Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag og nasjonalt Institutt for narkotikamisbruk NS096833 (CAM).

1. klargjøre lager løsninger og reagenser
<ol><li>Forbered dithiotreitol (DTT) lagerløsning ved å oppløse krystallinsk DTT i destillert vann til en endelig konsentrasjon på 1000 mM. Juster pH til 7,0 med 1 M NaOH-oppløsning. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.</li>
	<li>Forbered ATP lagerløsning ved å oppløse krystallinsk ATP i destillert vann til en endelig konsentrasjon av 100 mM. Juster pH til 7,0 med 1 M NaOH-oppløsning. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.</li>
	<li>Forbered 10x NADH buffer som inneholder ...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

Kritiske trinn i protokollen
Optimaliser plate layout ved å kjøre flere plater med negativ kontroll bare (ATPase reaksjon uten inhibitor). Inspiser resultatene nøye for mønstre i reaksjons rater. For eksempel kan disse oppstå fra kanteffekter og/eller ufullkommenheter i hydrofile overflatebelegg av "ikke-bindende" plater. Hvis et mønster er observert, endre platetype og/eller plate layout for å minimere artefakter. For eksempel kan en typisk dose respons kurve (16 konse...

Myosins er mekanokjemiske energi-transdusere som hydrolyserer adenosin trifosfat (ATP) til å generere retningsbestemt bevegelse langs filamenter av utgangen cytoskeleton i Landplantenes1,2. De har både strukturelt og Kinetically tilpasset sine ulike intracellulære funksjoner, slik som transport av organeller, muskel sammentrekning eller generering av cytoskjelettkomponenter penning1,2. Den myosin overfamilie er representert ved ~ 40 myosin gener som tilhører ~ 12 distinkte myosin klasser i den menneskelige Genova3,4. Medlemmer av myosin klassene spille ulike roller i et svært mangfoldig sett av lidelser, for eksempel flere kreftformer, nevrologiske lidelser, skjelettlidelser myopatier, og hypertrofisk kardiomyopati5,6. Gitt det store antall fysiologiske og patologiske funksjoner av disse molekylære motorene, er det ikke overraskende at de blir stadig mer anerkjent som narkotika mål for en rekke forhold7. Betydelig fremgang har blitt gjort nylig i oppdagelsen av nye myosin hemmere8,9,10 og aktivator11, og for å forbedre egenskapene til eksisterende12, 13 på alle , 14 priser og priser , 15av dem.
Den nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-kombinert ATPase analysen har lenge vært brukt til å måle ATPase aktiviteten av ulike enzymer, slik som sarcoplasmic retikulum ca2 + Pump ATPase16, DNA reparasjon ATPASE Rad5417, AAA + ATPase p9718 eller mikrotubulinettverket motoren kinesin19. Analysen sysselsetter en ATP gjenfødelse syklus. Adenosin uridindifosfatglukuronosyltransferase (ADP) generert av ATPase, genereres på ATP ved pyruvat kinase (PK), som forvandler ett molekyl av phosphoenolpyruvate (PEP) til pyruvat parallelt. Deretter reduseres pyruvat til melkesyre dehydrogenase (LDH). Det i sin tur oksiderer ett molekyl av NADH til NAD. Derfor tilsvarer reduksjonen i NADH-konsentrasjonen som en funksjon av tid ATP hydrolyse rate. ATP gjenfødelse syklusen holder ATP konsentrasjonen nesten konstant og ADP konsentrasjon lavt så lenge PEP er tilgjengelig. Dette resulterer i lineær tid kurs, noe som gjør det enkelt å bestemme de første reaksjons hastigheter og bidrar til å unngå produkt hemming av ADP19. Selv om den NADH-sammenkoblede ATPase-analysen allerede er tilpasset et 96-format20, gjør høy reaksjons volumene (~ 150 μL) det relativt dyrt på grunn av den høye etterspørselen av reagenser, noe som gir det mindre mottagelig for rask screening av et stort antall Forbindelser. Alternative metoder, slik som malakitt grønne analysen19,21, som er avhengig av påvisning av fosfat produsert av ATPase enzymet, ble påvist mer egnet for miniatyrisering og høy gjennomstrømming screening22 , 23 andre , 24. imidlertid er et endepunkt analysen mer sannsynlig å bli påvirket av flere gjenstander (omtalt nedenfor), som kan forbli uoppdaget i fravær av heltidskurs.
Her har NADH-koplet ATPase analysen er optimalisert for semi-høy gjennomstrømming screening av små molekyl hemmere. Skjelettlidelser og hjerte muskel myosin II og myosin hemmere blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 og para-nitroblebbistatin12 brukes til å demonstrere kraften i analysen, som er avhengig av NADH fluorescens som en avlesning. Denne protokollen er mottagelig for screening prosjekter fokusert på alle ADP produsere enzymer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

ATPase enzymer utnytte den frie energien som er lagret i adenosin trifosfat å katalysere et bredt utvalg av endergon biokjemiske prosesser in vivo som ikke ville oppstå spontant. Disse proteinene er avgjørende for i hovedsak alle aspekter av mobilnettet liv, inkludert metabolisme, celledeling, tiltak mot miljømessige endringer og bevegelse. Protokollen som presenteres her beskriver en nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-kombinert ATPase analysen som har blitt tilpasset semi-høy gjennomstrømming screening av små molekyl ATPase hemmere. Analysen har blitt brukt til CARDIAC og skjelettlidelser muskel myosin II ' s, to utgangen-baserte molekylær motor ATPases, som et bevis på prinsippet. Hydrolyse av ATP er koplet til oksidasjon av NADH ved enzymatisk reaksjoner i analysen. Først genereres ADP av ATPase til ATP ved pyruvat kinase (PK). PK katalyserer overgangen av phosphoenolpyruvate (PEP) til pyruvat parallelt. Deretter reduseres pyruvat til melkesyre dehydrogenase (LDH), som katalyserer oksidasjon av NADH parallelt. Dermed er reduksjonen i ATP konsentrasjon direkte korrelert til nedgangen i NADH konsentrasjon, som etterfølges av endring i iboende fluorescens av NADH. Så lenge PEP er tilgjengelig i reaksjonssystemet, er ADP-konsentrasjonen fortsatt svært lav, og unngår hemming av ATPase-enzymet ved sitt eget produkt. Videre forblir ATP konsentrasjonen nesten konstant, noe som gir lineær tid kurs. Fluorescens overvåkes kontinuerlig, noe som gjør det mulig for enkel estimering av kvaliteten på dataene og bidrar til å filtrere ut potensielle artefakter (for eksempel som følge av sammensatte nedbørsmengder eller termiske endringer).

Den typiske plate layout kart som brukes for screening eksperimenter er vist i figur 1. Den første og siste radene er reservert for NADH kalibrering og positiv kontroll (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), henholdsvis. De resterende radene (B til O) brukes til å teste hemmende aktivitet av forbindelser. Her femten-trinns seriell 1:2 fortynninger starter fra 10 mM sammensatte konsentrasjon i DMSO er forberedt og overført fra den sammensatte ...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere

En nikotinamid adenine dinucleotide (NADH)-koblet ATPase analysen har blitt tilpasset semihigh gjennomstrømning screening av små molekyl myosin hemmere. Denne kinetisk analysen kjøres i et 384-brønn mikroplate format med totalt reaksjons volum på bare 20 μL per brønn. Plattformen bør være aktuelt for nesten alle ADP produserende enzym.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Denne protokollen gjelder for et bredt spekter av screeningprosjekter som tar sikte på å utvikle ATPase-hemmere, enten som sonder for grunnleggende forskning eller for potensielle kliniske forbindelser. Denne metoden er optimalisert for semi-high-throughput screening applikasjoner. Den er også designet for å unngå flere vanlige gjenstander, og det krever ikke håndtering av farlige materialer.I vårt laboratorium har vi brukt denne analysen til å utvikle nye og spesifikke ikke-muskel myosin II hemmere for behandling av metamfetamin bruk lidelse. I teorien kan denne metoden enkelt brukes på noen enzymer som produserer ATP. Visuell demonstrasjon bidrar til å klargjøre alle viktige tekniske detaljer.Til å begynne med, klargjør 4500 mikroliter med 20 mikromos fortynnet actinløsning for hver 384-brønns svarte polystyrenmikroplate ved å fortynne den konsentrerte actin lagerløsningen i actinbuffer. Bland oppløsningen grundig ved å pipetter opp og ned 30 ganger for å bryte actin filamenter for å redusere viskositet og heterogenitet. Sentrifuger deretter løsningen for å fjerne ethvert utfelt protein tilstede.Overfør overnatanten forsiktig til et rent sentrifugerør. Forbered masterenzymblandingen i en konisk sentrifugerør på 15 milliliter for analyseplaten for hver analyseplate ved å kombinere 3, 252,9 mikroliter myosinbuffer for analysen som involverer skjelettmuskulatur myosin II, 171,4 mikroliter LDH-oppløsning og 171,4 mikroliter pK-løsning. Forbered mastersubstratblandingen i et konisk sentrifugerør på 15 milliliter for hver plate ved å kombinere 162,1 mikroliter MED ATP, 162,1 mikroliter PEP og 324,1 mikroliter NADH-oppløsning.Ikke legg actin på dette punktet for å unngå aggregering og nedbør. For å lage syv-trinns seriell en-til-to fortynninger av NADH for kalibrering, klargjør du åtte 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Bland 12,3 mikroliter NADH-lagerløsning med 257,7 mikroliter myosinbuffer i det første røret for å lage en 250 mikromosoppløsning.Deretter aliquot 135 mikroliter myosin buffer i hver av de resterende syv rørene. Overfør 135 mikroliter av oppløsningen fra det første røret til det andre og bland ved pipettering. Gjenta til du når det syvende røret.Bruk det siste røret som no-NADH-kontroll med bare buffer. Ta alltid med positive og negative kontroller på sammensatte plater, og NADH-fortynninger for kalibrering på analyseplater. Disse kontrollene er svært viktige for å identifisere artefakter under dataanalyse.Bruk en åttekanals pipette til å overføre 20 mikroliter av NADH-kalibreringsløsningene til første rad i triplikater i en analyseplate. Legg nå til 4,2 mikroliter skjelettmuskulatur myosin II til enzymblandingen. Vortex kort.Tilsett myosin til enzymblandingen rett før dispensering. Lang inkubasjon av fortynnede myosinløsninger kan føre til tap av aktivitet på grunn av nedbør, og uspesifikk binding til plastoverflater. Last den tilberedte myosinenzymblandingen i en av prøvebeholderne til en automatisk dispenser.I platen, med unntak av den første raden, dispenser 8,4 mikroliter av myosinenzymet blandes inn i hver brønn av analyseplaten. Plasser deretter analyseplaten og den sammensatte platen på labware positioners av et automatisert væskehåndteringssystem som er utstyrt med et 100-nanoliter pin verktøyhode. Kjør deretter riktig metode i programvaren for å overføre 100 nanoliter med løsninger fra den tilberedte sammensatte platen til analyseplaten.Deretter plasserer du analyseplaten på en mikroplateshaker for å riste i ett minutt ved romtemperatur ved 1, 200 o/min. Tilsett 4, 052 mikroliter av sentrifugert actin løsning til substratblandingen og virvelen kort. For å starte den enzymatiske reaksjonen, dispenser 11,6 mikroliter actin substrat blandes inn i hver brønn av analyseplaten ved hjelp av en automatisk dispenser, unntatt den første raden.På en mikroplateshaker rister du analyseplaten i ett minutt ved romtemperatur ved 1, 200 o/min. Sentrifuger analyseplaten ved 101 ganger g i 30 sekunder. Bruk et 380 nanometer, 10 nanometer bånd bredde eksitasjon filter, og 470 nanometer, 24-nanometer bånd bredde utslipp filter i forbindelse med 425-nanometer cutoff dichroic speil for analysene.Optimaliser antall blink, detektorgevinst, platedimensjoner og målehøyde før analysene kjøres. Kjør målingen i høy konsentrasjonsmodus. Pass på at den indre temperaturen på plateleseren har stabilisert seg ved 25 grader Celsius.Legg platen inn i plateleseren og rist i ytterligere 30 sekunder for å gjøre formen på væskeoverflaten lik i hver brønn og la platen nå måletemperaturen. Skann platen i 45-sekunders intervaller og registrer NADH-fluorescens i 30 minutter. Med de eksporterte dataene plotter du den observerte fluorescensintensiteten mot tiden for hver brønn.Utfør enkel lineær regresjon for å bestemme skråningen og avskjæringen av fluorescensresponsene for hver brønn. Hellingen er proporsjonal med NADH-forbruksraten som kan brukes som en meget god tilnærming av ATP-forbruksraten. Avskjæringen er proporsjonal med NADH-konsentrasjonen i begynnelsen av målingen.Deretter konstruerer du en kalibreringskurve for NADH ved å plotte avskjæringene som er oppnådd for den første raden av platen mot konsentrasjonen av NADH. Avskjæringene anslår de virkelige fluorescensintensitetene i begynnelsen med mye mer tillit enn gjennomsnittet av den rå fluorescensintensiteten som leser i begynnelsen. Utfør enkel lineær regresjon for å oppnå hellingen og avskjæringen av NADH-kalibreringslinjen.Her beskriver avskjæringene fluorescensbakgrunnssignalet uten NADH til stede, mens skråningen tilsvarer den ekstrapolerte teoretiske fluorescensintensiteten til en en molar NADH-løsning. For å konvertere fluorescensendringer til ATP-forbrukshastigheter deler hellingen av fluorescensresponsen som er oppnådd for resten av brønnene ved hellingen av NADH-kalibreringslinjen. Deretter plotter ATP-forbruket mot konsentrasjonen av inhibitoren.For å fastslå de hemmende konstantene, bruk passende statistisk programvare som er i stand til ikke-lineær kurvetilpasning, for eksempel Origin 2017. Velg ikke-lineær kurve som passer til doseresponsdataene til en kvadratisk ligning som tilsvarer en enkel en-til-en-bindingslikevektsmodell. Y er ATP-forbruksraten.Y-minimum er ATP-forbruket i fravær av inhibitor. Y-maksimum er den teoretiske ATP-forbruket ved 100 % hemming. t og t er den totale konsentrasjonen av myosinenzymet og hemmeren.KI er den hemmende konstanten. I denne studien viste skjelett- og hjertemuskel myosin II ATPase reaksjoner lineær fluorescensintensitet spor uavhengig av myosin brukt eller tilstedeværelse av inhibitorer. Basal og actin-aktivert ATPase priser viste lineær avhengighet av konsentrasjonen av skjelett- eller hjertemuskel myosin II.A screening vinduskoeffisient eller Z-faktor på 0,78 indikerte en pålitelig analyse med svært godt separert positive og negative kontroller.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin og para-Nitroblebbistatin viste regelmessige doseresponskurver ved eller under deres rapporterte løselighetsverdier. Hemmende konstanter for både hjerte- og skjelettmuskulatur myosin IIs ble bestemt ved å montere en kvadratisk ligning som representerer en enkel likevektbindende modell til dataene. Fluorescens intensitet spor for blebbistatin oppnådd i en ATPase analyse ved hjelp av skjelettmuskulatur myosin II viste normalt lineært avtagende signal avhengig av mengden inhibitor tilstede.Men over løseligheten av blebbistatin ble det observert en uventet økning i signalet mest sannsynlig på grunn av dannelsen av lyse florescent blebbistatinkrystaller. Ved para-Nitroblebbistatin med normale rå fluorescensintensitetsspor, varierte reaksjonsratene over løselighet fra den bestemte doseresponskurven på grunn av nedbør. Ved å bruke denne metoden har vi utviklet nye, potente og selektive myosinhemmere som kan brukes som vitenskapelige verktøy i grunnleggende forskning eller som direkte kandidater i fremtiden.Det anbefales alltid å bruke en annen ATPase eller annen funksjonell analyse som er spesifikk for enzymet av interesse for å skille mellom ekte og falske positive treff. Alle proteiner binder plastoverflater. Dette problemet kan påvirke resultatene, spesielt hvis proteinet er tilstede ved lave konsentrasjoner.Unngå alltid unødvendig væskehåndtering, og bruk ikke-bindende rør. Alternative ATPase-analyser krever vanligvis håndtering av svovelsyre, giftige stoffer eller radioaktive materialer. Den NADH-tilknyttede ATPase-analysen krever derimot reagenser uten eller svært lav toksisitet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga Maritima membran bundne Pyrophosphatase hemmere

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spektrofotometrisk screening for potensielle hemmere av cytosolisk glutation S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro single-molecule imaging assay for analyse av cap-avhengig oversettelse kinetikk

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Foreta presise og nøyaktige FRET-målinger med ett molekyl ved hjelp av åpen kildekode-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Utvikling av en lateral flow immunokromatografisk stripe for rask og kvantitativ påvisning av små molekylforbindelser

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...