Name: isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens at JoVE.com

Este proyecto fue posible gracias a la financiación del Children's Discovery Institute de la Universidad de Washington y del St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), la Fundación del Hospital Judío Barnes (8038-88) y la NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. cuenta con el apoyo de NIH K08 HL123519 y Burroughs Welcome Fund (1014782).

El protocolo presentado ha sido aprobado por la Universidad de Washington en st. Louis Institutional Review Board (#201305086). Todos los sujetos proporcionan consentimiento informado antes de la recolección de muestras y los experimentos se realizan de acuerdo con el protocolo de estudio aprobado. El protocolo presentado se realiza con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y sigue las pautas descritas en la Guía de los NIH para e...

<ol>
	<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart.">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction.">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li><li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration.">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation.">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li><li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions.">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li><li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction.">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li></ol>

El protocolo permite la extracción de varios subconjuntos de macrófagos del miocardio humano. El protocolo es simple y tarda de 3 a 4 horas en preparar la suspensión de una sola célula lista para el análisis facS. Aunque el protocolo es relativamente fácil de realizar, hay ciertos aspectos técnicos que deben ser considerados que minimizarán la variabilidad. En primer lugar, trabajar de manera oportuna con tejido humano es necesario para una óptima viabilidad celular. Es importante mantener el tejido en salina fr...

Los macrófagos representan el tipo de células inmunitarias más abundante en el corazón, y desempeñan un papel importante en la generación de respuestas inflamatorias y reparativas robustas después de una lesión cardíaca1,2,3,4. Anteriormente, nuestro grupo identificaba dos subconjuntos principales de macrófagos en el corazón murino derivados de orígenes de desarrollo distintos5,6. En términos generales, se pueden identificar poblaciones distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes en tejidos en función de la expresión de la superficie celular de CCR2 (receptor de quimioquina con motivo C-C 2). CCR2- los macrófagos (expresión de la superficie celular: CCR2-MHCIIlow y CCR2-MHCIIhigh)son de origen embrionario (linajes primitivos y eritromieloides), capaces de autorenovarse y representar a una población dominante en condiciones homeostáticas. Los macrófagos residentes CCR2+ son de origen hematopoyético definitivo, se mantienen a través del reclutamiento de monocitos circulantes y representan a una población menor en condiciones homeostáticas. Funcionalmente, CCR2- los macrófagos generan una inflamación mínima y son críticos para el desarrollo coronario de regeneración cardíaca neonatal5,7. Por el contrario, CCR2+ macrófagos inician respuestas inflamatorias robustas después de insultos cardíacos y contribuyen a la lesión colateral de cardiomiocitos, la remodelación adversa del ventrículo izquierdo, y la progresión de la insuficiencia cardíaca8,9.
Recientemente, hemos demostrado que el miocardio humano también contiene dos subconjuntos distintos de macrófagos identificados de manera similar como CCR2- o CCR2+8. La expresión génica y los análisis funcionales revelaron que los macrófagos ccr2humanos - y CCR2+ representan subconjuntos funcionalmente divergentes y son funcionalmente análogos a CCR2- y los macrófagos CCR2+ que se encuentran en el corazón del ratón. CCR2 humano- los macrófagos expresan niveles robustos de factores de crecimiento, incluyendo IGF1, PDGF, Cyr61, y HB-EGF. CCR2+ macrófagos se enriquecen en quimioquinas y citoquinas que promueven la inflamación, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7, y TNF-a. Los macrófagos estimulados CCR2+ macrófagos secretan niveles notablemente más altos de la interleucina de citoquina inflamatoria-1o (IL-1o) en cultivo. La forma en que estos subconjuntos contribuyen diferencialmente a la reparación de tejidos y a la remodelación del ventular izquierdo (LV) en el contexto de una lesión cardíaca sigue siendo un área de investigación activa.
El análisis basado en citometría de flujo de la heterogeneidad de macrófagos en el ratón y el corazón humano requiere digerir el tejido cardíaco y generar una suspensión de una sola célula seguida de un análisis citométrico de flujo o clasificación celular para otros procesos aguas abajo, como la secuenciación masiva de ARN/secuenciación de ARN de una sola célula o el cultivo de las células para ensayos funcionales. El protocolo original para hacer una suspensión de una sola célula de corazones murinos fue reportado por primera vez por el grupo Nahrendorf en Nahrendorf et al. 200710. Nuestro laboratorio ha adaptado y modificado el protocolo para extraer macrófagos del miocardio humano. Usando el mismo protocolo pero con ligera modificación en el esquema de tinción y gating, CD45- células estromales del miocardio humano también se pueden cosechar. Aquí se presenta, en texto y vídeo, un protocolo que se realiza rutinariamente para la extracción de macrófagos o estromatos del miocardio humano.
Las muestras de tejido cardíaco se obtienen de pacientes adultos con cardiomiopatía dilatada (DCM: idiopática o familiar) o cardiomiopatía isquémica (MIC) sometidos a implantación de dispositivode asistencia ventricular izquierda (LVAD) o trasplante cardíaco. Los corazones explantados o los núcleos LVAD se perfunden intravascularmente con salina fría antes de iniciar el procedimiento de digestión. Es importante tener en cuenta que la "calidad" de la muestra de tejido determinada en términos de grado de cicatrización o infiltración de tejido adiposo puede afectar en gran medida el rendimiento de los macrófagos. Los especímenes cardíacos con grandes áreas de cicatrización tendrán un rendimiento celular mucho menor y pueden plantear una limitación técnica grave cuando los métodos de análisis aguas abajo deseados requieren el cultivo celular in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Conocal Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-828-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>62251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH 8</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Deactivating Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63042-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase type 1-s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>172931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens

Los macrófagos representan las poblaciones de células inmunitarias más heterogéneas y abundantes del corazón y son fundamentales para impulsar la inflamación y las respuestas reparadoras después de una lesión cardíaca. Cómo varios subconjuntos de macrófagos orquestan las respuestas inmunitarias después de una lesión cardíaca es un área activa de investigación. Aquí se presenta un protocolo simple que nuestro laboratorio realiza de forma rutinaria, para la extracción de macrófagos de muestras de ratón y miocardio humano obtenidas de individuos sanos y enfermos. Brevemente, este protocolo implica la digestión enzimática del tejido cardíaco para generar una suspensión de una sola célula, seguida de la tinción de anticuerpos, y la citometría de flujo. Esta técnica es adecuada para ensayos funcionales realizados en células clasificadas, así como secuenciación de ARN a granel y de una sola célula. Una de las principales ventajas de este protocolo es su simplicidad, mínima variación diaria y amplia aplicabilidad que permite investigar la heterogeneidad de los macrófagos en varios modelos de ratón y entidades de enfermedades humanas.

El protocolo descrito permite el aislamiento de macrófagos del ratón y el miocardio humano. Usando el mismo protocolo, pero con una estrategia diferente de tinción y gating, las células estromales también se pueden cosechar del miocardio humano. Los resultados de FACS presentados aquí se adquirieron en la plataforma BD LSRII o BD FACS ARIA III. Se generaron controles de compensación a partir de muestras de control de color único a partir de splenocitos manchados. <strong class="xf...

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Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Aquí se presenta un protocolo para aislar varios subconjuntos de macrófagos y otras células no inmunes del miocardio humano y de ratón mediante la preparación de una suspensión de una sola célula a través de la digestión enzimática. También se presentan esquemas de gating para la identificación basada en citometría de flujo y la caracterización de macrófagos aislados.

Aislamiento de subconjuntos de macrófagos y células estromas de especímenes miocárgonos humanos y de ratón

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

El corazón contiene población heterogénea de células inmunitarias que desempeñan un papel crucial en la inflamación cardíaca, así como la reparación. Con el fin de entender la heterogeneidad de las células inmunitarias y obtener más información sobre su función, es importante tener un método que permita la recuperación de estas células del corazón. Esta técnica puede ayudar a descubrir la diversidad celular inmune, así como no no inmune que reside en el corazón sano o enfermo.Esta técnica tiene tres ventajas principales. En primer lugar, es un flujo de trabajo único simple que conduce a la generación de suspensión de una sola celda de varios tipos de celdas dentro de las tres horas de tiempo. En segundo lugar, conduce a una alta recuperación de poblaciones de células inmunes y no no inmúnticas viables.Y en tercer lugar, es un método muy versátil y se puede aplicar a los tejidos del corazón en otras especies también. Prestar atención a la cantidad de tejido utilizado para una sola reacción de digestión es importante. Utilice tijeras estériles, diseccione la muestra de tejido de la pared apical o lateral del ventrículo izquierdo en solución salina fría o HBSS.Diseccionar cuidadosamente la grasa epicardial y las tendineas cordae del espécimen. Con la ayuda de una cuchilla estéril o tijeras, disecciona los trozos de tejido en trozos que pesen aproximadamente 200 miligramos. Después de eutanasiar el ratón, abra la cavidad torácica con la ayuda de tijeras afiladas.Usa hemostats contundentes para elevar el corazón hacia arriba. Perfuque el corazón con PBS frío utilizando una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de cinco mililitros. Perfuse hasta que el corazón aparezca blanqueado en color.Retire el corazón y colóquelo en un plato estéril de Petri sobre hielo. Coloque 200 miligramos de trozos de tejido cardíaco humano o corazón murino en una placa estéril de Petri. Picar finamente el tejido usando una cuchilla estéril o tijeras.Para establecer digestiones, en un tubo cónico de 15 mililitros, prepare un volumen de digestión final de tres mililitros para cada trozo de tejido cardíaco humano o un corazón murino con enzimas colagenasa I, DNase I e hialuronidasa a concentraciones de 450, 60 y 60 unidades por mililitro. Añadir 2,5 mililitros de DMEM en el tubo. Con la ayuda de fórceps limpios, coloque el tejido finamente picado en cada tubo de reacción.Mezclar bien por vórtices suaves. Digerir durante una hora a 37 grados centígrados en una incubadora de temblores a una velocidad de agitación baja a media. Después de una hora de digestión, saque los tubos de la incubadora y colóquelos en hielo.Configure tubos cónicos de 50 mililitros con un colador celular de 40 micras en la parte superior. Humedezca los filtros con dos mililitros de tampón de desactivación de enzimas. A continuación, desactive las enzimas de digestión añadiendo ocho mililitros de tampón de desactivación de enzimas a cada tubo de digestión.A continuación, vierta los 13 mililitros resultantes de la mezcla total a través del colador celular de 40 micras en los tubos cónicos de 50 mililitros. Transfiera las muestras filtradas en tubos cónicos frescos de 15 mililitros. Girar las muestras a 400 veces g durante seis minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante dejando 0,5 mililitros de medios. Resuspender el pellet celular por pipeteo suave y añadir un mililitro de tólomo de lelisis ACK. Suave girar el tubo e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos para realizar la lelisis de glóbulos rojos.Después de cinco minutos en el búfer ACK, agregue nueve mililitros de DMEM a la muestra. Vuelva a colocar la tapa en los tubos e invierta suavemente los tubos para mezclar. Filtrar a través de un colador celular de 40 micras y recoger el filtrado en tubos cónicos de 15 mililitros.Centrifugar los tubos a 400 g durante seis minutos y deseche el sobrenadante. Añadir un mililitro de tampón FACS y resuspend el pellet. A continuación, transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Centrifugar de nuevo a 400 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 microlitros de tampón FACS. Una suspensión de una sola célula ya está lista para la tinción de anticuerpos.Agregue un panel de anticuerpos humanos típico a las muestras del corazón de una a 50 dilución. Utilice diferentes anticuerpos para las células estromales y los macrófagos cardíacos murinos. Incubar durante 30 a 40 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Añadir un mililitro de tampón FACS, vórtice suave y centrífuga a 400 veces g durante cinco minutos. Repita este paso de lavado una segunda vez. A continuación, resuspender la muestra en 350 microlitros de tampón FACS y añadir DAPI para alcanzar una concentración final de un micromolar.Las muestras ya están listas para el análisis FACS. En este protocolo, se logró el aislamiento de macrófagos del ratón y del miocardio humano. Esta figura muestra el núcleo LVAD humano no procesado y procesado.Se presentó el esquema de medición para la clasificación de flujo de macrófagos humanos CCR2 negativos y CCR2 positivos del miocardio humano, así como para células estromales negativas CD45 de cardiomiopatía isquémica humana. Las imágenes de las células CD45 positivas y CD45 teñidas de Wright muestran una membrana celular intacta que indica viabilidad. El esquema de gating para ordenar los macrófagos de un corazón de ratón también tuvo éxito.El peso del tejido utilizado para la reacción enzimática es fundamental para una digestión eficiente. No utilice más de 200 miligramos de tejido para las concentraciones enzimáticas indicadas en el protocolo. Después de este método, las células se pueden cultivar para ensayos de estimulación in vitro.Las células se pueden ordenar para la secuenciación de ARN a granel o la secuenciación de una sola célula. Este método ha servido como una técnica invaluable en el descubrimiento de la heterogeneidad de macrófagos previamente no reconocidos que está presente en el corazón humano sano o enfermo. Usando este método seguido de secuenciación de una sola célula, se están llevando a cabo estudios para descubrir cómo varias células inmunes y no no no- no+ nulas varían desde el corazón enfermo en comparación con el corazón sano.

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