Name: isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens at JoVE.com

इस परियोजना को वाशिंगटन विश्वविद्यालय के चिल्ड्रन डिस्कवरी संस्थान और सेंट लुइस चिल्ड्रन अस्पताल (सीएच-II-2015-462, CH-II-2017-628), बार्न्स-यहूदी अस्पताल (8038-88) की नींव और NHLBI (R01) से प्रदान की गई फंडिंग से संभव बनाया गया था । एचएल138466, आर01 एचएल139714) । केजेएल को एनआईएच के08 एचएल123519 और बुर्के वेलकम फंड (1014782) द्वारा समर्थित किया गया है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल को वाशिंगटन विश्वविद्यालय ने सेंट लुइस इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (#201305086) में मंजूरी दे दी है। सभी विषय नमूना संग्रह से पहले सूचित सहमति प्रदान करते हैं और प्रयोग अनुमोदित अध्ययन प?...

<ol>
	<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart.">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction.">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction.">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li></ol>

प्रोटोकॉल मानव मायोकार्डियम से विभिन्न मैक्रोफेज सबसेट को निकालने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल सरल है और FACS विश्लेषण के लिए तैयार एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए 3 से 4 घंटे लगते हैं। हालांकि प्रोटोकॉ?...

मैक्रोफेज दिल में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं, और वे हृदय की चोट1,2,3,4के बाद मजबूत भड़काऊ और पुनः ात्मक प्रतिक्रियाएं पैदा करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इससे पहले, हमारे समूह ने अलग-अलग विकासात्मक मूल5,6से प्राप्त मूत्र हृदय में मैक्रोफेज के दो प्रमुख सबसेट ों की पहचान की। मोटे तौर पर, ऊतक निवासी कार्डियक मैक्रोफेज सबसेट की अलग आबादी सीसीआर 2 (सी-सी आकृति केमोकिन रिसेप्टर 2) की सेल सतह अभिव्यक्ति के आधार पर पहचानकी जा सकती है। CCR2- मैक्रोफेज (सेल सतह अभिव्यक्ति: CCR2-MHCIIकम और CCR2-MHCIIउच्च)भ्रूणमूल (आदिम और एरिथ्रोमाइलॉयड वंश) के हैं, जो आत्म-नवीनीकृत करने में सक्षम हैं, और होम्योपैथिक स्थितियों के तहत एक प्रमुख आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। निवासी CCR2+ मैक्रोफेज निश्चित हेमेटोपोइटिक मूल के हैं, मोनोसाइट्स परिसंचारी से भर्ती के माध्यम से बनाए रखा जाता है, और होमोस्टैटिक स्थितियों के तहत एक छोटी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कार्यात्मक रूप से, CCR2- मैक्रोफेज न्यूनतम सूजन उत्पन्न करते हैं और कोरोनरी विकास नवजात हृदय पुनर्जनन5,7के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, CCR2+ मैक्रोफेज हृदय अपमान के बाद मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रियाएं शुरू करते हैं और कोलैटरल कार्डियोमायोसाइट चोट, बाएं वेंट्रिकल के प्रतिकूल पुनर्मॉडलिंग और दिल की विफलता प्रगति8,9में योगदान देते हैं।
हाल ही में, हमने दिखाया है कि मानव मायोकार्डियम में मैक्रोफेज के दो अलग-अलग सबसेट भी होते हैं, जिन्हें सीसीआर 2- या सीसीआर 2+8के रूप में पहचाना जाता है। जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक विश्लेषणों से पता चला है कि मानव CCR2-और CCR2+ मैक्रोफेज कार्यात्मक रूप से अलग सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं और कार्यात्मक रूप से सीसीआर 2 के अनुरूप हैं- और माउस दिल में पाए जाने वाले CCR2+ मैक्रोफेज। मानव CCR2- मैक्रोफेज आईजीएफ 1, पीडीजीएफ, साइर61 और एचबी-ईजीएफ सहित विकास कारकों के मजबूत स्तर को व्यक्त करते हैं। सीसीआर2+ मैक्रोफेज केमोकिन्स और साइटोकिन्स में समृद्ध होते हैं जो सूजन को बढ़ावा देते हैं, जैसे आईएल-1बी, आईएल-6, सीसीएल-2, सीसीएल-7, और टीएनएफ-ए। उत्तेजित CCR2+ मैक्रोफेज संस्कृति में भड़काऊ साइटोकिन इंटरल्यूकिन-1ए (आईएल-1ए) के स्पष्ट रूप से उच्च स्तर को स्रावित करते हैं। कैसे इन सबसेट अंतर ऊतक की मरंमत के लिए योगदान और कार्डियक चोट के संदर्भ में छोड़ दिया वेंट्रिकुलर (LV) remodeling सक्रिय अनुसंधान का एक क्षेत्र बना हुआ है ।
माउस और मानव हृदय में मैक्रोफेज विषमता के प्रवाह-साइटोमेट्री आधारित विश्लेषण के लिए हृदय ऊतक को पचाने और एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है जिसके बाद प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण या सेल छंटाई के बाद आगे डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं जैसे बल्क आरएनए अनुक्रमण/एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण या कार्यात्मक रूपों के लिए कोशिकाओं को संजोना । मूत्र दिलों से एक सेल निलंबन करने के लिए मूल प्रोटोकॉल पहली बार Nahrendorf एट अल 200710में Nahrendorf समूह द्वारा सूचित किया गया. हमारी प्रयोगशाला ने मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज निकालने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित और संशोधित किया है। एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करना लेकिन धुंधला और गेटिंग योजना में मामूली संशोधन के साथ, सीडी 45- मानव मायोकार्डियम से स्ट्रोमल कोशिकाओं को भी काटा जा सकता है। यहां प्रस्तुत, पाठ और वीडियो में, एक प्रोटोकॉल है कि मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज या स्ट्रोमल की निकासी के लिए नियमित रूप से किया जाता है ।
कार्डियक ऊतक नमूने वयस्क रोगियों से प्राप्त किए जाते हैं, जिनमें वयस्क रोगियों को फैलाया गया कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम: इडियोपैथिक या पारिवारिक) या इस्कीमिक कार्डियोमायोपैथी (आईसीएम) बाएं वेंट्रिकुलर असिस्ट डिवाइस (एलवीएडी) प्रत्यारोपण या हृदय प्रत्यारोपण से गुजर रहा है। दिल या एलवीएडी कोर को पाचन प्रक्रिया शुरू करने से पहले ठंडे खारे के साथ इंट्रावास्कुलर रूप से छिद्रित किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऊतक के नमूने की "गुणवत्ता" जख्म या एडीपोज ऊतक घुसपैठ की डिग्री के संदर्भ में निर्धारित मैक्रोफेज की उपज को बहुत प्रभावित कर सकती है। जख्म के बड़े क्षेत्रों के साथ दिल के नमूनों में बहुत कम सेल यील्ड होगी और वांछित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण विधियों के विट्रो सेल पुलिया की आवश्यकता होने पर गंभीर तकनीकी सीमा पैदा कर सकती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conocal Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-828-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH 8</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Deactivating Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63042-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase type 1-s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens

मैक्रोफेज दिल में सबसे विषम और प्रचुर मात्रा में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं और हृदय की चोट के बाद सूजन और पुनः ात्मक प्रतिक्रियाओं को चलाने में केंद्रीय हैं। हृदय की चोट के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कैसे आर्केस्ट्रा करते हैं, मैक्रोफेज के विभिन्न सबसेट अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है। यहां प्रस्तुत एक सरल प्रोटोकॉल है कि हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से प्रदर्शन करती है, माउस और स्वस्थ और रोगग्रस्त व्यक्तियों से प्राप्त मानव मायोकार्डियम नमूनों से मैक्रोफेज की निकासी के लिए। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में एक सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए हृदय ऊतक का एंजाइमैटिक पाचन शामिल है, जिसके बाद एंटीबॉडी धुंधला होता है, और साइटोमेट्री प्रवाह होता है। यह तकनीक हल कोशिकाओं के साथ-साथ थोक और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण पर किए गए कार्यात्मक परखों के लिए उपयुक्त है। इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ इसकी सादगी, दिन-प्रतिदिन की भिन्नता और व्यापक प्रयोज्यता है जो विभिन्न माउस मॉडल और मानव रोग संस्थाओं में मैक्रोफेज विषमता की जांच की अनुमति देती है।

वर्णित प्रोटोकॉल माउस और मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज के अलगाव की अनुमति देता है। एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करना, लेकिन एक अलग धुंधला और गेटिंग रणनीति के साथ, स्ट्रोमल कोशिकाओं को मानव म?...

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Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

यहां प्रस्तुत एंजाइमैटिक पाचन के माध्यम से एक एकल सेल निलंबन तैयार करके मानव और माउस मायोकार्डियम से मैक्रोफेज और अन्य गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट ों को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रवाह साइटोमेट्री आधारित पहचान और इक्का-दुक्का मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन के लिए गेटिंग योजनाएं भी प्रस्तुत की जाती हैं।

मानव और माउस मायोकार्डियल नमूनों से मैक्रोफेज सबसेट और स्ट्रोमल कोशिकाओं का अलगाव

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

दिल में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विषम आबादी होती है जो हृदय सूजन के साथ-साथ मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विषमता को समझने और उनके कार्य में आगे की जानकारी प्राप्त करने के लिए, एक विधि होना महत्वपूर्ण है जो दिल से इन कोशिकाओं की वसूली के लिए अनुमति देगा। यह तकनीक प्रतिरक्षा के साथ-साथ गैर-एनीम्यू सेल विविधता को उजागर करने में मदद कर सकती है जो स्वस्थ या रोगग्रस्त दिल में रहती है।इस तकनीक के तीन मुख्य फायदे हैं। सबसे पहले, यह एक साधारण एकल कार्यप्रवाह है जो तीन घंटे के भीतर विभिन्न सेल प्रकारों के एकल सेल निलंबन की पीढ़ी की ओर जाता है। दूसरे, यह व्यवहार्य प्रतिरक्षा और nonimmune सेल आबादी की उच्च वसूली की ओर जाता है ।और तीसरे, यह एक बहुत ही बहुमुखी विधि है और अन्य प्रजातियों में भी दिल के ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है। एक पाचन प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतकों की मात्रा पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। ठंडे खारे या एचबीएसएस में बाएं वेंट्रिकल की एपिकल या पार्श्व दीवार से बाँझ कैंची, विच्छेदन ऊतक नमूना का उपयोग करें।नमूने से एपिकार्डियल वसा और कोरडी टेंडीने को सावधानी से विच्छेदन करें। बाँझ ब्लेड या कैंची की मदद से, ऊतक के हिस्से को लगभग 200 मिलीग्राम वजनी टुकड़ों में विच्छेदन करें। माउस को इच्छामृत्यु के बाद, तेज कैंची की मदद से छाती गुहा खोलें।दिल को ऊपर की ओर उठाने के लिए कुंद हीमोस्टेट का उपयोग करें। पांच मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 25 गेज सुई का उपयोग करके ठंडे पीबीएस के साथ दिल को पर्फ्यूज करें। जब तक दिल रंग में ब्लैंच किया जाता है तब तक पर्फ्यूज करें।दिल निकालें और बर्फ पर बाँझ पेट्री डिश में रखें। एक बाँझ पेट्री डिश में मानव हृदय ऊतक हिस्सा या मुरीन दिल के 200 मिलीग्राम रखें। एक बाँझ ब्लेड या कैंची का उपयोग कर ऊतक बारीक कीमा।पाचन स्थापित करने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंकुदाता में, हर मानव हृदय ऊतक हिस्सा या एंजाइमों कोलेजनेस I, DNase I, और hyaluronidase प्रति मिलीलीटर की सांद्रता पर hyaluronidase के साथ हर मानव हृदय ऊतक हिस्सा या एक मुरीन दिल के लिए तीन मिलीलीटर की एक अंतिम पाचन मात्रा तैयार करते हैं । ट्यूब में डीएमईएम के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। साफ संदंश की मदद से, बारीक कीमा बनाया हुआ ऊतक प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब में रखें।कोमल भंवर से अच्छी तरह मिलाएं। एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए डाइजेस्ट एक कम से मध्यम आंदोलन की गति के लिए सेट । पाचन के एक घंटे के बाद ट्यूबों को इनक्यूबेटर से बाहर निकालकर बर्फ पर रखें।शीर्ष पर 40 माइक्रोन सेल छन्नी के साथ 50 मिलीलीटर शंकु नलियों की स्थापना करें। दो मिलीलीटर एंजाइम निष्क्रिय बफर के साथ फिल्टर गीला करें। इसके बाद, प्रत्येक पाचन ट्यूब में आठ मिलीलीटर एंजाइम निष्क्रिय बफर जोड़कर पाचन एंजाइमों को निष्क्रिय करें।फिर 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से कुल मिश्रण के परिणामस्वरूप 13 मिलीलीटर डालना। फ़िल्टर किए गए नमूनों को ताजा 15 मिलीलीटर शंकु नलियों में वापस स्थानांतरित करें। नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर छह मिनट के लिए ४०० बार जी पर स्पिन करें ।मीडिया के 0.5 मिलीलीटर छोड़ने वाले सुपरनेट को त्यागें। कोमल पिप्टिंग द्वारा सेल पेलेट को फिर से रीसल करें और एक मिलीलीटर को एक मिलीलीटर जोड़ें। कोमल ट्यूब को घूमता है और लाल रक्त कोशिका लाइसिस करने के लिए पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करता है।ACK बफर में पांच मिनट के बाद, नमूने में डीएमईएम के नौ मिलीलीटर जोड़ें। ढक्कन को वापस ट्यूबों पर रखें और धीरे-धीरे ट्यूबों को मिलाने के लिए उलटा करें। 40 माइक्रोन सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें और 15 मिलीलीटर शंकु नलियों में फिल्ट्रेट एकत्र करें।छह मिनट के लिए 400 बार जी पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्याग दें। FACS बफर के एक मिलीलीटर जोड़ें और गोली को फिर से खर्च करें। फिर इसे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर फिर से सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्यागें और लेफेस बफर के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से रीसस्ट करें। एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए अब सिंगल सेल सस्पेंशन तैयार है।एक से 50 कमजोर पड़ने पर दिल के नमूनों के लिए एक ठेठ मानव एंटीबॉडी पैनल जोड़ें। स्ट्रोमल कोशिकाओं और मुरीन हार्ट मैक्रोफेज के लिए अलग-अलग एंटीबॉडी का इस्तेमाल करें। अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर 30 से 40 मिनट तक इनक्यूबेट करें।पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर FACS बफर, धीरे भंवर और अपकेंद्रित्र का एक मिलीलीटर जोड़ें। इस वॉशिंग स्टेप को दूसरी बार दोहराएं। फिर एफएएफएस बफर के 350 माइक्रोलीटर में नमूना फिर से खर्च करें और एक माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए DAPI जोड़ें।नमूने अब FACS विश्लेषण के लिए तैयार हैं। इस प्रोटोकॉल में, माउस और मानव मायोकार्डियम से मैक्रोफेज का अलगाव हासिल किया गया था। यह आंकड़ा असंसाधित और संसाधित मानव LVAD कोर से पता चलता है ।मानव मायोकार्डियम से सीसीआर 2 नकारात्मक और सीसीआर 2 सकारात्मक मानव मैक्रोफेज के प्रवाह छंटाई के साथ-साथ मानव इस्कीमिक कार्डियोमायोपैथी से सीडी 45 नकारात्मक स्ट्रोमल कोशिकाओं के लिए गेटिंग योजना प्रस्तुत की गई। राइट दाग FACS की छवियों CD45 सकारात्मक और CD45 नकारात्मक कोशिकाओं को अक्षुण्ण कोशिका झिल्ली व्यवहार्यता का संकेत दिखाते हैं । माउस हार्ट से मैक्रोफेज को छांटने की गेटिंग स्कीम भी सफल रही।एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक का वजन कुशल पाचन के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल में इंगित एंजाइम सांद्रता के लिए ऊतक के 200 मिलीग्राम से अधिक का उपयोग करें। इस विधि के बाद, कोशिकाओं को इन विट्रो उत्तेजना परख के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है।कोशिकाओं को थोक आरएनए अनुक्रमण या एकल सेल अनुक्रमण के लिए हल किया जा सकता है। इस विधि ने स्वस्थ या रोगग्रस्त मानव हृदय में मौजूद पहले से अपरिचित मैक्रोफेज विषमता की खोज में एक अमूल्य तकनीक के रूप में कार्य किया है। एकल कोशिका अनुक्रमण के बाद इस विधि का उपयोग करके, विभिन्न प्रतिरक्षा और गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं को स्वस्थ हृदय बनाम रोगग्रस्त हृदय से कैसे भिन्न होता है, इसे उजागर करने के लिए अध्ययन चल रहे हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

माउस peritoneal गुहा कक्ष के अलगाव

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

माउस फेफड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं का अलगाव

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

अलगाव और और माउस आंत से वृक्ष के समान कोशिकाओं मैक्रोफेज की विशेषता

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

अग्रदूत बी सेल सबसेट के गर्भनाल रक्त से अलगाव

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

मानव थाइमस से माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं और उपकला कोशिकाओं का अलगाव

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Murine लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं का अलगाव

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

माउस भोले सीडी 4<sup&gt; +</sup&gt; टी सेल अलगाव और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; टी सेल सबसेट में भेदभाव

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

मानव मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस से leukocytes की अलगाव

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Adenovirus संक्रमित सामान्य मानव कोशिकाओं से वायरल प्रतिकृति कम्पार्टमेंट समृद्ध उप-परमाणु भागों का अलगाव

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

अलगाव और इस्केमिक माउस मस्तिष्क से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...