Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus e Istituto Nazionale per l'abuso di droga NS096833 (CAM).

1. Preparazione di soluzioni e reagenti azionari
<ol><li>Preparare la soluzione di stock dithiothreitol (DTT) sciogliendo il DTT cristallino in acqua distillata fino a una concentrazione finale di 1000 mM. Regolare il pH a 7.0 con una soluzione NaOH da 1 M. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare la soluzione di riserva ATP sciogliendo l'ATP cristallino nell'acqua distillata fino a una concentrazione finale di 100 mM. Regolare il pH a 7.0 con una soluzione NaOH da 1 M. Aliquota e conservare a ...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

Passaggi critici nel protocollo
Ottimizzare il layout della piastra eseguendo più piastre con controllo negativo (reazione ATPase senza inibitore). Esaminare attentamente i risultati per i modelli nei tassi di reazione. Ad esempio, questi possono derivare da effetti di bordo e/o imperfezioni nel rivestimento superficiale idrofilo di piastre "non vincolanti". Se si osserva un motivo, modificare il tipo di piastra e/o il layout della lastra per ridurre al minimo gli artefatti. ...

I miosini sono trasduttori di energia meccanochimica che idrolizzano il tripfosfato di adenosina (ATP) per generare movimento direzionale lungo i filamenti del citoscheletro actinos in eucarioti1,2. Si sono adattati sia strutturalmente che kineticamente alle loro varie funzioni intracellulari, come il trasporto di organelli, la contrazione muscolare o la generazione di tensione citoscheletrica1,2. La superfamiglia della miosina è rappresentata da 40 geni della miosina appartenenti a classi di miosina distinte da 12 dollari nel genoma umano3,4. I membri delle classi di miosina svolgono vari ruoli in una serie molto diversificata di disturbi, come diversi tumori, disturbi neurologici, miopatie scheletriche e cardiomiopatia ipertrofica5,6. Dato il gran numero di funzioni fisiologiche e patologiche di questi motori molecolari, non è sorprendente che stiano diventando sempre più riconosciuti come bersagli farmacologici per una varietà di condizioni7. Recentemente sono stati compiuti progressi significativi nella scoperta di nuovi inibitori della miosina8,9,10 e attivatori11, e per migliorare le proprietà di quelli esistenti12, 13 del sistema , 14 Del sistema , 15.
Il saggio ATPase (NADH) accoppiato alla nicotinammide adenina (NADH) è stato a lungo utilizzato per misurare l'attività ATPase di vari enzimi, come il reticulum sarccoplasmico Ca2o pompa ATPase16, la riparazione del DNA ATPase Rad5417, l'AAA ATPase p9718 o il motore microtubulo kinesin19. Il saggio utilizza un ciclo di rigenerazione ATP. Il difosfato di adenosina (ADP) generato dall'ATPase viene rigenerato all'ATP dalla chinasi pirata (PK), che trasforma una molecola di fosforenolpyruvate (PEP) in pyruvate in parallelo. Successivamente, il pirate viene ridotto al lattato dalla dehydrogenasi lattato (LDH). Che, a sua volta, ossida una molecola di NADH a NAD. Pertanto, la diminuzione della concentrazione di NADH in funzione del tempo è uguale al tasso di idrolisi ATP. Il ciclo di rigenerazione ATP mantiene la concentrazione ATP quasi costante e la concentrazione di ADP bassa fino a quando è disponibile PEP. Questo si traduce in corsi di tempo lineari, rendendo semplice determinare i tassi di reazione iniziali e aiuta a evitare l'inibizione del prodotto da ADP19. Anche se il test ATPase accoppiato con NADH è già stato adattato ad un formatoa96 ben20, gli elevati volumi di reazione (150 dollari) lo rendono relativamente costoso a causa dell'elevata domanda di reagenti, rendendolo meno suscettibile di screening rapido di un gran numero di Composti. I metodi alternativi, come il test verde malessere19,21, che si basa sulla rilevazione del fosfato prodotto dall'enzima ATPase, si sono dimostrati più adatti per la miniaturizzazione e lo screening ad alto valore22 , 23 del 23 o , 24.Tuttavia, è più probabile che un'espressione endpoint sia influenzata da diversi artefatti (discussi di seguito), che potrebbero rimanere sconosciuti in assenza di corsi a tempo pieno.
In questo caso, il saggio ATPase accoppiato nADH è stato ottimizzato per lo screening semi-alto della produttività degli inibitori delle piccole molecole. La miosina scheletrica e cardiaca muscolare miosina II e gli inibitori della miosina blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 e para-nitroblebbistatin12 sono utilizzati per dimostrare la potenza del saggio, che si basa su NADH fluorescenza come una lettura. Questo protocollo è suscettibile di vagliare progetti incentrati su qualsiasi enzimi che producono ADP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

Gli enzimi ATPase utilizzano l'energia libera immagazzinata nel triposfato adenosina per catalizzare un'ampia varietà di processi biochimici endergonici in vivo che non si verificherebbero spontaneamente. Queste proteine sono fondamentali per essenzialmente tutti gli aspetti della vita cellulare, tra cui il metabolismo, la divisione cellulare, le risposte ai cambiamenti ambientali e il movimento. Il protocollo qui presentato descrive un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) che è stato adattato allo screening semi-alto della produttività degli inibitori ATPase a piccole molecole. Il saggio è stato applicato alla miosina cardiaca e scheletrica di miosina II, due ATPases motori molecolari basati su actin, come prova di principio. L'idrolisi dell'ATP è accoppiata all'ossidazione di NADH da reazioni enzimatiche nel saggio. In primo luogo, l'ADP generato dall'ATPase viene rigenerato in ATP dalla chinasi pirativae (PK). PK catalizza la transizione del fosforolpyruvate (PEP) alla pirofavia in parallelo. Successivamente, il pirate viene ridotto al lattato mediante dehydrogenase di lattato (LDH), che catalizza l'ossidazione di NADH in parallelo. Pertanto, la diminuzione della concentrazione di ATP è direttamente correlata alla diminuzione della concentrazione di NADH, seguita da un cambiamento alla fluorescenza intrinseca di NADH. Finché la PEP è disponibile nel sistema di reazione, la concentrazione di ADP rimane molto bassa, evitando l'inibizione dell'enzima ATPase da parte del proprio prodotto. Inoltre, la concentrazione ATP rimane quasi costante, producendo corsi temporali lineari. La fluorescenza viene monitorata continuamente, il che consente una facile stima della qualità dei dati e aiuta a filtrare i potenziali artefatti (ad esempio, derivanti da precipitazioni composte o cambiamenti termici).

La tipica mappa di layout delle lame utilizzata per gli esperimenti di screening è illustrata nella Figura1. La prima e l'ultima riga sono riservate rispettivamente alla calibrazione NADH e al controllo positivo (20 m para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO). Le righe rimanenti (da B a O) vengono utilizzate per testare l'attività inibitoria dei composti. Qui, le diluizioni seriali 1:2 in quindici in fasi a partire dalla concentrazione composta di 10 mM i...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

Un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) è stato adattato allo screening semi-alto flusso di inibitori della miosina. Questo saggio cinetico viene eseguito in un formato a microplacca 384 pozzetti con volumi di reazione totali di soli 20 l per pozzo. La piattaforma dovrebbe essere applicabile praticamente a qualsiasi enzima che produce ADP.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Questo protocollo è applicabile a una vasta gamma di progetti di screening volti a sviluppare inibitori dell'ATPasi, sia come sonde per la ricerca di base che per potenziali composti clinici. Questo metodo è stato ottimizzato per applicazioni di screening ad altissima produttività. È stato anche progettato per evitare diversi artefatti comuni e non richiede la movimentazione di materiali pericolosi.Nel nostro laboratorio abbiamo usato questo saggio per sviluppare nuovi e specifici inibitori della miosina II non muscolare per il trattamento del disturbo da uso di metanfetamina. In teoria, questo metodo può essere facilmente applicato a qualsiasi enzima che produce ATP. La dimostrazione visiva aiuta a chiarire tutti i dettagli tecnici importanti.Per iniziare, preparare 4.500 microlitri di soluzione di actina diluita micromolare per ogni micropiapia di polistirolo nero da 384 porri diluire la soluzione concentrata di stock di actina in tampone di actina. Mescolare accuratamente la soluzione tubazione su e giù 30 volte per rompere i filamenti di actina per ridurre la viscosità e l'eterogeneità. Quindi centrifugare la soluzione per rimuovere eventuali proteine precipitate presenti.Trasferire con cura il supernatante in un tubo di centrifuga pulito. Preparare la miscela enzimatica master in un tubo di centrifuga conica da 15 millilitri per ogni piastra di dosaggio combinando 3,252,9 microlitri di tampone di miosina per il saggio che coinvolge miosina muscolare scheletrica II, 171,4 microlitri di soluzione LDH e 171,4 microlitri di soluzione PK. Preparare la miscela di substrato principale in un tubo di centrifuga conica da 15 millilitri per ogni piastra combinando 162,1 microlitri di ATP, 162,1 microlitri di PEP e 324,1 microlitri di soluzione NADH.Non aggiungere actina a questo punto per evitare l'aggregazione e le precipitazioni. Per creare diluizioni seriali da uno a due in sette punti di NADH per la calibrazione, preparare otto tubi a microcentrifugo da 1,5 millilitri. Mescolare 12,3 microlitri di soluzione stock di NADH con 257,7 microlitri di tampone di miosina nel primo tubo per fare una soluzione micromolare 250.Quindi aliquota 135 microlitri di tampone di miosina in ciascuno dei restanti sette tubi. Trasferire 135 microlitri della soluzione dal primo tubo al secondo e mescolare mediante pipettazione. Ripetere fino a raggiungere il settimo tubo.Utilizzare l'ultimo tubo come controllo no-NADH con solo tampone. Includere sempre controlli positivi e negativi sulle piastre composte e diluizioni NADH per la calibrazione sulle piastre di dosaggio. Questi controlli sono estremamente importanti per identificare gli artefatti durante l'analisi dei dati.Utilizzando una pipetta a otto canali, trasferire 20 microlitri delle soluzioni di calibrazione NADH in prima fila in triplicati in una piastra di dosaggio. Ora aggiungete 4,2 microlitri di miosina muscolare scheletrica II al mix enzimatico. Vortice brevemente.Aggiungere la miosina alla miscela enzimatica subito prima dell'erogazione. La lunga incubazione di soluzioni diluite di miosina può comportare una perdita di attività a causa delle precipitazioni e un legame non specifico con le superfici plastiche. Caricare la miscela di enzimi della miosina preparata in uno dei contenitori campione di un distributore automatico.Nella piastra, ad eccezione della prima fila, erogare 8,4 microlitri dell'enzima miosina mescolare in ogni pozzo della piastra di dosaggio. Quindi posizionare la piastra di dosaggio e la piastra composta sui posizionatori labware di un sistema automatizzato di movimentazione dei liquidi dotato di una testa utensile a spillo da 100 nanoliter. Quindi eseguire il metodo appropriato nel software per trasferire 100 nanolitri di soluzioni dalla piastra composta preparata alla piastra di dosaggio.Quindi, posizionare la piastra di dosaggio su uno shaker di micropiastra per agitare per un minuto a temperatura ambiente a 1.200 giri/min. Aggiungere brevemente 4.052 microlitri della soluzione di actina centrifugata alla miscela di substrato e al vortice. Per iniziare la reazione enzimatica, erogare 11,6 microlitri di substrato di actina mescolare in ogni pozzo della piastra di dosaggio utilizzando un distributore automatico, ad eccezione della prima fila.Su uno shaker a micropiastra, agitare la piastra di dosaggio per un minuto a temperatura ambiente a 1.200 giri/min. Centrifugare la piastra di dosaggio a 101 volte g per 30 secondi. Usa un filtro di eccitazione di 380 nanometri, 10 nanometri di larghezza della banda e un filtro di emissione di banda di 470 nanometri e 24 nanometri in combinazione con lo specchio dicroico cutoff da 425 nanometri per i test.Ottimizza il numero di flash, il guadagno del rilevatore, le dimensioni della piastra e l'altezza di misurazione prima di eseguire i test. Eseguire la misurazione in modalità ad alta concentrazione. Assicurarsi che la temperatura interna del lettore di lastre si sia stabilizzata a 25 gradi Celsius.Caricare la piastra nel lettore di lastre e agitare per altri 30 secondi per rendere simile la forma della superficie liquida in ogni pozzo e consentire alla piastra di raggiungere la temperatura di misurazione. Scansionare la piastra a intervalli di 45 secondi e registrare la fluorescenza NADH per 30 minuti. Con i dati esportati, tracciare l'intensità di fluorescenza osservata rispetto al tempo per ogni pozzo.Eseguire una semplice regressione lineare per determinare la pendenza e intercettare le risposte di fluorescenza per ogni pozzo. La pendenza è proporzionale al tasso di consumo di NADH che può essere utilizzato come un'ottima approssimazione del tasso di consumo di ATP. L'intercetta è proporzionale alla concentrazione di NADH all'inizio della misurazione.Quindi, costruire una curva di calibrazione per NADH tracciando le intercette ottenute per la prima riga della piastra contro la concentrazione di NADH. Le intercettazioni stimano le intensità di fluorescenza reale all'inizio con molta più fiducia rispetto alla media dell'intensità di fluorescenza grezza che si legge all'inizio. Eseguire una semplice regressione lineare per ottenere la pendenza e intercettare la linea di calibrazione NADH.Qui, le intercettazioni descrivono il segnale di fondo a fluorescenza senza NADH presente, mentre la pendenza corrisponde all'intensità di fluorescenza teorica estrapolata di una soluzione di NADH molare. Per convertire le variazioni di fluorescenza in tassi di consumo ATP dividere la pendenza della risposta di fluorescenza ottenuta per il resto dei pozzi per la pendenza della linea di calibrazione NADH. Successivamente, tracciare i tassi di consumo di ATP rispetto alla concentrazione dell'inibitore.Per determinare le costanti inibitorie, utilizzare qualsiasi software statistico appropriato in grado di adattarsi a curve non lineari, come Origin 2017. Selezionare la curva non lineare adatta per adattare i dati di risposta alla dose a un'equazione quadratica corrispondente a un semplice modello di equilibrio di legame uno-a-uno. Y è il tasso di consumo ATP.Il minimo Y è il tasso di consumo di ATP in assenza di inibitore. Y-maximum è il tasso di consumo teorico di ATP al 100% di inibizione. t e t sono rispettivamente la concentrazione totale dell'enzima della miosina e dell'inibitore.KI è la costante inibitoria. In questo studio, le reazioni di miosina atpasi muscolare scheletrica e cardiaca II hanno mostrato tracce lineari di intensità di fluorescenza indipendentemente dalla miosina utilizzata o dalla presenza di inibitori. I tassi di ATPasi basali e attivati dall'actina hanno mostrato una dipendenza lineare dalla concentrazione di miosina muscolare scheletrica o cardiaca II.Un coefficiente della finestra di screening o fattore Z di 0,78 ha indicato un saggio affidabile con controlli positivi e negativi molto ben separati.Blebbistatin, para-Amminoblebbistatin e para-Nitroblebbistatin hanno mostrato curve regolari di risposta alla dose a valori di solubilità riportati o inferiori. Le costanti inibitorie sia per le miosinie muscolari cardiache che per le miosinie muscolari scheletriche sono state determinate adattando un'equazione quadratica che rappresenta un semplice modello di legame di equilibrio ai dati. Tracce di intensità di fluorescenza per la blebbistatina ottenute in un saggio ATPasi utilizzando miosina muscolare scheletrica II hanno mostrato un normale segnale decrescente lineare a seconda della quantità di inibitore presente.Tuttavia, al di sopra della solubilità della blebbistatina è stato osservato un aumento inaspettato del segnale molto probabilmente a causa della formazione di cristalli di blebbistatina brillantemente florescenti. Nel caso della para-nitroblebbistatina con tracce normali di intensità di fluorescenza grezza, i tassi di reazione ottenuti al di sopra della solubilità si sono discostati dalla curva di risposta alla dose determinata a causa delle precipitazioni. Utilizzando questo metodo, abbiamo sviluppato nuovi, potenti e selettivi inibitori della miosina che potrebbero essere utilizzati come strumenti scientifici nella ricerca di base o come candidati diretti in futuro.Si consiglia sempre di utilizzare un atpasi diverso o un altro saggio funzionale specifico per l'enzima di interesse per distinguere tra colpi reali e falsi positivi. Tutte le proteine legano superfici plastiche. Questo problema può influenzare molto i risultati, specialmente se la proteina è presente a basse concentrazioni.Evitare sempre una manipolazione non necessaria del liquido e utilizzare tubi non legabili. I saggi alternativi atpasi di solito richiedono la manipolazione di acido solforico, sostanze tossiche o materiali radioattivi. Al contrario, il saggio ATPasi collegato al NADH richiede reagenti senza o solo tossicità molto bassa.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Ricerca

Biochimica

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Screening spettrofotometrico per potenziali inibitori di Glutathione Cytosolic S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Effettuare misurazioni FRET a singola molecola precise e accurate utilizzando l'smfBox open source

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Sviluppo di una striscia immunocromatografica a flusso laterale per la rilevazione rapida e quantitativa di composti di piccole molecole

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...