Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات NS096833 (CAM).

1. إعداد حلول الأسهم والكواشف
<ol><li>إعداد dithiothreitol (DTT) حل الأسهم عن طريق حل DTT البلورية في الماء المقطر إلى تركيز نهائي من 1000 mM. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد حل مخزون ATP عن طريق حل ATP البلورية في الماء المقطر إلى تركيز نهائي من 100 MM. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
تحسين تخطيط لوحة عن طريق تشغيل عدة لوحات مع السيطرة السلبية فقط (رد فعل ATPase مع عدم وجود مثبط). فحص النتائج بعناية لأنماط في معدلات رد الفعل. على سبيل المثال، قد تنشأ هذه من آثار الحافة و / أو العيوب في طلاء سطح الماء من لوحات "غير ملزمة". إ?...

Myosins هي محولات الطاقة الميكانوكيميائية التي تحلل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) لتوليد حركة الاتجاه على طول خيوط الهيكل السيتولي أكتين في eukaryotes1,2. لديهم على حد سواء هيكليا وحركيا تتكيف مع وظائفها داخل الخلايا المختلفة، مثل نقل العضيات، وتقلص العضلات أو توليد التوتر الخلوي الهيكلي1،2. يتم تمثيل عائلة الموسين الخارقة من قبل ~ 40 جينات الموسين التي تنتمي إلى ~ 12 فئات myosin متميزة في الجينوم البشري3،4. أعضاء من فصول myosin تلعب أدوارمختلفة في مجموعة متنوعة للغاية من الاضطرابات, مثل العديد من السرطانات, الاضطرابات العصبية, اعتلال العضلات والهيكل العظمي, واعتلال عضلة القلب الضخامي5,6. وبالنظر إلى العدد الكبير من الوظائف الفسيولوجية والمرضية لهذه المحركات الجزيئية، فإنه ليس من المستغرب أنها أصبحت معترف بها بشكل متزايد كأهداف المخدرات لمجموعة متنوعة من الظروف7. وقد أحرز تقدم كبير مؤخرا في اكتشاف مثبطات الموسين الجديدة8و9و10 والمنشطات11، وتحسين خصائص الموجودةمنها 12، 13 , 14 سنة , 15.
وقد استخدمت منذ فترة طويلة نيكوتيناميد أدينين الدينوكليوتيد (NADH) المقترنة ATPase فحص لقياس نشاط ATPase من الإنزيمات المختلفة، مثل الريسكوبلازمية الشبكية Ca2 + مضخة ATPase16، وإصلاح الحمض النووي ATPase Rad5417، وAAA + ATPase p9718 أو ميكروتوبول الحركية kinesin19. يستخدم هذا التساي دورة تجديد ATP. يتم تجديد أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) التي تم إنشاؤها بواسطة ATPase إلى ATP بواسطة بينوفات كيناز (PK)، الذي يحول جزيء واحد من فوسفونولبيروفات (PEP) إلى بيروفات في نفس الوقت. في وقت لاحق، يتم تقليل البيروفات إلى اللاكتات عن طريق اللاكتات dehydrogenase (LDH). وهذا، بدوره، يُخأكّد جزيء واحد من NADH إلى NAD. ولذلك، فإن الانخفاض في تركيز NADH كدالة للوقت يساوي معدل التحلل المائي ATP. دورة تجديد ATP تحافظ على تركيز ATP ثابت تقريبا وتركيز ADP منخفضة طالما PEP متاح. وهذا يؤدي إلى دورات زمنية خطية، مما يجعل من السهل تحديد معدلات التفاعل الأولية ويساعد على تجنب تثبيط المنتج من قبل ADP19. على الرغم من أن اختبار ATPase المقترنة بNADH قد تم تكييفها بالفعل مع شكل 96-well20، فإن أحجام التفاعل العالية (~ 150 ميكرولتر) تجعلها مكلفة نسبيا بسبب ارتفاع الطلب على الكواشف، مما يجعلها أقل قابلية للفحص السريع لأعداد كبيرة من المركبات. الأساليب البديلة، مثل الفحص الأخضر المالاشيت19،21،الذي يعتمد على الكشف عن الفوسفات الذي ينتجه إنزيم ATPase، ثبت أنها أكثر ملاءمة للتصغير والفحص عالي الإنتاجية22 , 23 , 24- ومع ذلك، من المرجح أن يتأثر الاختبار بنقطة النهاية بعدة قطع أثرية (ترد مناقشتها أدناه)، والتي قد تظل غير مكتشفة في غياب دورات دراسية بدوام كامل.
هنا، تم تحسين فحص ATPase المقترن بNADH لفحص الإنتاجية شبه العالية لمثبطات الجزيئات الصغيرة. الهيكل العظمي وعضلة القلب myosin الثاني ومثبطات myosin blebbistatin8, الفقرة أمينوبلبستاتين13 وpara-nitroblebbistatin 12 تستخدم لإثبات قوة من فحص, الذي يعتمد على NADH الفلورة كقراءة. هذا البروتوكول قابل لفحص المشاريع التي تركز على أي إنزيمات منتجة من شرطة أبوظبي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

تستخدم إنزيمات ATPase الطاقة الحرة المخزنة في الأدينوسين ثلاثي الفوسفات لتحفيز مجموعة واسعة من العمليات الكيميائية الحيوية الإنجرغوية في الجسم الحي التي لن تحدث تلقائيًا. هذه البروتينات هي حاسمة أساسا لجميع جوانب الحياة الخلوية, بما في ذلك التمثيل الغذائي, انقسام الخلايا, الاستجابات للتغيرات البيئية والحركة. يصف البروتوكول المعروض هنا فحص ادرينالين أدينوكليوتيد (NADH) المقترن بـ ATPase الذي تم تكييفه مع فحص الإنتاجية شبه العالية لمثبطات ATPase جزيء صغير. وقد تم تطبيق هذا القول على عضلة القلب والهيكل العظمي myosin الثاني، وهما المحرك الجزيئي القائم على الأكتين ATPases، كدليل على المبدأ. ويقترن التحلل المائي من ATP إلى أكسدة NADH عن طريق ردود الفعل الأنزيمية في التبيّاع. أولاً، يتم تجديد ADP التي تم إنشاؤها بواسطة ATPase إلى ATP بواسطة بييوروفات كيناز (PK). PK يحفز الانتقال من فوسفونولبيروفات (PEP) إلى بيروفات في نفس الوقت. في وقت لاحق، يتم تقليل بيروفات إلى اللاكتات عن طريق اللاكتات dehydrogenase (LDH)، الذي يحفز أكسدة NADH في نفس الوقت. وبالتالي، يرتبط الانخفاض في تركيز ATP مباشرة بالانخفاض في تركيز NADH، الذي يتبعه تغيير في الفلورة الجوهرية لـ NADH. طالما PEP متاح في نظام رد الفعل، تركيز ADP لا يزال منخفضا جدا، وتجنب تثبيط إنزيم ATPase من قبل المنتج الخاص به. وعلاوة على ذلك، فإن تركيز ATP لا يزال ثابتا تقريبا، مما أسفر عن دورات زمنية خطية. ويتم رصد الفلورة باستمرار، مما يسمح بتقدير سهل لنوعية البيانات ويساعد على تصفية القطع الأثرية المحتملة (على سبيل المثال، الناشئة عن هطول الأمطار المركبأو التغيرات الحرارية).

تظهر خريطة تخطيط اللوحة النموذجية المستخدمة في تجارب الفرز في الشكل 1. يتم حجز الصفوف الأولى والأخيرة لمعايرة NADH والتحكم الإيجابي (20 ميكرومتر بارا-أمينوبلبِستياتين، 0.5٪ DMSO)، على التوالي. يتم استخدام الصفوف المتبقية (B إلى O) لاختبار النشاط المثبط للمر...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

وقد تم تكييف فحص أدينوكليوتيد أدينين (NADH) المقترنة ATPase لفحص الإنتاجية شبه العالية من مثبطات الموسين جزيء صغير. يتم تشغيل هذا التقييم الحركي في شكل لوحة دقيقة 384 جيدا مع أحجام التفاعل الكلي من 20 ميكرولتر فقط لكل بئر. يجب أن تكون المنصة قابلة للتطبيق على أي إنزيم منتج من ADP تقريبًا.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

ينطبق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من مشاريع الفحص التي تهدف إلى تطوير مثبطات ATPase ، إما كمسبارين للبحوث الأساسية أو للمركبات السريرية المحتملة. تم تحسين هذا الأسلوب لتطبيقات فحص نصف عالية الإنتاجية. كما تم تصميمه لتجنب العديد من القطع الأثرية الشائعة ولا يتطلب التعامل مع المواد الخطرة.في مختبرنا كنا نستخدم هذا الفحص لتطوير مثبطات جديدة ومحددة غير العضلات الميوسين الثاني لعلاج اضطراب تعاطي الميثامفيتامين. من الناحية النظرية، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على أي إنزيمات تنتج ATP. المرئية مظاهرة يساعد على توضيح جميع التفاصيل التقنية الهامة.للبدء، وإعداد 4، 500 ميكرولترات من 20 محلول أكتين المخفف microin microstyrene 384-well الأسود عن طريق تمييع حل المخزون actin المركزة في المخزن المؤقت actin. خلط الحل بدقة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 30 مرة لكسر خيوط actin للحد من اللزوجة وعدم التجانس. ثم الطرد المركزي الحل لإزالة أي البروتين المترسب الحاضر.نقل بعناية فائقة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. إعداد مزيج انزيم رئيسي في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر لكل لوحة مُقايسة من خلال الجمع بين 3، 252.9 ميكرولترات من العازلة الميوسين للميوزين للمقايسة التي تنطوي على عضلة الهيكل العظمى myosin II، 171.4 ميكرولترات من حل LDH، و 171.4 ميكرولترات من محلول PK. إعداد مزيج الركيزة الرئيسية في أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر لكل لوحة من خلال الجمع بين 162.1 ميكرولترات من ATP، 162.1 ميكرولترات من PEP، و 324.1 ميكرولترات من حل NADH.لا تضيف actin في هذه المرحلة لتجنب التجميع وهطول الأمطار. لإنشاء سبع خطوات التسلسلي واحد إلى اثنين من التخفيفات من NADH للمعايرة، وإعداد ثمانية أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر. مزيج 12.3 ميكرولترات من محلول الأسهم NADH مع 257.7 ميكرولترات من العازلة myosin في الأنبوب الأول لجعل حل 250 micromolar.ثم aliquot 135 ميكرولترات من العازلة myosin في كل من الأنابيب السبعة المتبقية. نقل 135 ميكرولترات من الحل من الأنبوب الأول إلى الثانية ومزيج عن طريق الأنابيب. كرر حتى تصل إلى أنبوب السابع.استخدام أنبوب آخر كما لا-NADH السيطرة مع المخزن المؤقت فقط. وتشمل دائما الضوابط الإيجابية والسلبية على لوحات المركب، والتخفيفات NADH للمعايرة على لوحات المقايسة. عناصر التحكم هذه مهمة للغاية لتحديد النتائج أثناء تحليل البيانات.باستخدام ماصة ذات ثماني قنوات، قم بنقل 20 ميكرولترات من حلول معايرة NADH إلى الصف الأول في ثلاث اطماعات في لوحة فحص. الآن إضافة 4.2 ميكرولترات من العضلات الهيكل العظمي myosin الثاني إلى مزيج انزيم. دوامة لفترة وجيزة.إضافة myosin إلى مزيج انزيم الحق قبل الاستغناء. الحضانة الطويلة من المحاليد الميوسين المخفف قد يؤدي إلى فقدان النشاط بسبب هطول الأمطار، وغير محددة ملزمة للأسطح البلاستيكية. قم بتحميل مزيج انزيم الميوسين المعد في واحدة من حاويات العينة للموزع التلقائي.في لوحة، باستثناء الصف الأول، الاستغناء 8.4 ميكرولترات من مزيج انزيم الميوسين في كل بئر من لوحة المقايسة. ثم ضع لوحة الفحص ولوحة المركب على مُواهيات المختبرات لنظام معالجة سائل آلي مجهز برأس أداة دبوس 100 نانولتر. ثم تشغيل الطريقة المناسبة في البرنامج لنقل 100 نانولترات من الحلول من لوحة مجمع المعدة إلى لوحة المقايسة.بعد ذلك، ضع لوحة المقايسة على متن لوحة صغيرة لتهز لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة عند 1، 200 دورة في الدقيقة. إضافة 4، 052 ميكرولترات من حل actin الطرد المركزي إلى مزيج الركيزة ودوامة لفترة وجيزة. لبدء التفاعل الأنزيمي، الاستغناء 11.6 ميكرولترات من مزيج الركيزة actin في كل بئر من لوحة المقايسة باستخدام موزع التلقائي، باستثناء الصف الأول.على شاكر microplate، يهز لوحة المقايسة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة في 1، 200 دورة في الدقيقة. الطرد المركزي لوحة المقايسة في 101 مرات ز لمدة 30 ثانية. استخدام 380 نانومتر، 10 نانومتر عرض الفرقة مرشح، و 470 نانومتر، 24 نانومتر عرض الفرقة مرشح الانبعاثات بالتزامن مع 425 نانومتر قطع مرآة dichroic للمقايسات.تحسين عدد من ومضات، مكاسب كاشف، أبعاد لوحة وارتفاع القياس قبل تشغيل المقايسات. تشغيل القياس في وضع التركيز العالي. تأكد من أن درجة الحرارة الداخلية لقارئ لوحة استقرت عند 25 درجة مئوية.تحميل لوحة في قارئ لوحة ويهز لمدة 30 ثانية أخرى لجعل شكل السطح السائل مماثلة في كل بئر والسماح لوحة للوصول إلى درجة حرارة القياس. مسح لوحة في فترات 45 ثانية وسجل الفلورس NADH لمدة 30 دقيقة. مع البيانات المصدرة، رسم شدة الفلورس الملاحظة مع الزمن لكل بئر.تنفيذ انحدار خطي بسيط لتحديد الميل واعتراض استجابات الفلوريسنس لكل بئر. الميل يتناسب مع معدل استهلاك NADH الذي يمكن استخدامه كتقريب جيد جداً لمعدل استهلاك ATP. التقاطع يتناسب مع تركيز NADH في بداية القياس.ثم، بناء منحنى معايرة لDH عن طريق رسم اعتراض حصلت على الصف الأول من لوحة ضد تركيز NADH. تقدر عمليات الاعتراض شدة الفلورس الحقيقي في البداية بثقة أكبر بكثير من متوسط كثافة الفلورسنسي الخام التي تقرأ في البداية. تنفيذ انحدار خطي بسيط للحصول على الميل واعتراض خط معايرة NADH.هنا، يصف الاعتراض إشارة خلفية الفلوريسنس مع عدم وجود NADH، في حين أن المنحدر يتوافق مع كثافة الفلورس النظرية استقراء من محلول NADH الضرس واحد. لتحويل التغيرات المفلورة إلى معدلات استهلاك ATP تقسيم المنحدر من الاستجابة fluorescence التي تم الحصول عليها لبقية الآبار من قبل المنحدر من خط معايرة NADH. بعد ذلك، رسم معدلات استهلاك ATP ضد تركيز المانع.لتحديد الثوابت المثبطة، استخدم أي برنامج إحصائي مناسب قادر على تركيب المنحنى غير الخطي، مثل Origin 2017. حدد منحنى غير خطي مناسب لاحتواء بيانات استجابة الجرعة مع معادلة تربيعية تقابل نموذج توازن ملزم واحد لواحد بسيط. Y هو معدل استهلاك ATP.Y-الحد الأدنى هو معدل استهلاك ATP في غياب المانع. Y-الحد الأقصى هو معدل استهلاك ATP النظري عند تثبيط 100٪. t و t هي التركيز الكلي للزيم والمثبطات الميوسين، على التوالي.KI هو ثابت مثبطة. في هذه الدراسة, الهيكل العظمي والقلب عضلة myosin الثاني ATPase أظهرت ردود الفعل آثار كثافة الفلورانس الخطي بغض النظر عن myosin المستخدمة أو وجود مثبطات. أظهرت معدلات ATPase القاعدية و actin تنشيط الاعتماد الخطي على تركيز الهيكل العظمي أو عضلة القلب myosin II.A معامل نافذة الفحص أو عامل Z من 0.78 أشار إلى مقايسة موثوق بها مع ضوابط إيجابية وسلبية بشكل جيد جداً.أظهر Blebbistatin، و para-Aminoblebbistatin، وشبه Nitroblebbistatin منحنيات استجابة الجرعة العادية عند أو أقل من قيم الذوبان المبلغ عنها. تم تحديد الثوابت المثبطة لكل من القلب والعضلات الهيكلية myosin IIs عن طريق تركيب معادلة تربيعية تمثل نموذجًا بسيطًا ملزمًا للتوازن للبيانات. أظهرت آثار كثافة الفلوريسنس لبليبيتاتين التي تم الحصول عليها في مقايسة ATPase باستخدام العضلات الهيكلية العضلية II إشارة انخفاض خطي طبيعي اعتمادًا على كمية المانع الموجودة.ومع ذلك ، فوق ذوبان blebbistatin لوحظ زيادة غير متوقعة في الإشارة على الأرجح بسبب تشكيل بلورات blebbistatin الفلورسنت الزاهية. وفي حالة شبه Nitroblebbistatin ذات آثار شدة الفلورية الخام العادية، فإن معدلات التفاعل التي تم الحصول عليها فوق القابلية للذوبان قد انحرفت عن منحنى الاستجابة للجرعة المحددة بسبب هطول الأمطار. باستخدام هذه الطريقة، قمنا بتطوير مثبطات الميوسين الجديدة، القوية، والانتقائية التي يمكن استخدامها كأدوات علمية في البحوث الأساسية أو كمرشحين مباشرين في المستقبل.من المستحسن دائماً استخدام ATPase مختلفة أو غيرها من الأقوال الفنية المحددة لأنزيم الفائدة للتمييز بين الضربات الإيجابية الحقيقية والزائفة. كل البروتينات تربط الأسطح البلاستيكية. هذه المشكلة يمكن أن تؤثر بشدة على النتائج، وخاصة إذا كان البروتين موجود في تركيزات منخفضة.تجنب دائما معالجة السائل لا لزوم لها، واستخدام أنابيب غير ملزمة. تتطلب عادةً مقايسات ATPase البديلة مناولة حمض الكبريتيك أو المواد السامة أو المواد المشعة. وعلى النقيض من ذلك، تتطلب مقايسات ATPase المرتبطة بـ NADH كاشفات بدون سمية أو سمية منخفضة للغاية فقط.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

الفحص الخاص بمثبطات بيروفوسفاتاسي الغشائية المربوطة بغشاء الثموغا

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

فحص الطيفي لمثبطات محتملة من الجلوتاثيون السيتوسولي S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

تطوير قطاع كروماتوغرافي للتدفق الجانبي للكشف السريع والكمي عن مركبات الجزيئات الصغيرة

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...