克的组织。按照这种方法，可以培养细胞进行体外刺激测定。细胞可以分类进行批量RNA测序或单细胞测序。这种方法在发现健康或患病人类心脏中以前未识别的巨噬细胞异质性方面已是一种宝贵的技术。使用这种方法，然后进行单细胞测序，研究正在发现各种免疫和非免疫细胞如何从患病的心脏和健康的心脏变化。

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