Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte en National Institute on drug abuse NS096833 (CAM).

1. voorbereiding van voorraadoplossingen en reagentia
<ol><li>Bereid dithiotreïtol (DTT) stockoplossing door kristallijne DTT in gedestilleerd water op te lossen tot een eindconcentratie van 1000 mm. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Bereid ATP-voorraadoplossing door het oplossen van kristallijne ATP in gedestilleerd water tot een eindconcentratie van 100 mM. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Bereid 10x NADH buffer ...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

Kritieke stappen in het Protocol
Optimaliseer de plaat indeling door meerdere platen met alleen negatieve controle uit te voeren (ATPase-reactie zonder remmer). Inspecteer de resultaten zorgvuldig op patronen in reactiesnelheden. Deze kunnen bijvoorbeeld voortvloeien uit randeffecten en/of onvolkomenheden in de hydrofiele oppervlaktecoating van "niet-bindende" platen. Als een patroon wordt waargenomen, wijzigt u het plaat type en/of de plaat indeling om de artefacten te minima...

Myosins zijn mechanochemische energie transducers die adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyseren om richtings bewegingen te genereren langs de filamenten van het actine cytoskelet in eukaryoten1,2. Ze hebben zowel structureel als kinetisch aangepast aan hun verschillende intracellulaire functies, zoals het transport van organellen, spiercontractie of de aanmaak van cytoskelet spanning1,2. De myosin superfamilie wordt vertegenwoordigd door ~ 40 myosin genen die behoren tot ~ 12 verschillende myosin klassen in het menselijk genoom3,4. Leden van de myosin klassen spelen verschillende rollen in een zeer diverse set van aandoeningen, zoals verschillende kankers, neurologische aandoeningen, skelet myopathieën, en Hypertrofische cardiomyopathie5,6. Gezien het grote aantal fysiologische en pathologische functies van deze moleculaire motoren, het is niet verwonderlijk dat ze steeds meer worden erkend als drugs doelen voor een verscheidenheid van voorwaarden7. Er is recentelijk aanzienlijke vooruitgang geboekt in de ontdekking van nieuwe myosine-remmers8,9,10 en Activators11, en om de eigenschappen van bestaande te verbeteren12, 13 , 14 , 15.
De Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is al lange tijd gebruikt om de ATPase-activiteit van verschillende enzymen te meten, zoals de sarcoplasmorische reticulum CA2 + pomp ATPase16, de DNA-reparatie ATPase RAD5417, de AAA + ATPase P9718 of de microtubulus motor kinesin19. Bij de assay wordt een ATP-regeneratiecyclus gebruikt. De adenosine difosfaat (ADP) gegenereerd door de ATPase wordt geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK), die transformeert één molecule van fosfoenolpyruvate (PEP) pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH). Dat, op zijn beurt, oxiderende een molecuul van NADH naar NAD. Daarom is de afname van de NADH-concentratie als functie van de tijd gelijk aan de ATP-hydrolysesnelheid. De ATP-regeneratiecyclus houdt de ATP-concentratie bijna constant en de ADP-concentratie laag zolang PEP beschikbaar is. Dit resulteert in lineaire tijd cursussen, waardoor het eenvoudig is om de initiële reactiesnelheden te bepalen en helpt bij het voorkomen van product remming door ADP19. Hoewel de NADH-gekoppelde ATPase-assay al is aangepast aan een 96-well formaat20, maken de hoge reactievolumes (~ 150 μL) het relatief duur vanwege de hoge vraag van reagentia, waardoor het minder vatbaar is voor een snelle screening van grote aantallen Verbindingen. Alternatieve methoden, zoals de Malachiet groene assay19,21, die berust op de opsporing van het fosfaat dat wordt geproduceerd door het ATPase-enzym, bleken geschikter te zijn voor miniaturisatie en screening met hoge doorvoer22 , 23 , 24. een eindpunt test heeft echter meer kans om beïnvloed te worden door verschillende artefacten (hieronder besproken), die onontdekt kunnen blijven bij afwezigheid van voltijdse cursussen.
Hier is de NADH-gekoppelde ATPase-assay geoptimaliseerd voor de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecuul remmers. Skelet en cardiale spier myosine II en de myosin-remmers blebbistatine8, para-aminoblebbistatine13 en para-nitroblebbistatine12 worden gebruikt om de kracht van de test aan te tonen, die gebaseerd is op NADH fluorescentie als uitlezen. Dit protocol is vatbaar voor screening van projecten gericht op elke ADP-producerende enzymen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

ATPase enzymen maken gebruik van de vrije energie opgeslagen in adenosinetrifosfaat om een grote verscheidenheid van endergonische biochemische processen in vivo te katalyseren die niet spontaan zouden optreden. Deze eiwitten zijn cruciaal voor in wezen alle aspecten van het cellulaire leven, met inbegrip van metabolisme, celdeling, reacties op veranderingen in het milieu en beweging. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft een Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase assay die is aangepast aan de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecule ATPase remmers. De assay is toegepast op cardiale en skeletspier myosine II, twee actin gebaseerde moleculaire motor ATPases, als een bewijs van principe. De hydrolyse van ATP is gekoppeld aan de oxidatie van NADH door enzymatische reacties in de assay. Ten eerste wordt de door de ATPase gegenereerde ADP geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK). PK katalyseert de overgang van fosfoenolpyruvate (PEP) naar pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH), wat de oxidatie van NADH parallel katalyseert. Zo is de afname van de ATP-concentratie direct gecorreleerd aan de afname van de concentratie NADH, die wordt gevolgd door verandering in de intrinsieke fluorescentie van NADH. Zolang PEP beschikbaar is in het reactiesysteem, blijft de ADP-concentratie zeer laag, waardoor remming van het ATPase-enzym door zijn eigen product wordt vermeden. Bovendien blijft de ATP-concentratie vrijwel constant, wat lineaire tijdvakken oplevert. De fluorescentie wordt continu bewaakt, waardoor een eenvoudige schatting van de kwaliteit van de gegevens mogelijk is en helpt bij het filteren van mogelijke artefacten (bijvoorbeeld als gevolg van samengestelde neerslag of thermische veranderingen).

De standaardkaart voor screening-experimenten wordt weergegeven in Figuur 1. De eerste en laatste rij zijn gereserveerd voor NADH kalibratie en positieve controle (20 μM para-aminoblebbistatine, 0,5% DMSO), respectievelijk. De resterende rijen (B naar O) worden gebruikt om de remmende activiteit van verbindingen te testen. Hier worden vijftien stappen seriële 1:2 verdunningen vanaf 10 mM samengestelde concentratie in DMSO bereid en overgebracht van...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Dit protocol is van toepassing op een breed scala van screening projecten gericht op de ontwikkeling van ATPase remmers, hetzij als sondes voor fundamenteel onderzoek of voor potentiële klinische verbindingen. Deze methode is geoptimaliseerd voor semi-high-throughput screening toepassingen. Het is ook ontworpen om verschillende gemeenschappelijke artefacten te vermijden en het vereist niet de behandeling van gevaarlijke stoffen.In ons laboratorium hebben we deze test gebruikt om nieuwe en specifieke niet-spier myosine II-remmers te ontwikkelen voor de behandeling van methamfetaminegebruiksstoornis. In theorie kan deze methode gemakkelijk worden toegepast op enzymen die ATP produceren. Visuele demonstratie helpt om alle belangrijke technische details te verduidelijken.Om te beginnen, bereid 4,500 microliter van 20 micromolar verdunde actine oplossing voor elke 384-well zwarte polystyreen microplaat door het verdunnen van de geconcentreerde actine voorraad oplossing in actin buffer. Meng de oplossing grondig door 30 keer op en neer te pipetten om actinefilamenten te breken om viscositeit en heterogeniteit te verminderen. Centrifugeer vervolgens de oplossing om eventueel neergeslagen eiwitten te verwijderen.Breng de supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis. Bereid master enzym mix in een 15-milliliter conische centrifuge buis voor elke testplaat door het combineren van 3, 252,9 microliters van myosine buffer voor de test waarbij skeletspier myosine II, 171,4 microliter van LDH oplossing, en 171,4 microliters van PK oplossing. Bereid master substraat mix in een 15-milliliter conische centrifuge buis voor elke plaat door het combineren van 162,1 microliter van ATP, 162,1 microliter pep, en 324,1 microliter van NADH oplossing.Voeg op dit punt geen actin toe om aggregatie en neerslag te voorkomen. Om zeven-staps seriële één-op-twee verdunningen van NADH voor kalibratie te creëren, bereid acht 1.5-milliliter microcentrifugebuizen voor. Meng 12,3 microliter NADH-voorraadoplossing met 257,7 microliter myosinebuffer in de eerste buis om een 250 micromolaroplossing te maken.Dan aliquot 135 microliters van myosine buffer in elk van de resterende zeven buizen. Breng 135 microliter van de oplossing van de eerste buis in de tweede en meng door pipetting. Herhaal dit tot het bereiken van de zevende buis.Gebruik de laatste buis als no-NADH-controle met alleen buffer. Neem altijd positieve en negatieve controles op samengestelde platen en NADH-verdunningen op testplaten op. Deze besturingselementen zijn uiterst belangrijk voor het identificeren van artefacten tijdens gegevensanalyse.Met behulp van een achtkanaals pipet breng je 20 microliter van de NADH-kalibratieoplossingen in drievouden in drievouden in een testplaat. Voeg nu 4,2 microliter skeletspier myosine II toe aan de enzymmix. Vortex kort.Voeg myosine toe aan het enzymmengsel vlak voor het uitdelen. Lange incubatie van verdunde myosineoplossingen kan leiden tot verlies van activiteit als gevolg van neerslag en niet-specifieke binding aan kunststofoppervlakken. Laad het bereide myosineenzymmengsel in een van de monstercontainers van een automatische dispenser.In de plaat, met uitzondering van de eerste rij, 8,4 microliter van de myosine enzym mix in elke put van de testplaat. Plaats vervolgens de testplaat en de samengestelde plaat op de labware positioners van een geautomatiseerd vloeistofbehandelingssysteem dat is uitgerust met een 100 nanoliterpengereedschapkop. Voer vervolgens de juiste methode in de software uit om 100 nanoplegers van oplossingen over te brengen van de voorbereide samengestelde plaat naar de testplaat.Plaats vervolgens de testplaat op een microplate shaker om een minuut te schudden bij kamertemperatuur bij 1.200 tpm. Voeg 4,052 microliters van de centrifuged actineoplossing kort toe aan de substraatmix en vortex. Om de enzymatische reactie te starten, 11,6 microliter actine substraat mix in elke put van de testplaat met behulp van een automatische dispenser, met uitzondering van de eerste rij.Schud op een microplate shaker de testplaat gedurende één minuut bij kamertemperatuur bij 1.200 tpm. Centrifugeren de testplaat op 101 keer g gedurende 30 seconden. Gebruik een 380-nanometer, 10-nanometer band breedte excitatie filter, en 470 nanometer, 24-nanometer band breedte emissiefilter in combinatie met de 425-nanometer cutoff dichroic spiegel voor de testen.Optimaliseer het aantal flitsen, detectoraanwinst, plaatafmetingen en meethoogte voordat u de testen uitvoert. Voer de meting in hoge concentratiemodus uit. Zorg ervoor dat de binnentemperatuur van de plaatlezer gestabiliseerd is bij 25 graden Celsius.Laad de plaat in de plaatlezer en schud nog 30 seconden om de vorm van het vloeibare oppervlak in elke put op elkaar te laten lijken en laat de plaat de meettemperatuur bereiken. Scan de plaat in intervallen van 45 seconden en neem nadh-fluorescentie gedurende 30 minuten op. Met de geëxporteerde gegevens, plot de waargenomen fluorescentie intensiteit tegen de tijd voor elke put.Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling te bepalen en de fluorescentiereacties voor elke put te onderscheppen. De helling is evenredig aan de NADH-verbruikssnelheid die kan worden gebruikt als een zeer goede benadering van het ATP-verbruik. De onderschepping is evenredig aan de NADH-concentratie aan het begin van de meting.Bouw vervolgens een kalibratiecurve voor NADH door de onderscheppingen die voor de eerste rij van de plaat zijn verkregen, in kaart te brengen tegen de concentratie van NADH. De onderscheppingen schatten de echte fluorescentieintensiteiten aan het begin met veel meer vertrouwen dan het gemiddelde van de ruwe fluorescentieintensiteit aan het begin leest. Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling te verkrijgen en de NADH-kalibratielijn te onderscheppen.Hier beschrijft de intercepties het fluorescentieachtergrondsignaal zonder NADH aanwezig, terwijl de helling overeenkomt met de geëxtrapoleerde theoretische fluorescentieintensiteit van een nadh-oplossing van één kies. Om fluorescentieveranderingen om te zetten in atp-consumptietarieven verdelen de helling van de fluorescentierespons die voor de rest van de putten wordt verkregen door de helling van de NADH-kalibratielijn. Zet vervolgens de ATP-consumptiecijfers in kaart tegen de concentratie van de remmer.Gebruik voor het bepalen van de remmende constanten de juiste statistische software die niet-lineaire curvefitting kan gebruiken, zoals Origin 2017. Selecteer niet-lineaire curve fit om de dosis-respons gegevens te passen op een kwadratische vergelijking die overeenkomt met een eenvoudige een-op-een bindend evenwicht model. Y is de ATP-consumptiesnelheid.Y-minimum is het ATP-verbruik bij afwezigheid van remmer. Y-maximum is de theoretische ATP-consumptiesnelheid bij 100%-remming. t en t zijn de totale concentratie van respectievelijk het myosineenzym en de remmer.KI is de remmende constante. In deze studie vertoonden skelet- en hartspier myosine II ATPase-reacties lineaire fluorescentieintensiteitssporen, ongeacht het gebruikte myosine of de aanwezigheid van remmers. Basale en actin-geactiveerde ATPase tarieven toonden lineaire afhankelijkheid van de concentratie van skelet- of hartspier myosine II.A screening venster coëfficiënt of Z-factor van 0,78 aangegeven een betrouwbare test met zeer goed gescheiden positieve en negatieve controles.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin en para-Nitroblebbistatin vertoonden regelmatige dosisresponscurven op of onder hun gerapporteerde oplosbaarheidswaarden. Remmende constanten voor zowel hart- als skeletspier myosine IIs werden bepaald door het aanbrengen van een kwadratische vergelijking die een eenvoudig evenwichtsbindingsmodel aan de gegevens vertegenwoordigt. Fluorescentie intensiteit sporen voor blebbistatine verkregen in een ATPase test met behulp van skeletspier myosine II toonde normaal lineair afnemend signaal, afhankelijk van de hoeveelheid van de aanwezige remmer.Echter, boven de oplosbaarheid van blebbistatine een onverwachte toename van het signaal werd waargenomen waarschijnlijk te wijten aan de vorming van helder florescent blebbistatine kristallen. In het geval van para-Nitroblebbistatine met normale ruwe fluorescentieintensiteitssporen, wijkden de boven oplosbaarheid verkregen reactiepercentages af van de vastgestelde dosisresponscurve als gevolg van neerslag. Met behulp van deze methode hebben we nieuwe, krachtige en selectieve myosineremmers ontwikkeld die in de toekomst kunnen worden gebruikt als wetenschappelijke instrumenten in fundamenteel onderzoek of als directe kandidaten.Het is altijd aanbevolen om een andere ATPase of andere functionele test te gebruiken die specifiek is voor het enzym van belang om onderscheid te maken tussen echte en vals-positieve hits. Alle eiwitten binden plastic oppervlakken. Dit probleem kan de resultaten sterk beïnvloeden, vooral als het eiwit aanwezig is bij lage concentraties.Vermijd altijd onnodige vloeistofbehandeling en gebruik niet-bindende buizen. Alternatieve ATPase-tests vereisen meestal de behandeling van zwavelzuur, giftige stoffen of radioactieve stoffen. De NADH-gekoppelde ATPase-test daarentegen vereist alleen reagentia zonder of zeer lage toxiciteit.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spectrofotometrische screening op potentiële remmers van Cytosolic Glutathione S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...