Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

이 작품은 약물 남용 NS096833 (CAM)에 대한 신경 장애 및 뇌졸중및 국립 연구소의 보조금에 의해 지원되었다.

1. 재고 솔루션 및 시약 준비
<ol><li>증류수에서 결정성 DTT를 1000 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 디티오트레이톨(DTT) 스톡 용액을 준비한다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	<li>증류수에서 결정성 ATP를 100 mM의 최종 농도로 용해시켜 ATP 스톡 솔루션을 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	<...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

프로토콜의 중요한 단계
음의 제어만 있는 여러 플레이트(억제제 없는 ATPase 반응)를 실행하여 플레이트 레이아웃을 최적화합니다. 반응 속도의 패턴을 신중하게 검사합니다. 예를 들어, 이들은 "비 바인딩"플레이트의 친수성 표면 코팅의 가장자리 효과 및 / 또는 결함에서 발생할 수 있습니다. 패턴이 관찰되면 아티팩트를 최소화하기 위해 플레이트 유형 및/또는 ...

묘신은 진핵생물1,2에서액틴 세포골격의 필라멘트를 따라 방향운동을 생성하기 위해 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 가수분해하는 메카노케미컬 에너지 트랜스듀서이다. 그(것)들은 세포기관의 수송, 근육 수축 또는 세포골격 긴장의 생성과 같은 그들의 각종 세포내 기능에 구조적으로 그리고 운동적으로 적응한1,2. 상기 미오신 수퍼패밀리는 인간 게놈3,4에서~12개의 뚜렷한 묘신 클래스에 속하는 ~40개의 미오신 유전자로 나타난다. 미오신 클래스의 구성원은 여러 암, 신경 장애, 골격 근병증 및 비대성 심근병증5,6과같은 매우 다양한 장애 세트에서 다양한 역할을 한다. 이러한 분자 모터의 많은 생리적 및 병리학적 기능을 감안할 때, 다양한 조건에 대한 약물 표적으로 점점인식되고 있는 것은 놀라운 일이 아니다 7. 최근 새로운 미오신 억제제8,9,10 및 활성제11의발견에 상당한 진전이 이루어졌으며, 기존 12의 특성을개선하고, 13세 , 14세 , 15.
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 ATPase 분석기는 오랫동안 사르코플라스 망상 Ca2+ 펌프 ATPase16,DNA 수리 ATPase Rad5417,AAA+와 같은 다양한 효소의 ATPase 활성을 측정하는 데 사용되어 왔습니다. ATPase p9718 또는 미세소관 모터 키네신19. 이 분석은 ATP 재생 주기를 사용합니다. ATPase에 의해 생성된 아데노신 디포스페이트(ADP)는 피루바테 키나아제(PK)에 의해 ATP로 재생되며, 이는 인산피루바트(PEP)의 한 분자를 병렬로 피루베이트로 변형시킵니다. 그 후, 피루브산염은 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 젖산으로 감소됩니다. 즉, 차례로, NAD에 NADH의 한 분자를 산화. 따라서, 시간의 함수로서 NADH 농도의 감소는 ATP 가수분해 속도와 같다. ATP 재생 주기는 PEP를 사용할 수 있는 한 ATP 농도를 거의 일정하게 유지하고 ADP 농도를 낮게 유지합니다. 이것은 선형 시간 과정을 초래, 쉽게 초기 반응 속도를 결정하고 ADP19에의해 제품 억제를 방지하는 데 도움이. NADH 결합 ATPase 분석은 이미 96 웰 포맷20에적응되었지만, 높은 반응 량 (~150 μL)은 시약의 높은 수요로 인해 상대적으로 비싸므로 많은 수의 빠른 스크리닝이 덜 가능합니다. 화합물. ATPase 효소에 의해 생성된 인산염의 검출에 의존하는 말라카이트 녹색 분석법19,21과같은 대체 방법은 소형화 및 고처리량 스크리닝(22)에 더 적합한 것으로 입증되었습니다. , 23세 , 24. 그러나 끝점 분석기는 풀 타임 과정이 없는 상태에서 발견되지 않은 상태로 남아있을 수있는 여러 유물 (아래에 설명됨)의 영향을받을 가능성이 높습니다.
여기서, NADH-결합 된 ATPase 분석기는 소분자 억제제의 반 높은 처리량 스크리닝에 최적화되었습니다. 골격 및 심장 근육 myosin II와 myosin 억제제 blebbistatin8, 파라-aminoblebbistatin13 및 파라-nitroblebbistatin12 는 NADH에 의존하는 분석의 힘을 입증하기 위하여 이용됩니다 판독으로 형광. 이 프로토콜은 모든 ADP 생산 효소에 초점을 맞춘 스크리닝 프로젝트에 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

ATPase 효소는 아데노신 삼인산에 저장된 자유 에너지를 활용하여 자발적으로 발생하지 않는 생체 내 다양한 엔더고닉 생화학 적 과정을 촉매합니다. 이 단백질은 물질 대사, 세포 분열, 환경 변화 및 운동에 대한 반응을 포함하여 세포 생활의 본질적으로 모든 측면에 중요합니다. 여기서 제시된 프로토콜은 소분자 ATPase 억제제의 반높은 처리량 스크리닝에 적응된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합된 ATPase 분석법을 기술한다. 이 분석법은 심장 및 골격 근 myosin II의, 원리의 증거로, 2개의 액틴 기지를 둔 분자 모터 ATPases에 적용되었습니다. ATP의 가수분해는 분석에서 효소 반응에 의해 NADH의 산화에 결합된다. 먼저, ATPase에 의해 생성된 ADP는 피루바테 키나아제(PK)에 의해 ATP로 재생성된다. PK는 포스포네놀피루바트(PEP)의 전이를 병렬로 피루브화로 촉매한다. 그 후, 피루브산은 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 젖산으로 감소되어 NADH의 산화를 병렬로 촉매합니다. 따라서, ATP 농도의 감소는 NADH 농도의 감소와 직접적으로 상관되며, 이는 NADH의 본질적인 형광에 대한 변화에 뒤따른다. PEP가 반응 시스템에서 사용할 수 있는 한, ADP 농도는 매우 낮게 유지되어 자체 제품에 의한 ATPase 효소의 억제를 피합니다. 또한 ATP 농도는 거의 일정하게 유지되어 선형 시간 코스를 생성합니다. 형광은 지속적으로 모니터링되어 데이터 품질을 쉽게 추정할 수 있으며 잠재적인 아티팩트(예: 복합 침전 또는 열 변화로 인한)를 필터링하는 데 도움이 됩니다.

선별 실험에 사용되는 일반적인 플레이트 레이아웃 맵은 그림1에 나와 있습니다. 첫 번째 행과 마지막 행은 NADH 교정 및 양성 제어(각각 20 μM para-aminoblebbistatin, 0.5% DMSO)를 위해 예약되어 있습니다. 나머지 행(B~O)은 화합물의 억제 활성을 테스트하는 데 사용된다. 여기서, 15단계 직렬 1:2 희석은 DMSO에서 10 mM 화합물 농도로부터 시작하여 화합물 ?...

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A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

이 프로토콜은 기본 연구를 위한 프로브 또는 잠재적인 임상 화합물을 위한 조사로 ATPase 억제제 개발을 목표로 하는 광범위한 선별 프로젝트에 적용됩니다. 이 방법은 반 고처리량 스크리닝 애플리케이션에 최적화되어 있습니다. 또한 여러 가지 일반적인 유물을 피하도록 설계되었으며 유해 물질 취급이 필요하지 않습니다.우리의 실험실에서 우리는 메담페타민 사용 장애의 치료를위한 새롭고 특정 비 근육 myosin II 억제제를 개발하기 위해이 분석체를 사용하고있다. 이론적으로, 이 방법은 ATP를 생성하는 모든 효소에 쉽게 적용될 수 있다. 시각적 데모는 모든 중요한 기술적 세부 사항을 명확히 하는 데 도움이 됩니다.먼저 액틴 버퍼에 농축액틴 스톡 용액을 희석시킴으로써 각각 384웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트에 대해 20마이크로몰라 희석 액틴 액틴 용액4, 500 마이크로리터를 준비한다. 점도와 이질성을 줄이기 위한 액틴 필라멘트를 깨기 위해 30회 위아래로 파이프를 사용하여 솔루션을 철저히 섞습니다. 그런 다음 면소한 단백질을 제거하기 위한 용액을 원심분리합니다.상체를 깨끗한 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기십시오. 골격 근 근 근 II, 171.4 마이크로리터 및 PK 용액의 171.4 마이크로리터를 포함하는 분석법에 대한 미산 완충제의 3, 252.9 마이크로리터를 결합하여 각 분석 플레이트에 대한 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 마스터 효소 믹스를 준비한다. ATP 162.1 마이크로리터, PEP 162.1 마이크로리터, NADH 용액324.1 마이크로리터를 결합하여 각 플레이트에 대해 15밀리리터 원심분리기 튜브에 마스터 기판 믹스를 준비한다.집계 및 침전을 피하기 위해 이 시점에서 액틴을 추가하지 마십시오. 교정을 위해 NADH의 7단계 직렬 1대2 희석제를 만들려면 8개의 1.5밀리리터 미세원심분리관을 준비하십시오. NADH 스톡 용액 12.3 마이크로리터를 첫 번째 튜브에 미오신 버퍼 257.7 마이크로리터와 혼합하여 250 마이크로몰라 용액을 만듭니다.그런 다음 미오신 버퍼135마이크로리터를 나머지 7개의 튜브에 각각 넣습니다. 제1 튜브에서 두 번째로 용액의 135 마이크로리터를 옮기고 파이펫팅하여 혼합합니다. 일곱 번째 튜브에 도달할 때까지 반복합니다.마지막 튜브를 버퍼만 사용하여 NADH 컨트롤이 없는 경우 를 사용합니다. 항상 화합물 플레이트에 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함하고, 분석 플레이트에 교정을 위한 NADH 희석제. 이러한 컨트롤은 데이터 분석 중에 아티팩트를 식별하는 데 매우 중요합니다.8채널 파이펫을 사용하여 NADH 교정 솔루션의 20마이크로리터를 분석 플레이트의 첫 번째 행으로 옮킨다. 이제 효소 믹스에 골격 근 미오신 II의 4.2 마이크로 리터를 추가합니다. 소용돌이가 짧게.분배 하기 직전에 효소 믹스에 myosin를 추가 합니다. 희석된 myosin 솔루션의 긴 잠복은 침수로 인한 활동 손실, 플라스틱 표면에 대한 비특이적 결합을 초래할 수 있습니다. 준비된 미오신 효소 믹스를 자동 디스펜서의 샘플 용기 중 하나에 적재합니다.플레이트에서, 첫 번째 행을 제외하고, 미오신 효소의 8.4 마이크로리터를 분석 플레이트의 각 웰에 분배한다. 그런 다음 분석 플레이트와 복합 플레이트를 100 나노리터 핀 공구 헤드가 장착된 자동화된 액체 처리 시스템의 실험실웨어 포지셔너에 놓습니다. 그런 다음 소프트웨어에서 100 나노리터의 용액을 제조된 화합물 플레이트에서 분석 플레이트로 전송하는 적절한 방법을 실행한다.다음으로, 마이크로 플레이트 셰이커에 분석 판을 놓고 실온에서 1 분 동안 흔들어 1, 200 rpm. 기판 혼합 및 소용돌이에 원심 분리 액틴 용액의 4, 052 마이크로리터를 간략하게 추가합니다. 효소 반응을 시작하려면, 첫 번째 행을 제외하고, 자동 디스펜서를 사용하여 분석 플레이트의 각 웰에 액틴 기판 믹스의 11.6 마이크로리터를 분배한다.마이크로 플레이트 셰이커에서 1, 200 rpm에서 실온에서 1 분 동안 분석 판을 흔들어보십시오. 분석 플레이트를 101배 g에서 30초 동안 원심분리합니다. 380나노미터, 10나노미터 대역 폭 발산 필터, 470나노미터 대역 폭 방출 필터, 24나노미터 대역 폭 방출 필터를 425나노미터 컷오프 이차성 거울과 함께 사용한다.에세이를 실행하기 전에 깜박임, 검출기 게인, 플레이트 치수 및 측정 높이수를 최적화합니다. 고농도 모드에서 측정을 실행합니다. 플레이트 판독기의 내온이 섭씨 25도에서 안정되었는지 확인하십시오.플레이트 판독기에 플레이트를 적재하고 30초 동안 흔들어 액체 표면의 모양을 각 우물에서 유사하게 만들고 플레이트가 측정 온도에 도달할 수 있도록 합니다. 45초 간격으로 플레이트를 스캔하고 NADH 형광을 30분 동안 기록합니다. 내보낸 데이터를 사용하여 각 웰에 대해 시간에 대해 관찰된 형광 강도를 플롯합니다.간단한 선형 회귀를 수행하여 각 웰에 대한 형광 반응의 경사 및 가로채기를 결정합니다. 경사는 ATP 소비속도의 근사치로 사용될 수 있는 NADH 소비속도에 비례한다. 요격은 측정 의 시작 부분에 NADH 농도에 비례한다.이어서, NADH의 농도에 대하여 플레이트의 첫 번째 행에 대해 얻어진 요격을 플로팅하여 NADH에 대한 교정 곡선을 구성한다. 요격은 처음에 읽는 원시 형광 강도의 평균보다 훨씬 더 자신감으로 처음에 실제 형광 강도를 추정합니다. 간단한 선형 회귀를 수행하여 NADH 교정 선의 경사 및 가로채기를 가져옵니다.여기서, 차단은 NADH가 없는 형광 배경 신호를 설명하고, 경사는 하나의 어금음 NADH 용액의 추정된 이론형 형광 강도에 해당한다. 형광 변화를 ATP 소비속도로 변환하기 위해 NADH 교정 라인의 경사에 의해 나머지 우물에 대해 얻어진 형광 반응의 경사를 나눕니다. 다음으로, 억제제의 농도에 대해 ATP 소비속도를 플롯한다.억제 상수를 확인하려면 Origin 2017과 같이 비선형 곡선 피팅이 가능한 적절한 통계 소프트웨어를 사용하십시오. 간단한 일대일 결합 평형 모델에 대응하는 이차 방정식에 용량 반응 데이터에 맞게 비선형 곡선 을 선택합니다. Y는 ATP 소비율입니다.Y-최소는 억제제가 없는 경우 ATP 소비율이다. Y-최대는 이론ATP 소비율 100%억제이다. t 와 t는 각각 미신 효소 및 억제제의 총 농도이다.KI는 억제 상수입니다. 이 연구에서는, 골격 및 심장 근육 myosin II ATPase 반응은 사용된 미오신 또는 억제제의 존재에 관계없이 선형 형광 강도 의 흔적을 보였다. 기저 및 액틴 활성화 ATPase 속도는 골격 또는 심장 근육 myosin II.A 스크리닝 윈도우 계수 또는 0.78의 Z 계수의 농도에 선형 의존성을 보였다 매우 잘 분리 된 긍정적이고 부정적인 제어와 신뢰할 수있는 분석법을 나타냈다.Blebbistatin, 파라 아미노블비스타틴, 그리고 파라 니트로블비스타틴은 보고된 용해도 값 이하의 정기적인 투여량 반응 곡선을 보였습니다. 심장 및 골격 근 근 근 모두에 대한 억제 상수는 데이터에 간단한 평형 결합 모델을 나타내는 이차 방정식을 피팅하여 결정되었다. 골격 근 근 근 II를 사용 하 여 ATPase 분석에서 얻은 blebbistatin에 대 한 형광 강도 추적 존재 억제제의 양에 따라 정상적인 선형 감소 신호를 보였다.그러나, 블리스타틴의 용해도 이상으로 신호의 예기치 않은 증가가 밝은 플로레스센트 블비스타틴 결정의 형성으로 인해 가장 가능성이 높은 것으로 관찰되었다. 정상적인 생 형광 강도 추적을 가진 파라-니트로블비스타틴의 경우, 강수량으로 인해 결정된 투여량 반응 곡선으로부터 용해도 이상으로 얻어진 반응 속도가 발산된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 기본 연구에서 과학 도구로 또는 미래에 직접 후보로 사용될 수있는 새로운, 강력하고 선택적 myosin 억제제를 개발했다.그것은 항상 다른 ATPase 또는 실제와 거짓 긍정적인 안타를 구별 하는 관심의 효소에 특정 다른 기능 적인 분석 사용 하는 것이 좋습니다. 모든 단백질은 플라스틱 표면을 결합합니다. 이 문제는 특히 단백질이 낮은 농도에서 존재하는 경우에 결과에 크게 영향을 미칠 수 있습니다.항상 불필요한 액체 처리를 피하고 구속력이 없는 튜브를 사용하십시오. 대체 ATPase 어약은 일반적으로 황산, 독성 물질 또는 방사성 물질의 취급이 필요합니다. 대조적으로, NADH 연결 ATPase 분석법은 독성이 없거나 매우 낮은 시약을 필요로합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

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써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝

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소분자 화합물의 신속하고 정량적 검출을 위한 측면 흐름 면역크로모그래피 스트립 개발

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Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...