Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

この研究は、国立神経障害研究所と脳卒中研究所と薬物乱用NS096833(CAM)国立研究所からの助成金によって支援されました。

1. ストックソリューションと試薬の準備
<ol><li>蒸留水中の結晶性DTTを1000mMの最終濃度に溶解することにより、ジチオスレイトール(DTT)ストック溶液を調作する。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。アリコットと-20 °Cで保存します。</li>
	<li>結晶性ATPを蒸留水中に溶解してATPストック溶液を100mMの最終濃度に調出す。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。アリコットと-20 °Cで保存します。</l...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

プロトコルの重要な手順
負の制御のみで複数のプレートを実行することにより、プレートレイアウトを最適化します(阻害剤を使用しないATPase反応)。反応速度のパターンについては、結果を注意深く検査してください。例えば、「非結合」プレートの親水性表面コーティングにおけるエッジ効果および/または欠陥から生じてもよい。パターンが観察される場...

ミオシンは、真核生物1、2のアクチン細胞骨格のフィラメントに沿って方向運動を生成するためにアデノシン三リン酸(ATP)を加水分解するメカノケミカルエネルギートランスデューサである。それらは、オルガネラの輸送、筋肉収縮または細胞骨格緊張1、2の生成のような様々な細胞内機能に構造的およびキネチ的に適応している。ミオシンスーパーファミリーは、ヒトゲノム3、4における〜12個の異なるミオシンクラスに属する〜40個のミオシン遺伝子によって表される。ミオシンクラスのメンバーは、いくつかの癌、神経障害、骨格筋症、肥大型心筋症5、6などの非常に多様な疾患のセットで様々な役割を果たします。これらの分子モータの生理的・病理学的機能が多いため、様々な条件7の薬剤標的としてますます認知されるようになっているのは驚くべきことではない。最近、新しいミオシン阻害剤8、9、10および活性化剤11の発見において著しい進歩がなされ、既存のものの特性を改善する12、13歳,14歳,15.
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、長い間、サルコプラズマ網状Ca2+ポンプATPase16、DNA修復ATPase Rad54 17、AAA+ などの様々な酵素のATPase活性を測定するために使用されてきました。ATPase p9718または微小管モーターキネシン19.アッセイはATP再生サイクルを採用しています。ATPaseによって生成されたアデノシン二リン酸(ADP)は、ピルビン酸キナーゼ(PK)によってATPに再生され、1分子のホスホエノールピルビン酸(PEP)を平行にピルビン酸に変換します。続いて、ピルビン酸は乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって乳酸に還元される。つまり、NADHの1分子をNADに酸化する。従って、時間の関数としてのNADH濃度の低下はATP加水分解速度に等しい。ATP再生サイクルは、PEP が使用可能である限り、ATP 濃度をほぼ一定に保ち、ADP 濃度を低くします。これは、線形時間コースで、初期反応速度を決定することが容易になり、ADP19による製品阻害を回避するのに役立ちます。NADH結合ATPaseアッセイは既に96ウェルフォーマット20に適合していますが、反応量が多い(約150μL)ため、試薬の需要が高いため比較的高価であり、多数の高速スクリーニングに対応しにくくなります。化合 物。ATPase酵素によって産生されるリン酸塩の検出に依存するマラカイトグリーンアッセイ19、21などの代替方法は、小型化およびハイスループットスクリーニング22に適っていることが証明された。,23歳,24.しかし、エンドポイントアッセイは、フルタイムのコースがない場合に未発見のままであるいくつかのアーティファクト(以下で説明)の影響を受ける可能性が高いです。
ここで、NADH結合ATPaseアッセイは、低分子阻害剤の半高スループットスクリーニング用に最適化されている。骨格および心筋ミオシンIIとミオシン阻害剤ブレビスタチン8、パラ-アミノブルビスタチン13およびパラ-軽トブルビスタチン12は、NADHに依存するアッセイの力を実証するために使用される読み出しとしての蛍光。このプロトコルは、任意のADP産生酵素に焦点を当てたプロジェクトをスクリーニングするのに適しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

ATPase酵素は、アデノシン三リン酸に蓄積されたフリーエネルギーを利用して、自然に発生しない生体内生化学的プロセスの多種多様を触媒します。これらのタンパク質は、代謝、細胞分裂、環境変化や動きへの応答を含む、本質的に細胞生活のすべての側面に不可欠です。ここで提示されるプロトコルは、低分子ATPase阻害剤の半高スループットスクリーニングに適合したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイについて説明する。このアッセイは、原理の証明として、心臓および骨格筋ミオシンII、2つのアクチン系分子運動ATPasesに適用されている。ATPの加水分解は、アッセイ中の酵素反応によるNADHの酸化に結合する。まず、ATPaseによって生成されたADPは、ピルビン酸キナーゼ(PK)によってATPに再生される。PKは、リンフェノールピルビン酸(PEP)からピルビン酸への移行を並行して触媒する。続いて、ピルビン酸は乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって乳酸に減少し、これはNADHの酸化を並行して触媒する。したがって、ATP濃度の低下は、NADH濃度の低下と直接相関し、それに続いてNADHの本質的な蛍光への変化が続く。PEPが反応系で利用可能である限り、ADP濃度は非常に低いままで、独自の製品によるATPase酵素の阻害を回避する。さらに、ATP濃度はほぼ一定のままであり、線形時間コースを生み出します。蛍光は連続的に監視され、データの品質を容易に推定でき、潜在的なアーティファクト(例えば、化合物の沈殿や熱変化に起因する)をフィルタリングするのに役立ちます。

スクリーニング実験に使用される一般的なプレートレイアウトマップを図 1に示します。最初と最後の行は、NADHキャリブレーションと正の制御(20 μMパラ-アミノーブルビスタチン、0.5%DMSO)のためにそれぞれ予約されています。残りの行(BからO)は、化合物の阻害活性をテストするために使用されます。ここで、DMSO中の10mM化合物濃度から始?...

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A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、低分子ミオシン阻害剤の半高スループットスクリーニングに適合した。この運動アッセイは、384ウェルマイクロプレートフォーマットで実行され、総反応量はウェルあたりわずか20μLです。プラットフォームは、事実上すべてのADP産生酵素に適用可能でなければなりません。

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

このプロトコルは、基礎研究のためのプローブまたは潜在的な臨床化合物のためのプローブとして、ATPase阻害剤の開発を目的とした幅広いスクリーニングプロジェクトに適用可能です。この方法は、半ハイスループットスクリーニングアプリケーション用に最適化されています。また、いくつかの一般的なアーティファクトを避けるように設計されており、危険物の取り扱いを必要としません。私たちの研究室では、メタンフェタミン使用障害の治療のための新しい、特定の非筋肉ミオシンII阻害剤を開発するために、このアッセイを使用しています.理論的には、この方法は、ATPを産生する任意の酵素に容易に適用することができる。視覚的なデモンストレーションは、すべての重要な技術的詳細を明確にするのに役立ちます。まず、濃縮アクチンストック溶液をアクチンバッファーに希釈して、384ウェル黒ポリスチレンマイクロプレートごとに4,500マイクロモル希釈アクチン溶液を調製します。上下に30回ピペットして溶液を完全に混合し、粘度と不均一性を低下させるアクチンフィラメントを破ります。次いで、溶液を遠心分離し、存在する任意の沈殿タンパク質を除去する。上清をきれいな遠心管に慎重に移します。骨格筋ミオシンII、LDH溶液171.4マイクロリットル、および171.4マイクロリットルのPK溶液を含むアッセイ用のミオシンバッファー3、252.9マイクロリットルを組み合わせることにより、各アッセイプレート用の15ミリリットル円錐形遠心分離管にマスター酵素ミックスを調製します。15ミリリットルの円錐形遠心分離チューブに、162.1マイクロリットルのATP、162.1マイクロリットルのPEP、および324.1マイクロリットルのNADH溶液を組み合わせて、マスター基板ミックスをプレートごとに用意します。凝集や沈殿を避けるために、この時点でアクチンを追加しないでください。キャリブレーション用にNADHの7ステップのシリアル1対2希釈を作成するには、8つの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを調製します。12.3マイクロリットルのNADHストック溶液を最初のチューブに257.7マイクロリットルのミオシンバッファーと混合し、250マイクロモル溶液を作ります。次に、135マイクロリットルのミオシンバッファーを残りの7つのチューブのそれぞれにアリコートする。1番目のチューブから溶液の135マイクロリットルを第2のチューブに移し、ピペットで混合する。7番目のチューブに到達するまで繰り返します。最後のチューブを、バッファのみで NADH コントロールとして使用します。コンパウンドプレートには正と負のコントロールが常に含まれ、アッセイプレートの校正用NADH希釈剤も含まれます。これらのコントロールは、データ分析中にアーティファクトを識別するうえで非常に重要です。8チャンネルピペットを使用して、NADHキャリブレーション溶液の20マイクロリットルをアッセイプレートの三倍位に入れ、最初の行に移します。今酵素ミックスに骨格筋ミオシンIIの4.2マイクロリットルを追加します。渦は簡単に。分剤を出す直前に酵素ミックスにミオシンを加えます。希釈されたミオシン溶液の長いインキュベーションは、沈殿による活性の損失をもたらし、プラスチック表面への非特異的結合をもたらす可能性がある。調製したミオシン酵素ミックスを自動ディスペンサーのサンプル容器の1つにロードします。プレートでは、最初の行を除き、8.4マイクロリットルのミオシン酵素をアッセイプレートの各ウェルに分配する。次に、アッセイプレートとコンパウンドプレートを、100ナノリットルのピンツールヘッドを装備した自動液体ハンドリングシステムのラボウェアポジショナに配置します。次に、ソフトウェアで適切な方法を実行し、調製した化合物プレートからアッセイプレートに100ナノリットルの溶液を移す。次に、マイクロプレートシェーカーの上にアッセイプレートを置き、室温で1分、200rpmで振ります。基板ミックスと渦に4,052マイクロリットルの遠心アクチン溶液を簡単に加えます。酵素反応を開始するには、1行目を除く自動ディスペンサーを使用して、11.6マイクロリットルのアクチン基板をアッセイプレートの各ウェルに分配します。マイクロプレートシェーカーで、アッセイプレートを室温で1、200rpmで1分間振ります。アッセイプレートを101回gで30秒間遠心分離する。アッセイには、380ナノメートル、10ナノメートルのバンド幅励起フィルタ、470ナノメートル、24ナノメートルのバンド幅放出フィルタを425ナノメートルのカットオフ二色ミラーと組み合わせて使用します。アッセイを実行する前に、フラッシュ、検出器ゲイン、プレート寸法、測定高さの数を最適化します。高濃度モードで測定を実行します。プレートリーダーの内温度が25°Cで安定していることを確認します。プレートをプレートリーダーにロードし、さらに30秒間振って、各ウェルで液体表面の形状を類似させ、プレートが測定温度に達できるようにします。プレートを45秒間隔でスキャンし、NADH蛍光を30分間記録します。エクスポートされたデータを使用して、観察された蛍光強度を各ウェルの時間に対してプロットします。単純な線形回帰を実行して、各ウェルの蛍光応答の傾きと切片を決定します。傾斜は、ATP 消費率の非常に良い近似として使用できる NADH の消費率に比例します。切片は、測定開始時のNADH濃度に比例します。次に、プレートの第1行に対して得られたインターセプトをNADHの濃度に対してプロットしてNADHの較正曲線を構築する。インターセプトは、最初の蛍光強度の読み取りの平均よりもはるかに自信を持って、最初の蛍光強度を推定します。NADHキャリブレーションラインの傾きと切片を取得するために、単純な線形回帰を実行します。ここで、インターセプトはNADHが存在しない蛍光バックグラウンド信号を説明し、斜面は1モルNADH溶液の外挿された理論的蛍光強度に対応する。蛍光変化をATP消費速度に変換するために、残りのウェルについて得られた蛍光応答の傾きをNADHキャリブレーションラインの傾きで分割します。次に、阻害剤の濃度に対するATP消費率をプロットする。阻害定数を決定するには、Origin 2017 など、非線形曲線適合が可能な適切な統計ソフトウェアを使用します。単純な 1 対 1 の結合平衡モデルに対応する 2 次方程式に線量応答データを適合させるために、非線形曲線適合を選択します。Y は、ATP 消費率です。Y-最小は阻害剤の不在時のATP消費率である。Y-最大は、100%阻害での理論的なATP消費率です。tとtは、それぞれミオシン酵素および阻害剤の総濃度である。KIは、阻害定数である。本研究では、骨格筋および心筋ミオシンII ATPase反応は、使用されたミオシンまたは阻害剤の存在に関係なく、直線的な蛍光強度トレースを示した。基底およびアクチン活性化ATPase率は、骨格筋または心筋ミオシンII.Aスクリーニングウィンドウ係数または0.78のZファクターの濃度に直線的に依存を示し、非常によく分離された陽性および陰性対照を有する信頼できるアッセイを示した。ブレビスタチン、パラ-アミノブレビスタチン、およびパラニトロブレビスタチンは、報告された溶解度値以下で定期的な用量応答曲線を示した。心臓および骨格筋筋の両方の抑制定数は、データに単純平衡結合モデルを表す二次方程式を適合させることによって決定した。骨格筋ミオシンIIを用いたATPaseアッセイで得られたブレビスタチンの蛍光強度トレースは、存在する阻害剤の量に応じて正常に直線的に減少するシグナルを示した。しかし、ブレビスタチンの溶解度を上回る信号の予想外の増加は、明るい花性ブレビスタチン結晶の形成に起因する可能性が最も高い。正常生蛍光強度トレースを有するパラニトロブレビスタチンの場合、上記の溶解度は沈殿による測定用量応答曲線から発散した反応速度である。この方法を用いることで、基礎研究の科学的ツールとして、または将来の直接的な候補として使用される可能性のある新しい、強力な、選択的なミオシン阻害剤を開発しました。実際の陽性ヒットと偽陽性のヒットを区別するために、関心のある酵素に固有の異なるATPaseまたは他の機能アッセイを使用することが常に推奨されます。すべてのタンパク質はプラスチック表面を結合します。この問題は、特にタンパク質が低濃度で存在する場合、結果に大きく影響を与える可能性があります。不必要な液体の取り扱いを避け、非結合の管を使用する。代替ATPaseアッセイは、通常、硫酸、有毒物質または放射性物質の取り扱いを必要とする。対照的に、NADH結合ATPaseアッセイは、毒性がまったくないか、または非常に低い試薬を必要とします。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

サーモトガ・マリティマ・メンブレン結合ピロホスファターゼ阻害剤のスクリーニング

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

細胞細胞性グルタチオンSトランスレセファーゼの潜在的阻害剤に対する分光測定法

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

オープンソースsmfBoxを使用して、正確で正確な単一分子フレット測定を行う

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

小分子化合物の迅速・定量的検出用横流イムノクロマトグラフィーストリップの開発

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...