Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra det nationale Institut for neurologiske lidelser og slagtilfælde og National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM).

1. klargøring af stamopløsninger og reagenser
<ol><li>Forbered ditiotreitol (DTT) stamopløsning ved at opløse krystallinsk DTT i destilleret vand til en endelig koncentration på 1000 mm. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved-20 °C.</li>
	<li>Forbered ATP stamopløsning ved at opløse krystallinsk ATP i destilleret vand til en endelig koncentration på 100 mM. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved-20 °C.</li>
	<li>Forbered 10x NADH buffer indeholdende 70 mM 3-(N-morpholino)...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

Kritiske trin i protokollen
Optimer plade layoutet ved at køre flere plader med kun negativ kontrol (ATPase-reaktion uden inhibitor). Undersøg resultaterne omhyggeligt for mønstre i reaktionshastigheder. For eksempel kan disse opstå fra kanteffekter og/eller ufuldkommenheder i hydrofile overfladebelægning af "ikke bindende" plader. Hvis der observeres et mønster, skal du ændre plade type og/eller plade layout for at minimere artefakterne. For eksempel kan en typisk dosi...

Myosins er mekaniske kemiske energi transducere, der hydrolyserer adenosin trifosfat (ATP) til at generere retningsbestemt bevægelse langs filamenterne af actin cytoskelet i eukaryoter1,2. De har både strukturelt og kinetisk tilpasset deres forskellige intracellulære funktioner, såsom transport af organeller, muskelsammentrækning eller generering af cytoskelet spænding1,2. Myosin super Family er repræsenteret ved ~ 40 myosin gener, der tilhører ~ 12 forskellige myosin klasser i det menneskelige genom3,4. Medlemmer af myosin klasser spiller forskellige roller i en meget forskelligartet sæt af lidelser, såsom flere kræftformer, neurologiske lidelser, skelet myopatier, og hypertrofisk kardiomyopati5,6. I betragtning af det store antal fysiologiske og patologiske funktioner i disse molekylære motorer, er det ikke overraskende, at de bliver mere og mere anerkendt som Drug mål for en række betingelser7. Der er gjort betydelige fremskridt for nylig i opdagelsen af nye myosin-hæmmere8,9,10 og aktivatorer11, og for at forbedre egenskaberne for de eksisterende12, 13 , 14 , 15.
Nicotinamid-adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase-assay har længe været anvendt til at måle ATPase-aktiviteten af forskellige enzymer, såsom sarcoplasmisk reticulum ca2 + pumpe ATPase16, DNA-reparationen ATPase Rad5417, AAA + ATPase p9718 eller mikrotubulen motorisk kinesin19. Analysen anvender en ATP-regenereringscyklus. Adenosindiphosphat (ADP) genereret af ATPase regenereres til ATP af pyruvatkinase (PK), som forvandler et molekyle af phosphoenolpyruvat (PEP) til pyruvat parallelt. Efterfølgende reduceres pyruvat til laktat ved lactat dehydrogenase (LDH). Det, til gengæld, oxiderer et molekyle af NADH til NAD. Derfor er faldet i NADH-koncentrationen som en funktion af tid lig med ATP Hydrolysehastigheden. ATP-regenererings cyklussen holder ATP-koncentrationen næsten konstant, og ADP-koncentrationen er lav, så længe PEP er tilgængelig. Dette resulterer i lineære tids kurser, hvilket gør det enkelt at bestemme de indledende reaktions rater og hjælper med at undgå produkt hæmning af ADP19. Selv om den NADH-koblede ATPase-analyse allerede er blevet tilpasset til et 96-Well-format20, gør de høje reaktions volumener (~ 150 μl) det relativt dyrt på grund af den høje efterspørgsel efter reagenser, hvorved det bliver mindre modtagelig for hurtig screening af et stort antal Forbindelser. Alternative metoder, såsom malachite grøn assay19,21, som bygger på påvisning af fosfat produceret af ATPase enzym, blev vist sig mere egnet til miniaturisering og High-gennemløb screening22 , 23 , 24. det er dog mere sandsynligt, at en endepunkts analyse påvirkes af flere artefakter (diskuteret nedenfor), som kan forblive uopdagede i fravær af fuldtids kurser.
Her, den NADH-koblede ATPase assay er blevet optimeret til semi-høj gennemløb screening af små molekyle hæmmere. Skelet-og hjertemusklen myosin II og myosin-inhibitorer blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 og para-nitroblebbistatin12 anvendes til at PÅVISE analysens effekt, som er afhængig af NADH Fluorescens som en udlæser. Denne protokol kan anvendes til screening af projekter, der fokuserer på alle ADP-producerende enzymer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

ATPase enzymer udnytte den frie energi lagret i adenosin trifosfat at katalysere en bred vifte af endergonic biokemiske processer in vivo, der ikke ville forekomme spontant. Disse proteiner er afgørende for væsentlige alle aspekter af cellulære liv, herunder metabolisme, celledeling, reaktioner på miljømæssige ændringer og bevægelse. Protokollen præsenteres her beskriver en nicotinamid adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase assay, der er blevet tilpasset til semi-høj gennemløb screening af små molekyle ATPase hæmmere. Analysen er blevet anvendt til hjerte-og skeletmuskulatur myosin II, to actin-baserede molekylære motor ATPases, som et bevis på princippet. Hydrolyse af ATP er koblet til oxidation af NADH ved enzymatiske reaktioner i analysen. For det første er ADP genereret af ATPase regenereret til ATP af pyruvatkinase (PK). PK katalyserer overgangen af fosfoenolpyruvat (PEP) til pyruvat parallelt. Efterfølgende, pyruvat er reduceret til laktat af lactat dehydrogenase (LDH), som katalyserer oxidation af NADH parallelt. Således, faldet i ATP koncentration er direkte korreleret til faldet i NADH koncentration, som efterfølges af ændring af den iboende fluorescens af NADH. Så længe der findes PEP i reaktionssystemet, er ADP-koncentrationen fortsat meget lav, hvilket forhindrer, at ATPase-enzymet hæmmes af sit eget produkt. Desuden er ATP-koncentrationen stadig næsten konstant, hvilket giver lineære tids kurser. Fluorescensen overvåges kontinuerligt, hvilket gør det let at anslå datakvaliteten og hjælper med at bortfiltrere potentielle artefakter (f. eks. som følge af sammensatte udfældning eller termiske ændringer).

Det typiske plade kort, der anvendes til screening af eksperimenter, er vist i figur 1. Den første og sidste række er forbeholdt NADH kalibrering og positiv kontrol (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), hhv. De resterende rækker (B til O) anvendes til at teste forbindelsers hæmmende aktivitet. Her tilberedes og overføres femten-trins serie 1:2 fortyndinger, der starter fra 10 mM sammensat koncentration i DMSO, fra den sammensatte plade til...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

En nicotinamid-adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase-analyse er blevet tilpasset til halvhøj gennemløbs screening af små molekyle myosin-hæmmere. Denne kinetiske analyse køres i et 384-brønd mikroplade format med samlet reaktions volumen på kun 20 μL pr. brønd. Platformen bør gælde for stort set alle ADP-producerende enzymer.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Denne protokol gælder for en lang række screeningsprojekter, der har til formål at udvikle ATPase-hæmmere, enten som sonder til grundforskning eller for potentielle kliniske forbindelser. Denne metode er blevet optimeret til semi-høj-throughput screening applikationer. Det er også designet til at undgå flere almindelige artefakter, og det kræver ikke håndtering af farlige materialer.I vores laboratorium har vi brugt denne analyse til at udvikle nye og specifikke ikke-muskel myosin II hæmmere til behandling af metamfetamin brug lidelse. I teorien kan denne metode nemt anvendes på alle enzymer, der producerer ATP. Visuel demonstration hjælper med at afklare alle de vigtige tekniske detaljer.Til at begynde, forberede 4, 500 mikroliter af 20 mikromolar fortyndet actin opløsning for hver 384-godt sort polystyren mikroplade ved at fortynde den koncentrerede actin lageropløsning i actin buffer. Opløsningen blandes grundigt ved at pipettere op og ned 30 gange for at bryde aktinfilamenter for at reducere viskositet og heterogenitet. Derefter centrifuge opløsningen til at fjerne eventuelle udfældede protein til stede.Overfør forsigtigt supernatanten til et rent centrifugerør. Forbered master enzymblanding i et 15-milliliter konisk centrifugerør for hver analyseplade ved at kombinere 3, 252,9 mikroliter myosinbuffer til analysen, der involverer skeletmuskulatur myosin II, 171,4 mikroliter LDH-opløsning og 171,4 mikroliter PK-opløsning. Forbered master substrat mix i en 15-milliliter konisk centrifuge rør til hver plade ved at kombinere 162,1 mikroliter AF ATP, 162.1 mikroliter PEP, og 324.1 mikroliter af NADH opløsning.Tilfør ikke actin på dette tidspunkt for at undgå sammenlægning og nedbør. For at skabe syv-trins seriel en-til-to fortyndinger af NADH til kalibrering, forberede otte 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør. Bland 12,3 mikroliter AF NADH lageropløsning med 257,7 mikroliter myosin buffer i det første rør til at lave en 250 mikromolar opløsning.Derefter aliquot 135 mikroliter af myosin buffer i hver af de resterende syv rør. Overfør 135 mikroliter af opløsningen fra det første rør til det andet og blandes ved pipettering. Gentag indtil det syvende rør nås.Brug det sidste rør som no-NADH kontrol med kun buffer. Medtag altid positive og negative kontroller på sammensatte plader og NADH-fortyndinger til kalibrering på analyseplader. Disse kontroller er ekstremt vigtige for at identificere artefakter under dataanalyse.Ved hjælp af en otte-kanals pipette, overføre 20 mikroliter af NADH kalibreringsløsninger i den første række i tre eksemplarer i en analyseplade. Nu tilføje 4,2 mikroliter af skeletmuskulatur myosin II til enzymblandingen. Vortex kort.Tilsæt myosin til enzymblandingen lige før udlevering. Lang inkubation af fortyndede myosinopløsninger kan resultere i tab af aktivitet på grund af nedbør og uspecifikke bindinger til plastoverflader. Den forberedte myosinenzymblanding indlæses i en af prøvebeholderne i en automatisk dispenser.I pladen, bortset fra den første række, dispensere 8,4 mikroliter af myosin enzym blandes i hver brønd af analysen plade. Derefter placeres analysepladen og den sammensatte plade på labware positioner af et automatiseret væskehåndteringssystem, som er udstyret med en 100-nanoliter pin værktøj hoved. Kør derefter den relevante metode i softwaren til at overføre 100 nanoliters af opløsninger fra den forberedte sammensatte plade til analysepladen.Dernæst placere analysen plade på en mikroplade shaker at ryste i et minut ved stuetemperatur ved 1, 200 rpm. Der tilsættes 4,052 mikroliter af centrifugeret actin opløsning til substratblandingen og vortex kort. For at starte den enzymatiske reaktion, dispensere 11,6 mikroliter actin substrat blandes i hver brønd af analysen plade ved hjælp af en automatisk dispenser, undtagen den første række.På en mikropladeshaker rystes analysepladen i et minut ved stuetemperatur ved 1.200 omdrejninger i minuttet. Centrifuge analysen plade ved 101 gange g i 30 sekunder. Brug et 380-nanometer, 10-nanometer båndbredde excitation filter, og 470 nanometer, 24-nanometer bånd bredde emission filter sammen med 425-nanometer cutoff dichroic spejl til assays.Optimer antallet af blink, detektor forstærkning, plade dimensioner og målehøjde, før du kører analyserne. Målingen køres i høj koncentrationstilstand. Sørg for, at pladelæserens indre temperatur har stabiliseret sig ved 25 grader Celsius.Læg pladen i pladelæseren og ryst i yderligere 30 sekunder for at gøre væskeoverfladens form ens i hver brønd og lade pladen nå måletemperaturen. Scan pladen i 45-sekunders intervaller og optag NADH fluorescens i 30 minutter. Med de eksporterede data afbildes den observerede fluorescensintensitet i forhold til tiden for hver brønd.Udfør simpel lineær regression for at bestemme hældningen og opfange fluorescensresponserne for hver brønd. Hældningen er proportional med NADH-forbrugshastigheden, som kan bruges som en meget god tilnærmelse af ATP-forbrugshastigheden. Aflytningen er proportional med NADH-koncentrationen i begyndelsen af målingen.Konstrueres derefter en kalibreringskurve for NADH ved at afbilde de aflytninger, der er opnået for den første række af pladen mod koncentrationen af NADH. De aflytninger anslår den reelle fluorescens intensiteter i begyndelsen med meget mere tillid end gennemsnittet af den rå fluorescens intensitet læser i begyndelsen. Udfør simpel lineær regression for at opnå hældningen og opfange nadh kalibreringslinjen.Her beskriver aflytningerne fluorescensbagsignalet uden NADH til stede, mens hældningen svarer til den ekstrapolerede teoretiske fluorescensintensitet for en en molar NADH-opløsning. Hvis fluorescensændringer konverteres til ATP-forbrugshastigheder, divideres hældningen af fluorescensresponsen, der opnås for resten af brøndene, ved hældningen af NADH-kalibreringslinjen. Dernæst afbildes ATP-forbruget mod koncentrationen af inhibitoren.For at bestemme de hæmmende konstanter skal du bruge enhver passende statistisk software, der kan ikke-lineær kurvemontering, såsom Origin 2017. Vælg en ikke-lineær kurve, der passer til dosisresponsdataene, til en kvadratisk ligning, der svarer til en simpel en-til-en-bindingsligevægtsmodel. Y er ATP-forbrugshastigheden.Y-minimum er ATP-forbruget i mangel af inhibitor. Y-maksimum er den teoretiske ATP-forbrugshastighed ved 100% hæmning. t og t er den samlede koncentration af myosinenzymet og -hæmmeren.KI er den hæmmende konstant. I denne undersøgelse, skelet-og hjertemusklen myosin II ATPase reaktioner viste lineær fluorescens intensitet spor uanset myosin anvendes eller tilstedeværelsen af inhibitorer. Basal og actin-aktiveret ATPase satser viste lineær afhængighed af koncentrationen af skelet-eller hjertemusklen myosin II.A screening vindue koefficient eller Z faktor på 0,78 angivet en pålidelig analyse med meget godt adskilt positiv og negativ kontrol.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin og para-Nitroblebbistatin viste regelmæssige dosis-respons kurver på eller under deres rapporterede opløselighed værdier. Hæmmende konstanter for både hjerte- og skeletmuskulatur myosin-ii'er blev bestemt ved at montere en kvadratisk ligning, der repræsenterer en simpel ligevægtsbindingsmodel til dataene. Fluorescensintensitetsspor for blebbistatin opnået i en ATPase-analyse ved hjælp af skeletmuskulatur myosin II viste normalt lineært faldende signal afhængigt af mængden af inhibitor til stede.Men over opløseligheden af blebbistatin en uventet stigning i signalet blev observeret mest sandsynligt på grund af dannelsen af lyst florescent blebbistatin krystaller. I tilfælde af para-Nitroblebbistatin med normale spor af rå fluorescensintensitet afveg reaktionsraterne over opløselighed fra den fastlagte dosis-respons-kurve på grund af udfældning. Ved at bruge denne metode har vi udviklet nye, potente og selektive myosinhæmmere, der kan bruges som videnskabelige værktøjer i grundforskning eller som direkte kandidater i fremtiden.Det anbefales altid at bruge en anden ATPase eller anden funktionel analyse, der er specifik for det enzym af interesse, at skelne mellem reelle og falske positive hits. Alle proteiner binder plastoverflader. Dette problem kan i høj grad påvirke resultaterne, især hvis proteinet er til stede ved lave koncentrationer.Undgå altid unødvendig væskehåndtering, og brug ikke-bindende rør. Alternative ATPase-analyser kræver normalt håndtering af svovlsyre, giftige stoffer eller radioaktive materialer. I modsætning hertil kræver den NADH-forbundne ATPase-analyse reagenser uden eller meget lav toksicitet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga Maritima membranbundne Pyrofosfatasehæmmere

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spektrofotometrisk screening for potentielle hæmmere af cytosol glutathion S-transferaser

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro Single-Molecule Imaging Assay til analyse af cap-afhængige oversættelse kinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Præcis og præcis enkeltmolekyle FRET-målinger ved hjælp af Open Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Udvikling af en Lateral Flow immunokromatisk strimmel til hurtig og kvantitativ påvisning af små molekyleforbindelser

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...