Name: isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens at JoVE.com

Questo progetto è stato reso possibile dai finanziamenti forniti dal Children's Discovery Institute della Washington University e dal St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), dalla Fondazione del Barnes-Jewish Hospital (8038-88) e dal NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. è supportato da NIH K08 HL123519 e Burroughs Welcome Fund (1014782).

Il protocollo presentato è stato approvato dalla Washington University nel St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Tutti i soggetti forniscono il consenso informato prima della raccolta dei campioni e gli esperimenti vengono eseguiti in conformità con il protocollo di studio approvato. Il protocollo presentato viene eseguito con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Washington University School of Medicine e segue le linee guida descritte nella Guida NIH per la cur...

<ol>
	<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart.">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction.">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction.">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li></ol>

Il protocollo consente l'estrazione di vari sottoinsiemi di macrofafi dal miocardio umano. Il protocollo è semplice e richiede da 3 a 4 ore per preparare le sospensioni a cella singola pronte per l'analisi FACS. Anche se il protocollo è relativamente semplice da eseguire, ci sono alcuni aspetti tecnici che devono essere considerati che ridurrà al minimo la variabilità. In primo luogo, lavorare in modo tempestivo con il tessuto umano è necessario per una vitalità cellulare ottimale. È importante mantenere il tessut...

I macrofagi rappresentano il tipo di cellule immunitarie più abbondanti nel cuore, e svolgono un ruolo significativo nel generare robuste risposte infiammatorie e riparative dopo lesioni cardiache1,2,3,4. In precedenza, il nostro gruppo identificava due sottoinsiemi principali di macrofagi nel cuore murino derivati da origini dello sviluppo distinte5,6. In generale, è possibile identificare popolazioni distinte di sottoinsiemi di macrofagi cardiaci residenti in tessuto in base all'espressione della superficie cellulare del CCR2 (recettore chemiochina motivo C-C 2). CCR2- i macrofagi (espressione della superficie cellulare: CCR2-MHCIIbasso e CCR2-MHCIIalto)sono di origine embrionale (linee primitive ed eritromieloidi), in grado di auto-rinnovarsi e rappresentare una popolazione dominante in condizioni omeostatiche. Residenti CCR2- i macrofagi sono di origine ematopoietica definitiva, sono mantenuti attraverso il reclutamento di monociti circolanti e rappresentano una popolazione minore in condizioni omeostatiche. Funzionalmente, CCR2- i macrofagi generano un'infiammazione minima e sono fondamentali per lo sviluppo coronarica cardiaca neonatale5,7. Al contrario, i macrofagi CCR2 avviano robuste risposte infiammatorie a seguito di insulti cardiaci e contribuiscono a lesioni cardiomiociti collaterali, rimodellamento avverso del ventricolo sinistro e progressione dell'insufficienza cardiaca8,9.
Recentemente, abbiamo dimostrato che il miocardio umano contiene anche due distinti sottoinsiemi di macrofagi identificati in modo simile a CCR2- o CCR2-8. L'espressione genica e le analisi funzionali hanno rivelato che i macrofagi CCR2- e CCR2- rappresentano sottoinsiemi funzionalmente divergenti e sono funzionalmente analoghi a CCR2- e CCR2- macrofagi trovati nel cuore del topo. Human CCR2- i macrofagi esprimono solidi livelli di fattori di crescita, tra cui IGF1, PDGF, Cyr61 e HB-EGF. I macrofagi CCR2sono arricchiti in chemiochini e citochine che promuovono l'infiammazione, come IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 e TNF-a. I macrofagi stimolati secernono livelli marcatamente più elevati della citochina infiammatoria interleuchina-1 ( IL-1) in coltura. Il modo in cui questi sottoinsiemi contribuiscono in modo differenziale alla riparazione dei tessuti e al rimodellamento ventricolare sinistro (LV) nel contesto delle lesioni cardiache rimane un'area di ricerca attiva.
L'analisi basata sulla citometria del flusso nel mouse e nel cuore umano richiede la digestione del tessuto cardiaco e la generazione di una sospensione a singola cellula seguita dall'analisi citometrica del flusso o dallo smistamento cellulare per ulteriori processi a valle come il sequenziamento di massa di RNA /sequenziamento dell'RNA a singola cellula o la coltura delle cellule per analisi funzionali. Il protocollo originale per la creazione di una sospensione a cella singola da cuori murini è stato riportato per la prima volta dal gruppo Nahrendorf in Nahrendorf et al. 200710. Il nostro laboratorio ha adattato e modificato il protocollo per estrarre i macrofagi dal miocardio umano. Utilizzando lo stesso protocollo, ma con una leggera modifica nello schema di colorazione e gating, CD45- cellule stromali del miocardio umano può anche essere raccolto. Presentato qui, in testo e video, è un protocollo che viene eseguito regolarmente per l'estrazione di macrofagi o stromal dal miocardio umano.
I campioni di tessuto cardiaco sono ottenuti da pazienti adulti con cardiomiopatia dilatata (DCM: idiopatica o familiare) o cardiomiopatia ischemica (ICM) sottoposta a impianto di assistenza ventricolare sinistra (LVAD) impianto o trapianto cardiaco. I cuori esoppiantati o i nuclei LVAD sono intravascolari perfusi con salina fredda prima di iniziare la procedura di digestione. È importante notare che la "qualità" del campione di tessuto determinata in termini di grado di cicatrici o infiltrazione di tessuto adiposo può influenzare notevolmente la resa dei macrofagi. Gli esemplari cardiaci con ampie aree di cicatrici avranno una resa cellulare molto più bassa e possono porre gravi limitazioni tecniche quando i metodi di analisi a valle desiderati richiedono una coltura cellulare in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conocal Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-828-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH 8</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Deactivating Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63042-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase type 1-s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens

I macrofagi rappresentano le popolazioni di cellule immunitarie più eterogenee e abbondanti nel cuore e sono centrali nel guidare l'infiammazione e le risposte riparative dopo lesioni cardiache. Come vari sottoinsiemi di macrofagi orchestrano le risposte immunitarie dopo lesioni cardiache è un'area attiva di ricerca. Presentato qui è un semplice protocollo che il nostro laboratorio esegue regolarmente, per l'estrazione di macrofagi da campioni di topo e miocardio umano ottenuti da individui sani e malati. In breve, questo protocollo comporta la digestione enzimatica del tessuto cardiaco per generare una singola sospensione cellulare, seguita da colorazione anticorpale, e citometria di flusso. Questa tecnica è adatta per i saggi funzionali eseguiti su cellule ordinate e per il sequenziamento di RNA sfuso e a singola cellula. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è la sua semplicità, la variazione minima giorno per giorno e l'ampia applicabilità che consente lo studio dell'eterogeneità dei macrofaci tra vari modelli murini ed entità di malattie umane.

Il protocollo descritto consente l'isolamento dei macrofagi dal topo e dal miocardio umano. Utilizzando lo stesso protocollo, ma con una diversa strategia di colorazione e gating, le cellule stromali possono anche essere raccolte dal miocardio umano. I risultati FACS qui presentati sono stati acquisiti sulla piattaforma BD LSRII o BD FACS ARIA III. I controlli di compensazione sono stati generati da campioni di controllo del colore singolo provenienti da splenociti macchiati. <strong clas...

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Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Presentato qui è un protocollo per isolare vari sottoinsiemi di macrofagi e altre cellule non immuni dal miocardio umano e topidano preparando una sospensione a singola cellula attraverso la digestione enzimatica. Vengono inoltre presentati schemi di Gating per l'identificazione e la caratterizzazione basata sulla citometria del flusso di macrofagi.

Isolamento di sottoinsiemi di macrofaschi e cellule stromali da esemplari di miocardio umano e topo

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Il cuore contiene una popolazione eterogenea di cellule immunitarie che svolgono ruoli cruciali nell'infiammazione cardiaca e nella riparazione. Per comprendere l'eterogeneità delle cellule immunitarie e ottenere ulteriori informazioni sulla loro funzione, è importante avere un metodo che consenta il recupero di queste cellule dal cuore. Questa tecnica può aiutare a scoprire la diversità cellulare immunitaria e nonimmune che risiede nel cuore sano o mato.Ci sono tre vantaggi principali in questa tecnica. Innanzitutto, è un semplice flusso di lavoro singolo che porta alla generazione di sospensioni a cella singola di vari tipi di celle entro tre ore dal termine. In secondo luogo, porta ad un elevato recupero di popolazioni cellulari immunitarie e non immuni vitali.E in terzo luogo, è un metodo molto versatile e può essere applicato anche ai tessuti cardiaci di altre specie. Prestare attenzione alla quantità di tessuto utilizzato per una singola reazione di digestione è importante. Utilizzare forbici sterili, sezionare il campione di tessuto dalla parete apicale o laterale del ventricolo sinistro in soluzione salina fredda o HBSS.Sezionare con cura il grasso epicardiale e le tendinee delle chordae dall'esemplare. Con l'aiuto di una lama sterile o forbici, sezionare i pezzi di tessuto in pezzi del peso di circa 200 milligrammi. Dopo aver eutanasiato il topo, aprire la cavità toracica con l'aiuto di forbici affilate.Usa hemostat smussati per sollevare il cuore verso l'alto. Perfondere il cuore con PBS freddo utilizzando un ago calibro 25 attaccato a una siringa da cinque millilitri. Perfondi fino a quando il cuore appare sbiancato a colori.Rimuovere il cuore e posizionare in una piastra di Petri sterile sul ghiaccio. Mettere 200 milligrammi di pezzi di tessuto cardiaco umano o cuore murino in una piastra di Petri sterile. Tritare finemente il tessuto usando una lama sterile o forbici.Per impostare la digestione, in un tubo conico da 15 millilitri, preparare un volume finale di digestione di tre millilitri per ogni pezzo di tessuto cardiaco umano o un cuore murino con enzimi collagenasi I, DNasi I e ialuronidasi a concentrazioni di 450, 60 e 60 unità per millilitro. Aggiungere 2,5 millilitri di DMEM nel tubo. Con l'aiuto di forcelle pulite, posizionare il tessuto finemente tritato in ogni tubo di reazione.Mescolare bene con un vortice delicato. Digerire per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di scuotimento impostato a una velocità di agitazione da bassa a media. Dopo un'ora di digestione, eserti i tubi dall'incubatrice e posizionare sul ghiaccio.Impostare tubi conici da 50 millilitri con un colino a celle da 40 micron sopra. Bagnare i filtri con due millilitri di tampone disattivante enzimatico. Successivamente, disattivare gli enzimi di digestione aggiungendo otto millilitri di tampone di disattivazione enzimatico a ciascun tubo di digestione.Quindi versare i 13 millilitri risultanti della miscela totale attraverso il filtro cellulare da 40 micron nei tubi conici da 50 millilitri. Trasferire i campioni filtrati in tubi conici freschi da 15 millilitri. Ruotare i campioni a 400 volte g per sei minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il supernatante lasciando 0,5 millilitri di supporti. Rimescolare il pellet di cella mediante pipettazione delicata e aggiungere un millilitro di tampone di llisi ACK. Ruotare delicatamente il tubo e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti per eseguire la lisi dei globuli rossi.Dopo cinque minuti nel buffer ACK, aggiungere nove millilitri di DMEM al campione. Riposizionare il coperchio sui tubi e invertire delicatamente i tubi da mescolare. Filtrare attraverso un colino a celle da 40 micron e raccogliere il filtrato in tubi conici da 15 millilitri.Centrifugare i tubi a 400 volte g per sei minuti e scartare il supernatante. Aggiungere un millilitro di tampone FACS e rimospendare il pellet. Quindi trasferirlo in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Centrifugare di nuovo a 400 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Una sospensione a singola cellula è ora pronta per la colorazione degli anticorpi.Aggiungere un tipico pannello anticorpale umano ai campioni cardiaci a una o 50 diluizione. Utilizzare diversi anticorpi per cellule stromali e macrofagi cardiaci murini. Incubare per 30-40 minuti a quattro gradi Celsius al buio.Aggiungere un millilitro di tampone FACS, vortice delicatamente e centrifuga a 400 volte g per cinque minuti. Ripetere questo passaggio di lavaggio una seconda volta. Quindi rimospendare il campione in 350 microlitri di tampone FACS e aggiungere DAPI per raggiungere una concentrazione finale di un micromolare.I campioni sono ora pronti per l'analisi FACS. In questo protocollo è stato raggiunto l'isolamento dei macrofagi dal topo e dal miocardio umano. Questa figura mostra il nucleo LVAD umano non elaborato ed elaborato.Sono stati presentati lo schema di gating per lo smistamento del flusso dei macrofagi umani negativi CCR2 e CCR2 dal miocardio umano e per le cellule stromali negative CD45 dalla cardiomiopatia ischemica umana. Le immagini delle FACS macchiate di Wright ordinate CD45 positive e CD45 negative mostrano una membrana cellulare intatta che indica la vitalità. Anche lo schema di gating per ordinare i macrofagi da un cuore di topo ebbe successo.Il peso del tessuto utilizzato per la reazione enzimatica è fondamentale per una digestione efficiente. Utilizzare non più di 200 milligrammi di tessuto per le concentrazioni enzimatiche indicate nel protocollo. Seguendo questo metodo, le cellule possono essere coltivate per saggi di stimolazione in vitro.Le celle possono essere ordinate per il sequenziamento dell'RNA di massa o il sequenziamento a singola cella. Questo metodo è servito come tecnica inestimabile per scoprire l'eterogeneità del macrofago precedentemente non riconosciuta presente nel cuore umano sano o mato. Utilizzando questo metodo seguito dal sequenziamento a singola cellula, sono in corso studi per scoprire come varie cellule immunitarie e non immuni variano dal cuore mato rispetto al cuore sano.

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