Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of Neurological Disorders and Stroke und des National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM) unterstützt.

1. Vorbereitung von Lagerlösungen und Reagenzien
<ol><li>Bereiten Sie die Lagerlösung Dithiothreitol (DTT) vor, indem Sie kristallines DTT in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 1000 mM auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Aliquot und lagern bei -20 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie die ATP-Lagerlösung vor, indem Sie kristallines ATP in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 mM auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH-Lösung ein. Aliquot und la...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. 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A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

Kritische Schritte im Protokoll
Optimieren Sie das Plattenlayout, indem Sie mehrere Platten nur mit Negativkontrolle betreiben (ATPase-Reaktion ohne Inhibitor). Prüfen Sie die Ergebnisse sorgfältig auf Muster in Reaktionsgeschwindigkeiten. Diese können z. B. durch Kanteneffekte und/oder Unvollkommenheiten in der hydrophilen Oberflächenbeschichtung von "unverbindlichen" Platten entstehen. Wenn ein Muster beobachtet wird, ändern Sie den Plattentyp und/oder das Plattenlayout...

Myosine sind mechanochemische Energiewandler, die Adenosintriphosphat (ATP) hydrolysieren, um richtungsweisende Bewegungen entlang der Filamente des Aktin-Zytoskeletts in Eukaryoten1,2zu erzeugen. Sie haben sich sowohl strukturell als auch kinetisch an ihre verschiedenen intrazellulären Funktionen angepasst, wie z.B. den Transport von Organellen, Muskelkontraktion oder die Erzeugung von Zytoskelettspannung1,2. Die Myosin-Überfamilie wird durch 40 Myosin-Gene repräsentiert, die zu 12 verschiedenen Myosin-Klassen im menschlichen Genom3,4gehören. Mitglieder der Myosin-Klassen spielen verschiedene Rollen in einer sehr unterschiedlichen Reihe von Erkrankungen, wie mehrere Krebsarten, neurologische Störungen, Skelettmyopathien, und hypertrophe Kardiomyopathie5,6. Angesichts der großen Anzahl von physiologischen und pathologischen Funktionen dieser molekularen Motoren, ist es nicht verwunderlich, dass sie zunehmend als Wirkstoffziele für eine Vielzahl von Bedingungen erkannt werden7. Erhebliche Fortschritte wurden in letzter Zeit bei der Entdeckung neuer Myosininhibitoren8,9,10 und Aktivatoren11, und zur Verbesserung der Eigenschaften der bestehenden12 , 13 , 14 , 15.
Der nicotinamidadenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelte ATPase-Assay wird seit langem verwendet, um die ATPase-Aktivität verschiedener Enzyme zu messen, wie z.B. die sarkoplasmische Retikulum-Ca 2+-Pumpe ATPase16, die DNA-Reparatur ATPase Rad5417, die AAA+ ATPase p9718 oder der Mikrotubuli-Motor Kinesin19. Der Test verwendet einen ATP-Regenerationszyklus. Das von der ATPase erzeugte Adenosindiphosphat (ADP) wird durch Pyruvatkinase (PK) zu ATP regeneriert, wodurch ein Molekül Phosphoenolpyruvat (PEP) parallel in Pyruvat umwandelt. Anschließend wird Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat reduziert. Das wiederum oxidiert ein Molekül von NADH zu NAD. Daher entspricht die Abnahme der NADH-Konzentration in Abhängigkeit von der Zeit der ATP-Hydrolyserate. Der ATP-Regenerationszyklus hält die ATP-Konzentration nahezu konstant und die ADP-Konzentration niedrig, solange PEP verfügbar ist. Dies führt zu linearen Zeitkursen, was es einfach macht, die anfänglichen Reaktionsraten zu bestimmen und hilft, Produkthemmung durch ADP19zu vermeiden. Obwohl der NADH-gekoppelte ATPase-Assay bereits an ein 96-Well-Format20angepasst wurde, machen die hohen Reaktionsvolumina (ca. 150 l) es aufgrund der hohen Nachfrage nach Reagenzien relativ teuer, so dass er weniger anfällig für eine schnelle Abschirmung großer Verbindungen. Alternative Methoden wie der Malachit-Grüntest19,21, der auf dem Nachweis des vom ATPase-Enzym produzierten Phosphats beruht, erwiesen sich als besser geeignet für die Miniaturisierung und das Hochdurchsatzscreening22 , 23 , 24. Ein Endpunkttest wird jedoch eher von mehreren Artefakten beeinflusst (siehe unten), die ohne Vollzeitkurse unentdeckt bleiben können.
Hier wurde der NADH-gekoppelte ATPase-Assay für das semi-hohe Durchsatzscreening kleiner Molekülinhibitoren optimiert. Skelett- und Herzmuskelmyosin II und die Myosininhibitoren Blebbistatin8, Para-Aminoblebbistatin13 und Para-Nitroblebbistatin12 werden verwendet, um die Kraft des Assays zu demonstrieren, der auf NADH beruht Fluoreszenz als Auslesung. Dieses Protokoll ist für Screening-Projekte zugänglich, die sich auf alle ADP-produzierenden Enzyme konzentrieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

ATPase-Enzyme nutzen die in Adenosintriphosphat gespeicherte freie Energie, um eine Vielzahl von endergonischen biochemischen Prozessen in vivo zu katalysieren, die nicht spontan auftreten würden. Diese Proteine sind entscheidend für alle Aspekte des Zelllebens, einschließlich Stoffwechsel, Zellteilung, Reaktionen auf Umweltveränderungen und Bewegung. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt einen nicotinamidadenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelten ATPase-Assay, der an das semi-hohe Durchsatzscreening kleiner Molekül-ATPase-Inhibitoren angepasst wurde. Der Assay wurde als Beweis für das Prinzip auf Herz- und Skelettmuskel Myosin II, zwei aktinbasierte molekularmotorische ATPases, angewendet. Die Hydrolyse von ATP wird mit der Oxidation von NADH durch enzymatische Reaktionen im Assay gekoppelt. Zunächst wird die von der ATPase erzeugte ADP durch Pyruvatkinase (PK) zu ATP regeneriert. PK katalysiert den Übergang von Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat parallel. Anschließend wird Pyruvat durch Laktatdehydrogenase (LDH) zu Laktat reduziert, was die Oxidation von NADH parallel katalysiert. Somit steht die Abnahme der ATP-Konzentration in direktem Zusammenhang mit der Abnahme der NADH-Konzentration, gefolgt von einer Veränderung der intrinsischen Fluoreszenz von NADH. Solange PEP im Reaktionssystem verfügbar ist, bleibt die ADP-Konzentration sehr gering, wodurch eine Hemmung des ATPase-Enzyms durch sein eigenes Produkt vermieden wird. Darüber hinaus bleibt die ATP-Konzentration nahezu konstant, was zu linearen Zeitkursen führt. Die Fluoreszenz wird kontinuierlich überwacht, was eine einfache Abschätzung der Datenqualität ermöglicht und dabei hilft, potenzielle Artefakte herauszufiltern (z. B. durch zusammengesetzte Fällungen oder thermische Veränderungen).

Die typische Plattenlayoutkarte, die für Screening-Experimente verwendet wird, ist in Abbildung 1dargestellt. Die erste und letzte Zeile sind für die NADH-Kalibrierung und Positivkontrolle reserviert (20 M Para-Aminoblebbistatin, 0,5% DMSO). Die übrigen Reihen (B bis O) werden verwendet, um die hemmende Aktivität von Verbindungen zu testen. Hierbei werden fünfzehnstufige serielle 1:2 Verdünnungen ab 10 mM Compoundkonzentration in DMSO vorberei...

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A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Dieses Protokoll gilt für eine Breite von Screening-Projekten zur Entwicklung von ATPase-Inhibitoren, entweder als Sonden für die Grundlagenforschung oder für potenzielle klinische Verbindungen. Diese Methode wurde für Screening-Anwendungen mit hohem Durchsatz optimiert. Es wurde auch entwickelt, um mehrere gängige Artefakte zu vermeiden und es erfordert nicht den Umgang mit gefährlichen Materialien.In unserem Labor haben wir diesen Test verwendet, um neue und spezifische nicht-muskelfreie Myosin-II-Hemmer für die Behandlung von Methamphetamin-Konsumstörungen zu entwickeln. Theoretisch kann diese Methode leicht auf alle Enzyme angewendet werden, die ATP produzieren. Visuelle Demonstration hilft, alle wichtigen technischen Details zu klären.Zunächst 4, 500 Mikroliter 20 mikromolare verdünnte Aktinlösung für jede 384-well schwarze Polystyrol-Mikroplatte vorbereiten, indem Sie die konzentrierte Aktin-Stock-Lösung im Aktinpuffer verdünnen. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie 30 Mal nach oben und unten pipetieren, um Aktin-Filamente zu brechen, um Viskosität und Heterogenität zu reduzieren. Dann zentrifugieren Sie die Lösung, um alle gefällten Protein vorhanden zu entfernen.Den Überstand vorsichtig in ein sauberes Zentrifugenrohr geben. Bereiten Sie den Master-Enzymmix in einem 15-Milliliter-Konifugenrohr für jede Assayplatte vor, indem Sie 3, 252,9 Mikroliter Myosinpuffer für den Test mit Skelettmuskel Myosin II, 171,4 Mikroliter LDH-Lösung und 171,4 Mikroliter PK-Lösung kombinieren. Bereiten Sie die Master-Substratmischung in einem 15-Milliliter-Konikonzentrigerohr für jede Platte vor, indem Sie 162,1 Mikroliter ATP, 162,1 Mikroliter PEP und 324,1 Mikroliter NADH-Lösung kombinieren.Fügen Sie an dieser Stelle kein Actin hinzu, um Aggregation und Niederschlag zu vermeiden. Um siebenstufige serielle Ein-zu-zwei-Verdünnungen von NADH für die Kalibrierung zu erstellen, bereiten Sie acht 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohre vor. Mischen Sie 12,3 Mikroliter NADH-Lagerlösung mit 257,7 Mikroliter Myosinpuffer in der ersten Röhre, um eine 250 Mikromolar-Lösung zu machen.Dann aliquot 135 Mikroliter Myosin Puffer in jedem der verbleibenden sieben Röhren. 135 Mikroliter der Lösung aus dem ersten Rohr in das zweite geben und durch Pipettieren mischen. Wiederholen Sie dies, bis Sie die siebte Röhre erreichen.Verwenden Sie die letzte Röhre als No-NADH-Steuerung mit nur Puffer. Enthalten immer positive und negative Kontrollen auf Zusammengesetzten Platten und NADH-Verdünnungen für die Kalibrierung auf Assay-Platten. Diese Steuerelemente sind äußerst wichtig, um Artefakte während der Datenanalyse zu identifizieren.Mit einer Achtkanalpipette 20 Mikroliter der NADH-Kalibrierlösungen in dreillütige Dreigebung in einer Assayplatte in die erste Reihe übertragen. Fügen Sie nun 4,2 Mikroliter Skelettmuskel Myosin II in den Enzymmix ein. Wirbel kurz.Fügen Sie Myosin der Enzymmischung direkt vor dem Dosieren hinzu. Eine lange Inkubation verdünnter Myosinlösungen kann zu einem Verlust der Aktivität aufgrund von Niederschlägen und einer unspezifischen Bindung an Kunststoffoberflächen führen. Laden Sie den vorbereiteten Myosin-Enzymmix in einen der Probenbehälter eines automatischen Spenders.Geben Sie in der Platte bis auf die erste Reihe 8,4 Mikroliter des Myosinenzyms in jeden Brunnen der Assayplatte. Legen Sie dann die Assayplatte und die Verbundplatte auf die Labware-Positionierer eines automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystems, das mit einem 100-Nanoliter-Stiftwerkzeugkopf ausgestattet ist. Führen Sie dann die entsprechende Methode in der Software aus, um 100 Nanoliter Lösungen von der vorbereiteten Verbundplatte auf die Assayplatte zu übertragen.Als nächstes legen Sie die Assayplatte auf einen Mikroplatten-Shaker, um eine Minute bei Raumtemperatur bei 1 200 Rpm zu schütteln. 4, 052 Mikroliter der zentrifugierten Aktinlösung kurz in die Substratmischung geben und wirbeln. Um die enzymatische Reaktion zu starten, geben Sie 11,6 Mikroliter Actinsubstrat in jeden Brunnen der Assayplatte mit einem automatischen Spender, mit Ausnahme der ersten Reihe.Auf einem Mikroplatten-Shaker die Assayplatte eine Minute bei Raumtemperatur bei 1 200 Umdrehungen pro Minute schütteln. Zentrifugieren Sie die Assayplatte 30 Sekunden lang bei 101 mal g. Verwenden Sie einen 380-Nanometer- 10-Nanometer-Bandbreiten-Anregungsfilter und einen Emissionsfilter mit einer Bandbreite von 470 Nanometern und 24 Nanometer Bandbreite in Verbindung mit dem 425-Nanometer-Abschaltdichroic-Spiegel für die Assays.Optimieren Sie die Anzahl der Blitze, die Detektorverstärkung, die Plattenabmessungen und die Messhöhe, bevor Sie die Tests ausführen. Führen Sie die Messung im Hochkonzentrationsmodus aus. Stellen Sie sicher, dass sich die Innentemperatur des Plattenlesers bei 25 Grad Celsius stabilisiert hat.Laden Sie die Platte in den Plattenleser und schütteln Sie weitere 30 Sekunden, um die Form der flüssigen Oberfläche in jedem Brunnen ähnlich zu machen und die Platte die Messtemperatur erreichen zu lassen. Scannen Sie die Platte in 45-Sekunden-Intervallen und zeichnen Sie die NADH-Fluoreszenz 30 Minuten lang auf. Zeichnen Sie mit den exportierten Daten die beobachtete Fluoreszenzintensität gegen die Zeit für jeden Brunnen.Führen Sie eine einfache lineare Regression durch, um die Neigung und das Abfangen der Fluoreszenzantworten für jeden Brunnen zu bestimmen. Die Steigung ist proportional zur NADH-Verbrauchsrate, die als sehr gute Annäherung an die ATP-Verbrauchsrate verwendet werden kann. Der Abfang ist proportional zur NADH-Konzentration zu Beginn der Messung.Erstellen Sie dann eine Kalibrierkurve für NADH, indem Sie die für die erste Reihe der Platte erhaltenen Abschnitte gegen die Konzentration von NADH zeichnen. Die Intercepts schätzen die realen Fluoreszenzintensitäten am Anfang mit viel mehr Vertrauen, als der Durchschnitt der Rohfluoreszenzintensität am Anfang liest. Führen Sie eine einfache lineare Regression durch, um die Steigung und den Abfang der NADH-Kalibrierungslinie zu erhalten.Hier beschreiben die Intercepts das Fluoreszenz-Hintergrundsignal ohne NADH, während die Steigung der extrapolierten theoretischen Fluoreszenzintensität einer einmolaren NADH-Lösung entspricht. Um Fluoreszenzänderungen in ATP-Verbrauchsraten umzuwandeln, dividiert die Neigung der Fluoreszenzantwort, die für den Rest der Brunnen durch die Steigung der NADH-Kalibrierlinie erhalten wird. Als nächstes werden die ATP-Verbrauchsraten gegen die Konzentration des Inhibitors aufgerechnet.Um die hemmenden Konstanten zu bestimmen, verwenden Sie eine geeignete statistische Software, die nichtlineare Kurvenanpassung kann, wie z. B. Origin 2017. Wählen Sie nichtlineare Kurvenanpassung aus, um die Dosis-Wirkungs-Daten an eine quadratische Gleichung anzupassen, die einem einfachen Eins-zu-Eins-Bindungsgleichgewichtsmodell entspricht. Y ist die ATP-Verbrauchsrate.Y-Minimum ist die ATP-Verbrauchsrate in Abwesenheit von Inhibitor. Y-Maximum ist die theoretische ATP-Verbrauchsrate bei 100%Hemmung. t und t sind die Gesamtkonzentration des Myosinenzyms bzw. des Inhibitors.KI ist die hemmende Konstante. In dieser Studie zeigten Skelett- und Herzmuskelmyosin-II-ATPase-Reaktionen lineare Fluoreszenzintensitätsspuren unabhängig vom verwendeten Myosin oder dem Vorhandensein von Inhibitoren. Basale und aktinaktivierte ATPase-Raten zeigten eine lineare Abhängigkeit von der Konzentration von Skelett- oder Herzmuskelmyosin II.Ein Screening-Fensterkoeffizient oder Z-Faktor von 0,78 zeigte einen zuverlässigen Assay mit sehr gut getrennten positiven und negativen Kontrollen.Blebbistatin, Para-Aminoblebbistatin, und Para-Nitroblebbistatin zeigten regelmäßige Dosis-Wirkungs-Kurven bei oder unter ihren gemeldeten Löslichkeitswerten. Hemmende Konstanten für Herz- und Skelettmuskelmyosin-IIs wurden bestimmt, indem eine quadratische Gleichung, die ein einfaches Gleichgewichtsbindungsmodell darstellt, an die Daten anpasste. Fluoreszenzintensitätsspuren für Blebbistatin, die in einem ATPase-Assay mit Skelettmuskel Myosin II erhalten wurden, zeigten ein normales linear abnehmendes Signal, abhängig von der Menge des vorhandenen Inhibitors.Jedoch, über der Löslichkeit von Blebbistatin wurde eine unerwartete Zunahme des Signals am ehesten aufgrund der Bildung von hell blühenden Blebbistatin-Kristallen beobachtet. Bei Para-Nitroblebbistatin mit normalen Rohfluoreszenzintensitätsspuren unterschieden sich die über Löslichkeit erhaltenen Reaktionsraten aufgrund von Niederschlag von der ermittelten Dosis-Wirkungs-Kurve. Mit dieser Methode haben wir neue, potente und selektive Myosininhibitoren entwickelt, die in Zukunft als wissenschaftliche Instrumente in der Grundlagenforschung oder als Direktkandidaten eingesetzt werden könnten.Es wird immer empfohlen, einen anderen ATPase oder einen anderen funktionellen Assay zu verwenden, der spezifisch für das Enzym von Interesse ist, um zwischen realen und falsch positiven Treffern zu unterscheiden. Alle Proteine binden Kunststoffoberflächen. Dieses Problem kann die Ergebnisse stark beeinflussen, vor allem, wenn das Protein in niedrigen Konzentrationen vorhanden ist.Vermeiden Sie immer unnötige Flüssigkeitshandhabung und verwenden Sie unverbindliche Schläuche. Alternative ATPase-Assays erfordern in der Regel den Umgang mit Schwefelsäure, toxischen Substanzen oder radioaktiven Stoffen. Im Gegensatz dazu benötigt der NADH-gebundene ATPase-Assay reagenzien nur ohne oder nur mit sehr geringer Toxizität.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Forschung

Biochemie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spektrophotometrisches Screening auf potenzielle Inhibitoren von zytosolischen Glutathion-S-Transferasen

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Entwicklung eines Lateral Flow Immunochromatographic Strip für den schnellen und quantitativen Nachweis niedermolekularer Verbindungen

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...