Name: isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens at JoVE.com

このプロジェクトは、ワシントン大学の小児発見研究所とセントルイス小児病院(CH-II-2015-462、CH-II-2017-628)、バーンズ・ユダヤ病院財団(8038-88)、NHLBI(R01)から提供された資金によって可能になりました。HL138466、 R01 HL139714)。K.J.L.は、NIH K08 HL123519およびバロウズウェルカムファンド(1014782)によってサポートされています。

提示されたプロトコルは、セントルイス機関審査委員会(#201305086)のワシントン大学によって承認されています。すべての被験者は、サンプル収集の前にインフォームド・コンセントを提供し、実験は承認された研究プロトコルに従って行われる。提示されたプロトコルは、ワシントン大学医学部の制度的動物ケアと使用委員会の承認を得て行われ、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに?...

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	<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart.">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction.">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction.">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li></ol>

このプロトコルは、ヒト心筋からの種々のマクロファージサブセットの抽出を可能にする。プロトコルはシンプルで、FACS分析の準備が整った単一細胞懸濁液の準備に3~4時間かかります。プロトコルの実行は比較的簡単ですが、変動を最小限に抑える技術的な側面を考慮する必要があります。第一に、最適な細胞生存率を得るには、ヒト組織をタイムリーに働かすことができます。細胞死を最...

マクロファージは心臓の中で最も豊富な免疫細胞型を表し、心損傷1、2、3、4に続く堅牢な炎症および修復応答を生成する上で重要な役割を果たす。以前、私たちのグループは、異なる発達起源5、6に由来するマウス心臓におけるマクロファージの2つの主要なサブセットを同定した。広く、組織常駐心臓マクロファージサブセットの異なる集団は、CCR2(C−Cモチーフケモカイン受容体2)の細胞表面発現に基づいて同定することができる。CCR2-マクロファージ(細胞表面発現:CCR2-MHCII低およびCCR2-MHCII高)は胚起源(原始およびエリスロ骨髄系統)であり、自己再生することができ、恒主状態下で支配的な集団を表すことができる。居住者CCR2+マクロファージは、決定的な造血起源であり、循環単球からのリクルートを通じて維持され、恒静学的条件下でのマイナーな集団を表す。機能的には、CCR2-マクロファージは最小限の炎症を発生し、冠動脈発生新生児心臓再生5、7に不可欠である。対照的に、CCR2+マクロファージは、心侮辱に続いて強固な炎症反応を開始し、心筋細胞損傷、左心室の有害な改造、および心不全進行8、9に寄与する。
最近、ヒト心筋には、CCR2-またはCCR2+8のいずれかとして同様に同定されたマクロファージの2つの異なるサブセットも含まれていることが示されている。遺伝子発現および機能解析は、ヒトCCR2-およびCCR2+マクロファージが機能的に発散したサブセットを表し、マウス心臓に見られるCCR2およびCCR2+マクロファージに機能的に類似していることを明らかにした。ヒトCCR2-マクロファージは、IGF1、PDGF、Cyr61、およびHB-EGFを含む成長因子の堅牢なレベルを発現する。CCR2+マクロファージは、IL-1b、IL-6、CCL-2、CCL-7、およびTNF-aなどの炎症を促進するケモカインおよびサイトカインに富む。刺激されたCCR2+マクロファージは、培養中の炎症性サイトカインインターロイキン-1β(IL-1β)の著しく高いレベルを分泌する。これらのサブセットが、心損傷の文脈における組織修復および左心室(LV)改造にどのように寄与するかを、依然として活発な研究の領域である。
マウスおよびヒト心臓におけるマクロファージ不均一性のフローサイトメトリーベースの分析では、心臓組織を消化し、単一細胞懸濁液を生成し、続いてバルクRNAシーケンシング/単一細胞RNAシーケンシングや機能アッセイのための細胞の培養などのさらなる下流プロセスのためのフローサイトメトリック分析または細胞選別を生成する必要があります。マウスの心臓から単一の細胞懸濁液を作るための元のプロトコルは、最初にナレンドルフらのナレンドルフグループによって報告されました 200710.私たちの研究室は、ヒト心筋からマクロファージを抽出するためにプロトコルを適応させ、改変しました。同じプロトコルを使用するが、染色およびゲーティングスキームにわずかな変更を加えて、ヒト心筋からの間質細胞のCD45も収穫することができる。ここで提示される、テキストおよびビデオにおいて、ヒト心筋からのマクロファージまたは間質の抽出のために日常的に行われるプロトコルである。
心臓組織標本は、拡張型心筋症(DCM:特発性または家族性)または虚血性心筋症(ICM)を受けた左心室補助装置(LVAD)移植または心臓移植を有する成人患者から得られる。励起された心臓またはLVADコアは、消化手順を開始する前に冷たい生理食リンで血管内に浸透する。瘢痕化または脂肪組織浸潤の程度の観点から決定される組織標本の「品質」は、マクロファージの収率に大きく影響を与えることができることに注意することが重要です。瘢痕の広い領域を有する心臓標本は、はるかに低い細胞収率を有し、所望の下流の分析方法がインビトロ細胞培養を必要とする場合に深刻な技術的制限を提起することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conocal Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-828-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH 8</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Deactivating Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63042-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase type 1-s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens

マクロファージは、心臓の中で最も異種で豊富な免疫細胞集団を表し、心損傷後の炎症および修復応答を駆動する中心的存在である。マクロファージの様々なサブセットが心損傷後の免疫応答をどのように調整するかについては、研究の活発な領域である。ここで提示されるのは、健康で病気の個体から得られたマウスおよびヒト心筋標本からのマクロファージの抽出のために、私たちの研究室が日常的に行う簡単なプロトコルです。簡単に言えば、このプロトコルは、単一細胞懸濁液を生成するために心臓組織の酵素消化を伴い、続いて抗体染色、およびフローサイトメトリーを生成する。この技術は、並べ替えられた細胞に対して行われる機能アッセイ、バルクおよび単一細胞RNAシーケンシングに適しています。このプロトコルの主な利点は、そのシンプルさ、日々の変動を最小限に抑え、広い適用性を備えており、さまざまなマウスモデルおよびヒト疾患エンティティにわたるマクロファージの不均一性を調査することができます。

記載されたプロトコルは、マウスおよびヒト心筋からのマクロファージの分離を可能にする。同じプロトコルを使用して、異なる染色およびゲーティング戦略を有するが、間質細胞はまた、ヒト心筋から収穫することができる。ここで提示されたFACSの結果は、BD LSRIIまたはBD FACS ARIA IIIプラットフォームのいずれかで取得されました。補償制御は、染色された脾細胞か...

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Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

ここで提示するプロトコルは、酵素消化を介して単一細胞懸濁液を調製することにより、マクロファージおよび他の非免疫細胞の様々なサブセットをヒトおよびマウスの心筋から単離するプロトコルである。単離されたマクロファージのフローサイトメトリーベースの同定および特性評価のためのゲーティングスキームも提示される。

ヒトおよびマウスの心筋標本からのマクロファージサブセットおよび間質細胞の分離

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

心臓には、心臓の炎症や修復において重要な役割を果たす免疫細胞の異種集団が含まれています。免疫細胞の異質性を理解し、その機能に関するさらなる洞察を得るためには、これらの細胞を心臓から回復させる方法を持つことは重要です。この技術は、健康または病気の心臓に存在する免疫および非免疫細胞の多様性を明らかにするのに役立ちます。この手法には、主に 3 つの利点があります。第1に、それは3時間以内に様々な細胞タイプの単一細胞の中断の生成につながる単純な単一のワークフローです。第二に、それは生存可能な免疫および非免疫細胞集団の高い回復をもたらす。そして第三に、それは非常に汎用性の高い方法であり、同様に他の種の心臓組織に適用することができます。単一の消化反応に使用される組織の量に注意を払うことが重要です。滅菌はさみ、冷たい生理学またはHBSSで左心室の補助または側壁から組織標本を解剖する。慎重に標本から外心脂肪と脊索体テンディネエを解剖します。滅菌刃またははさみの助けを借りて、約200ミリグラムの重さの部分に組織の塊を解剖する。マウスを安楽死させた後、鋭いはさみの助けを借りて胸腔を開きます。鈍い止止めを使って心臓を上に持ち上げます。5ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針を使用して、冷たいPBSで心臓を浸透します。心臓が色でブランチ表示されるまで浸透します。心臓を取り除き、氷の上の無菌ペトリ皿に入れます。無菌ペトリ皿にヒト心臓組織の塊またはネズミの心臓の200ミリグラムを置きます。滅菌刃またははさみを使用して組織を細かくミンチします。消化を設定するには、15ミリリットルの円錐管で、すべてのヒト心臓組織チャンクまたは酵素コラゲナーゼI、DNase I、およびヒアルロニダーゼを1ミリリットル当たり450、60、60単位の濃度で1つのマウス心臓ごとに3ミリリットルの最終的な消化量を調製する。チューブに2.5ミリリットルのDMEMを加えます。きれいな鉗子の助けを借りて、細かく刻んだティッシュを各反応管に入れる。穏やかな渦によってよく混ぜます。振動インキュベーターで摂氏37度で1時間消化し、低い攪拌速度から中程度の攪拌速度に設定します。1時間の消化の後、インキュベーターからチューブを取り出し、氷の上に置きます。上に40ミクロンの細胞ストレーナーと50ミリリットルの円錐チューブを設定します。酵素を失活させるバッファーの 2 ミリリットルでフィルターを湿水.次に、各消化管に8ミリリットルの酵素不活性化バッファーを添加することにより、消化酵素を非活性化する。その後、得られた13ミリリットルの全混合物を40ミクロンの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に注ぎます。濾過サンプルを新鮮な15ミリリットルの円錐管に戻します。400回gでサンプルを摂氏4度で6分間回転させます。0.5ミリリットルのメディアを残して上澄み物を捨てます。穏やかなピペットによって細胞ペレットを再懸濁し、ACKのライシスバッファーの1ミリリットルを追加します。穏やかにチューブを旋回し、赤血球のリシスを行うために5分間室温でインキュベートします。ACKバッファーで5分後、サンプルに9ミリリットルのDMEMを加えます。蓋をチューブに戻し、チューブをそっと反転して混ぜます。40ミクロンの細胞ストレーナーを通してフィルターし、15ミリリットルの円錐管の濾液を集める。チューブを400回gで6分間遠心し、上清を捨てます。FACSバッファーを1ミリリットル加え、ペレットを再懸濁します。その後、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。5分間400回gで再び遠心分離機。上清を捨て、100マイクロリットルのFACSバッファーにペレットを再懸濁します。単一細胞懸濁液は抗体染色の準備が整いました。典型的なヒト抗体パネルを1~50希釈で心臓サンプルに追加します。間質細胞とマウス心臓マクロファージに対して異なる抗体を使用してください。暗闇の中で摂氏4度で30~40分間インキュベートします。FACSバッファーの1ミリリットルを追加し、穏やかに渦と遠心分離機を400倍gで5分間追加します。この洗浄手順をもう一度繰り返します。その後、サンプルを350マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁し、DAPIを加えて1マイクロモルの最終濃度に達します。サンプルは FACS 分析の準備が整いました。このプロトコルでは、マウスとヒト心筋からのマクロファージの分離が達成された。この図は、未処理で処理された人間の LVAD コアを示しています。ヒト虚血性心筋症のCD45陰性間質細胞に対するヒト心筋からのCCR2陰性およびCCR2陽性ヒトマクロファージのフロー選別に関する格子化スキームが提示された。ライト染色されたFACSの画像は、CD45陽性およびCD45陰性細胞を選別し、生存率を示す無傷の細胞膜を示す。マウスの心臓からマクロファージをソートする格言スキームも成功しました。酵素反応に使用される組織の重量は、効率的な消化のために重要です。プロトコルで示された酵素濃度の組織の200ミリグラム以下を使用してください。この方法に従って、細胞は、インビトロ刺激アッセイのために培養することができる。細胞はバルクRNAシーケンシングまたは単一細胞シーケンシングのためにソートすることができる。この方法は、健康または罹患したヒトの心臓に存在する、これまで認識されていなかったマクロファージの異種性を発見する上で非常に貴重な技術として役立った。この方法に続いて単一細胞シーケンシングを使用して、様々な免疫細胞および非免疫細胞が病気の心臓と健康な心臓とどのように異なるかを明らかにする研究が進行中です。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

マウス腹腔細胞の分離

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

ネズミリンパ節間質細胞の単離

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...