Name: isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens at JoVE.com

Этот проект стал возможным благодаря финансированию, предоставленному Детским институтом открытий Вашингтонского университета и Детской больницей Сент-Луиса (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Фондом Барнс-Еврейской больницы (8038-88) и NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. поддерживается NIH K08 HL123519 и Берроуз Добро пожаловать фонда (1014782).

Представленный протокол был одобрен Вашингтонским университетом в Сент-Луисе (#201305086). Все испытуемые предоставляют информированное согласие перед сбором проб, и эксперименты проводятся в соответствии с утвержденным протоколом исследования. Представленный протокол выполняется с одо...

<ol>
	<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart.">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction.">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction.">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li></ol>

Протокол позволяет извлечения различных подмножеств макрофагов из миокарда человека. Протокол прост и занимает от 3 до 4 часов, чтобы подготовить одноклеточную подвеску, готовую к анализу FACS. Хотя протокол относительно прост в исполнении, есть определенные технические аспекты, которые...

Макрофаги представляют собой наиболее распространенный тип иммунных клеток в сердце, и они играют важную роль в генерации надежных воспалительных и репаративных реакций после сердечной травмы1,2,3,4. Ранее наша группа определила два основных подмножества макрофагов в сердце мурина, полученных из различных происхождения развития5,6. В целом, различные популяции тканей резидентов сердечных макрофагов подмножества могут быть определены на основе экспрессии поверхности клетки CCR2 (C-C мотив хемокин рецептор 2). CCR2- макрофаги (выражение поверхности клетки: CCR2-MHCIIнизкий и CCR2-MHCIIhigh) имеют эмбриональное происхождение (примитивные и эритромиелоидные линии), способные к самообновлению и представляют доминирующую популяцию в гомеостатичных условиях. Резидент CCR2и макрофаги имеют окончательное гематопоиетическое происхождение, поддерживаются путем набора из циркулирующих моноцитов, и представляют незначительную популяцию в гомеостатических условиях. Функционально, CCR2- макрофаги генерировать минимальное воспаление и имеют решающее значение для коронарного развития неонатальной регенерации сердца5,7. В отличие от этого, CCR2и макрофаги инициировать надежные воспалительные реакции после сердечных оскорблений и способствовать залога травмы кардиомиоцитов, неблагоприятное ремоделирование левого желудочка, и сердечная недостаточность прогрессии8,9.
Недавно мы показали, что миокард человека также содержит два различных подмножества макрофагов, идентифицированных аналогичным образом как CCR2- или CCR2No8. Экспрессия генов и функциональный анализ показали, что макрофаги CCR2человека и CCR2 представляют функционально расходящиеся подмножества и функционально аналогичны CCR2- имакрофагам CCR2, найденным в сердце мыши. Человеческий CCR2- макрофаги выражают устойчивые уровни факторов роста, включая IGF1, PDGF, Cyr61 и HB-EGF. Макрофаги CCR2и обогащаются в химокинах и цитокинах, которые способствуют воспалению, таким как IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 и TNF-a. Стимулированные CCR2- макрофаги выделяют заметно более высокие уровни воспалительного цитокина интерлейкина-1 " (IL-1") в культуре. Как эти подмножества дифференарно способствуют восстановлению тканей и ремоделирования левого желудочка (LV) в контексте сердечной травмы остается областью активных исследований.
Поток-цитометрия на основе анализа макрофаг неоднородности в мыши и человеческого сердца требует переваривания сердечной ткани и генерации одной клеточной подвески с последующим циклометрическим анализом потока или сортировкой клеток для дальнейших процессов вниз по течению, таких как массовое секвенирование РНК/одноклеточная РНК секвенирования или культивирование клеток для функциональной анализа. Первоначальный протокол для принятия одной ячейки подвески из сердца murine были впервые сообщили nahrendorf группы в Nahrendorf и др. 200710. Наша лаборатория адаптировала и модифицировала протокол для извлечения макрофагов из миокарда человека. Используя тот же протокол, но с небольшимизменением в схеме окрашивания и gating, CD45- стромальные клетки из миокарда человека также могут быть собраны. Представленный здесь, в тексте и видео, протокол, который выполняется регулярно для извлечения макрофагов или стромальный из человеческой миокарда.
Образцы сердечной ткани получают сяритогецы у взрослых пациентов с расширенной кардиомиопатией (DCM: идиопатической или семейной) или ишемической кардиомиопатией (ИКМ), проходящими левожелудочковой вспомогательной помощью (LVAD) имплантации или трансплантации сердца. Выслаженные сердца или сердечники LVAD внутриваскулярно пронизаны холодным сольнием до начала процедуры пищеварения. Важно отметить, что «качество» образца ткани, определяемые с точки зрения степени образования рубцов или инфильтрации жировой ткани, может значительно повлиять на урожайность макрофагов. Образцы сердца с большими областями рубцов будут иметь гораздо более низкую урожайность клеток и могут представлять серьезные технические ограничения, когда желаемые методы анализа вниз по течению требуют культивирования клеток in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conocal Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-828-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH 8</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Deactivating Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63042-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase type 1-s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens

Макрофаги представляют собой наиболее неоднородные и обильные популяции иммунных клеток в сердце и занимают центральное место в воспалении и репаративных реакциях после сердечной травмы. Как различные подмножества макрофагов организовать иммунные реакции после сердечной травмы является активной областью исследований. Представлен простой протокол, который наша лаборатория выполняет регулярно, для извлечения макрофагов из мыши и человеческих образцов миокарда, полученных от здоровых и больных людей. Кратко, этот протокол включает в себя ферментативное пищеварение сердечной ткани для создания одной подвески клеток, а затем окрашивая антитела, и поток цитометрии. Этот метод подходит для функциональных анализов, выполняемых на отсортированных клетках, а также для секвенирования РНК навалом и одноклеточной РНК. Основным преимуществом этого протокола является его простота, минимальная повседневная вариация и широкая применимость, позволяющая исследует неоднородность макрофагов в различных моделях мыши и человеческих заболеваниях.

Описанный протокол позволяет отделять макрофаги от мыши и миокарда человека. Используя тот же протокол, но с другой стратегией окрашивания и гатинга, стромальные клетки также могут быть собраны из миокарда человека. Результаты FACS, представленные здесь, были приобрете...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens at JoVE.com

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Представлен протокол для изоляции различных подмножеств макрофагов и других неиммунных клеток от миокарда человека и мыши путем подготовки одной клеточной подвески через ферментативное пищеварение. Также представлены схемы идентификации цитометрии потока и характеристики изолированных макрофагов.

Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Сердце содержит неоднородную популяцию иммунных клеток, которые играют решающую роль в сердечном воспалении, а также в ремонте. Для того, чтобы понять неоднородность иммунных клеток и получить дальнейшее представление об их функции, важно иметь метод, который позволит для восстановления этих клеток из сердца. Этот метод может помочь раскрыть иммунной, а также неиммуне клеточного разнообразия, которое находится в здоровом или больном сердце.Есть три основных преимущества этой техники. Во-первых, это простой рабочий процесс, который приводит к генерации одноклеточной подвески различных типов клеток в течение трех часов времени. Во-вторых, это приводит к высокому восстановлению жизнеспособных иммунных и неиммунных популяций клеток.И в-третьих, это очень универсальный метод и может быть применен к тканям сердца в других видах, а также. Важно обращать внимание на количество тканей, используемых для одной реакции пищеварения. Используйте стерильные ножницы, рассекаете образец ткани из апической или боковой стенки левого желудочка в холодном солевом растворе или HBSS.Тщательно вскрыть эпикардиальный жир и chordae tendineae из образца. С помощью стерильного лезвия или ножниц, вскрыть куски ткани на куски весом около 200 миллиграммов. После усыпания мыши откройте грудную полость с помощью острых ножниц.Используйте тупые гемостаты, чтобы поднять сердце вверх. Perfuse сердце с холодным PBS с помощью 25 калибровочных иглы прилагается к пяти миллилитров шприц. Пронизыть, пока сердце не появится бланшированный цвет.Удалите сердце и поместите его в стерильную чашку Петри на льду. Поместите 200 миллиграммов кусков сердечной ткани человека или муринового сердца в стерильную чашку Петри. Мелко фарш ткани с помощью стерильного лезвия или ножницы.Чтобы настроить пищеварения, в 15 миллилитров конической трубки, подготовить окончательный объем пищеварения в три миллилитров для каждого человека сердечной ткани кусок или один мурин сердце с ферментами коллагеназы I, DNase I, и гиалуронидазы в концентрациях 450, 60 и 60 единиц на миллилитр. Добавьте в трубку 2,5 миллилитров DMEM. С помощью чистых типсов поместите мелко рубленую ткань в каждую реакционной трубку.Хорошо перемешать нежным вихрем. Дайджест в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию в трясущимся инкубаторе установлен на низкой и средней скорости возбуждения. После одного часа пищеварения вывихни трубки из инкубатора и поместите на лед.Установите 50 миллилитров конических трубок с 40 микрон-клеточный ситечко на вершине. Влажные фильтры с двумя миллилитров фермента деактивации буфера. Затем деактивировать ферменты пищеварения, добавив восемь миллилитров фермента деактивации буфера для каждой трубки пищеварения.Затем залить в результате 13 миллилитров общей смеси через 40 микрон клеток ситечко в 50 миллилитров конических труб. Перенесите отфильтрованные образцы обратно в свежие 15 миллилитровых конических трубок. Спин образцов на 400 раз g в течение шести минут при четырех градусах по Цельсию.Откажитесь от супернатанта, оставляя 0,5 миллилитров мультимедиа. Resuspend гранулы клетки нежным pipetting и добавить один миллилитр буфера лиза ACK. Нежный вихрь трубки и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут для выполнения лиза красных кровяных телец.После пяти минут в буфере ACK добавьте в образец девять миллилитров DMEM. Положите крышку обратно на трубы и осторожно инвертировать трубки для смешивания. Фильтр через 40 микрон клеток ситечко и собирать фильтрат в 15 миллилитров конических труб.Центрифуга труб на 400 раз г в течение шести минут и отказаться от супернатанта. Добавьте один миллилитр буфера FACS и перерасходуйте гранулы. Затем перенесите его в 1,5 миллилитр микроцентрифуг трубки.Центрифуга снова при 400 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы в 100 микролитров буфера FACS. Одноклеточная подвеска теперь готова к окрашивания антител.Добавьте типичную человеческую панель антител к образцам сердца при разбавлении от одного до 50. Используйте различные антитела для стромальных клеток и макрофагов сердца мурина. Инкубировать в течение 30 до 40 минут при четырех градусах по Цельсию в темноте.Добавьте один миллилитр буфера FACS, аккуратно вихрь и центрифугу при 400 раз г в течение пяти минут. Повторите этот шаг стирки во второй раз. Затем повторно посовещение образца в 350 микролитров буфера FACS и добавить DAPI для достижения окончательной концентрации одного микромолара.В настоящее время образцы готовы к анализу FACS. В этом протоколе была достигнута изоляция макрофагов от мыши и миокарда человека. На этом рисунке показано необработанного и обработанного ядра LVAD человека.Была представлена схема сортировки потока отрицательных и CCR2 положительных человеческих макрофагов из миокарда человека, а также для CD45 отрицательных стромальных клеток из ишемической кардиомиопатии человека. Изображения Райт окрашенных FACS отсортированы CD45 положительные и CD45 отрицательные клетки показывают нетронутыми клеточной мембраны, указывающие на жизнеспособность. Схема вымывания макрофагов из сердца мыши также была успешной.Вес ткани, используемой для энзиматической реакции, имеет решающее значение для эффективного пищеварения. Используйте не более 200 миллиграммов ткани для концентрации ферментов, указанных в протоколе. Следуя этому методу, клетки могут быть выуфсяты для анализа стимуляции in vitro.Клетки могут быть отсортированы для массового секвенирования РНК или секвенирования одной ячейки. Этот метод послужил бесценным методом в открытии ранее непризнанной неоднородности макрофагов, которая присутствует в здоровом или больном человеческом сердце. Используя этот метод с последующим одноклеточным секвенированием, проводятся исследования, чтобы выяснить, как различные иммунные и неиммунические клетки варьируются от больного сердца по сравнению со здоровым сердцем.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Выделение мышью перитонеальных клеток полости

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Выделение мышиные клетки легких Дендритные

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Выделение предшественника В-клеточных подмножеств из пуповинной крови

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Выделение Мышиный лимфатических узлов стромальных клеток

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...