Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e Instituto Nacional de abuso de drogas NS096833 (CAM).

1. preparação de soluções de estoque e reagentes
<ol><li>Prepare a solução de ações ditiotreitol (DTT) dissolvendo a DTT cristalina em água destilada até uma concentração final de 1000 mm. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Alíquota e armazene a-20 ° c.</li>
	<li>Prepare a solução de estoque ATP dissolvendo ATP cristalino em água destilada para uma concentração final de 100 mM. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Alíquota e armazene a-20 ° c.</li>
	<li>Prepare 10x NAD...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. 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Etapas críticas no protocolo
Otimize o layout da placa executando várias placas com controle negativo somente (reação de ATPase sem inibidor). Inspecione os resultados cuidadosamente para padrões em taxas de reação. Por exemplo, estes podem surgir de efeitos de aresta e/ou imperfeições no revestimento de superfície hidrófilo de placas "não vinculantes". Se um padrão for observado, mude o tipo de chapa e/ou o layout da placa para minimizar os artefatos. Por exemplo...

Myosins são transdutores de energia Mecanoquímica que hidrolisam trifosfato de adenosina (ATP) para gerar movimento direcional ao longo dos filamentos do citoesqueleto de actina em eucariontes1,2. Eles têm tanto estruturalmente e kineticamente adaptados às suas várias funções intracelulares, como o transporte de organelas, contração muscular ou a geração de tensão citoesquelética1,2. A superfamília da miosina é representada por ~ 40 genes de miosina pertencentes a ~ 12 classes distintas de miosina no genoma humano3,4. Os membros das classes de miosina desempenham vários papéis em um conjunto altamente diversificado de distúrbios, como vários cânceres, distúrbios neurológicos, miopatias esqueléticas e cardiomiopatia hipertrófica5,6. Dado o grande número de funções fisiológicas e patológicas destes motores moleculares, não é surpreendente que eles estão se tornando cada vez mais reconhecidos como alvos de drogas para uma variedade de condições7. Avanços significativos foram feitos recentemente na descoberta de novos inibidores da miosina8,9,10 e ativadores11, e para melhorar as propriedades dos já existentes12, 13 anos de , 14 anos de , quinze anos.
A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH)-acoplado ATPase ensaio tem sido usado para medir a atividade ATPase de várias enzimas, tais como o retículo sarcoplasmático CA2 + bomba ATPase16, o reparo de DNA ATPase RAD5417, o AAA + ATPase p9718 ou o motor microtúnica cinesina19. O ensaio emprega um ciclo de regeneração ATP. O difosfato de adenosina (ADP) gerado pela ATPase é regenerado para ATP por piruvato quinase (PK), que transforma uma molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH). Isso, por sua vez, oxida uma molécula de NADH a NAD. Portanto, a diminuição da concentração de NADH em função do tempo é igual à taxa de hidrólise do ATP. O ciclo de regeneração ATP mantém a concentração de ATP quase constante e a concentração de ADP baixa, contanto que PEP esteja disponível. Isso resulta em cursos de tempo linear, tornando simples determinar as taxas de reação inicial e ajuda a evitar a inibição do produto pela ADP19. Embora o ensaio ATPase acoplado ao NADH já tenha sido adaptado a um formato 96-bem20, os volumes de alta reação (~ 150 μL) tornam-se relativamente dispendiosos devido à alta demanda de reagentes, tornando-o menos adequado à rápida triagem de um grande número de Compostos. Métodos alternativos, como o ensaio verde de Malaquita19,21, que depende da detecção do fosfato produzido pela enzima ATPase, foram comprovados mais adequados para miniaturização e triagem de alta produtividade22 , 23 anos de , 24. no entanto, um ensaio de ponto final é mais susceptível de ser afectado por vários artefactos (discutidos abaixo), que podem continuar a não ser descobertos na ausência de cursos a tempo inteiro.
Aqui, o ensaio ATPase acoplado à NADH foi otimizado para triagem de produção semialta de inibidores de pequenas moléculas. O músculo esquelético e cardíaco miosina II e os inibidores da miosina blebbistatina8 , para-aminoblebbistatin13 e para-nitroblebbistatin12 são utilizados para demonstrar o poder do ensaio, que se baseia na NADH fluorescência como uma leitura. Este protocolo é capaz de triagem de projetos focados em qualquer ADP produzindo enzimas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

As enzimas ATPase utilizam a energia livre armazenada em trifosfato de adenosina para catalisar uma grande variedade de processos bioquímicos endergônicos in vivo que não ocorreriam espontaneamente. Estas proteínas são cruciais para essencialmente todos os aspectos da vida celular, incluindo o metabolismo, divisão celular, respostas a mudanças ambientais e movimento. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo que foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de ATPase de pequenas moléculas. O ensaio foi aplicado à miosina II do músculo cardíaco e esquelético, dois ATPases motores moleculares à base de actina, como prova de princípio. A hidrólise do ATP é acoplada à oxidação de NADH por reações enzimáticas no ensaio. Primeiramente, o ADP gerado pelo ATPase é regenerado ao ATP pelo piruvato kinase (PK). PK catalisa a transição de fosfoenolpiruvato (PEP) para piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH), que catalisa a oxidação de NADH paralelamente. Assim, a diminuição da concentração de ATP está diretamente correlacionada com a diminuição da concentração de NADH, que se segue da mudança para a fluorescência intrínseca da NADH. Contanto que o PEP esteja disponível no sistema de reação, a concentração de ADP permanece muito baixa, evitando a inibição da enzima ATPase pelo seu próprio produto. Além disso, a concentração de ATP permanece quase constante, produzindo cursos de tempo linear. A fluorescência é monitorada continuamente, o que permite uma fácil estimativa da qualidade dos dados e ajuda a filtrar artefatos potenciais (por exemplo, decorrentes de precipitação composta ou alterações térmicas).

O mapa de layout de placa típico usado para experimentos de triagem é mostrado na Figura 1. As primeiras e as últimas fileiras são reservadas para a calibração de NADH e o controle positivo (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respectivamente. As linhas restantes (B a O) são usadas para testar a atividade inibitória de compostos. Aqui, as diluições de série 1:2 de quinze passos que partem da concentração composta de 10 mM no DMSO ...

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A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Este protocolo é aplicável a uma ampla gama de projetos de triagem destinados ao desenvolvimento de inibidores de ATPase, seja como sondas para pesquisa básica ou para potenciais compostos clínicos. Este método foi otimizado para aplicativos de triagem semi-high-throughput. Também foi projetado para evitar vários artefatos comuns e não requer o manuseio de materiais perigosos.Em nosso laboratório temos usado este ensaio para desenvolver novos e específicos inibidores de minodã não muscular II para o tratamento da desordem de uso de metanfetamina. Em teoria, este método pode ser facilmente aplicado a qualquer enzima que produz ATP. A demonstração visual ajuda a esclarecer todos os detalhes técnicos importantes.Para começar, prepare 4.500 microliters de 20 soluções de actina diluída de micromolar para cada microplato de poliestireno preto de 384 poços diluindo a solução concentrada de estoque de actina no buffer de actina. Misture a solução completamente, pipetando para cima e para baixo 30 vezes para quebrar filamentos de actina para reduzir a viscosidade e a heterogeneidade. Em seguida, centrifufique a solução para remover qualquer proteína precipitada presente.Transfira cuidadosamente o supernatante para um tubo de centrífuga limpo. Prepare a mistura de enzimas mestres em um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros para cada placa de ensaio, combinando 3.252,9 microliters de tampão de miosina para o ensaio envolvendo myosina muscular esquelética II, 171,4 microliters de solução LDH e 171,4 microliters de solução PK. Prepare a mistura de substrato mestre em um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros para cada placa, combinando 162,1 microliters de ATP, 162,1 microliters de PEP e 324,1 microliters de solução NADH.Não adicione actina neste momento para evitar agregação e precipitação. Para criar diluições serial de sete etapas de NADH para calibração, prepare oito tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro. Misture 12,3 microliters de solução de estoque NADH com 257,7 microliters de tampão de minosina no primeiro tubo para fazer uma solução de 250 micromolar.Em seguida, alíquota de 135 microliters de tampão de miosina em cada um dos sete tubos restantes. Transfira 135 microliters da solução do primeiro tubo para o segundo e misture por pipetação. Repita até chegar ao sétimo tubo.Use o último tubo como controle no-NADH apenas com buffer. Inclua sempre controles positivos e negativos em placas compostas e diluições NADH para calibração em placas de ensaio. Esses controles são extremamente importantes para identificar artefatos durante a análise de dados.Usando uma pipeta de oito canais, transfira 20 microliters das soluções de calibração NADH para a primeira linha em triplicados em uma placa de ensaio. Agora adicione 4,2 microliters de minosina muscular esquelética II à mistura de enzimas. Vórtice brevemente.Adicione a miosina à mistura de enzimas antes de dispensar. A longa incubação de soluções de minosina diluída pode resultar em perda de atividade devido à precipitação e vinculação inespecífica a superfícies plásticas. Carregue a mistura de enzimas de miosina preparada em um dos recipientes de amostra de um distribuidor automático.Na placa, exceto na primeira linha, distribua 8,4 microliters da enzima myosin mistura em cada poço da placa de ensaio. Em seguida, coloque a placa de ensaio e a placa composta sobre os posicionadores de labware de um sistema automatizado de manuseio líquido que é equipado com uma cabeça de ferramenta de pino de 100 nanoliter. Em seguida, execute o método apropriado no software para transferir 100 nanoliters de soluções da placa composta preparada para a placa de ensaio.Em seguida, coloque a placa de ensaio em um agitador de microplacos para agitar por um minuto à temperatura ambiente a 1.200 rpm. Adicione 4.052 microliters da solução de actina centrifugada à mistura de substrato e vórtice brevemente. Para iniciar a reação enzimática, dispense 11,6 microliters de mistura de substrato actin em cada poço da placa de ensaio usando um dispensador automático, exceto a primeira linha.Em um agitador de microplacos, agite a placa de ensaio por um minuto à temperatura ambiente a 1.200 rpm. Centrifugar a placa de ensaio a 101 vezes g por 30 segundos. Use um filtro de excitação de largura de banda de 380 nanômetros, 10 nanômetros e 470 nanômetros, filtro de emissão de largura de banda de 24 nanômetros em conjunto com o espelhodicrómico de corte de 425 nanômetros para os ensaios.Otimize o número de flashes, ganho de detector, dimensões da placa e altura de medição antes de executar os ensaios. Execute a medição em modo de alta concentração. Certifique-se de que a temperatura interna do leitor de placas estabilizou a 25 graus Celsius.Coloque a placa no leitor da placa e agite por mais 30 segundos para tornar a forma da superfície líquida semelhante em cada poço e permitir que a placa atinja a temperatura de medição. Escaneie a placa em intervalos de 45 segundos e grave fluorescência NADH por 30 minutos. Com os dados exportados, plote a intensidade observada de fluorescência contra o tempo para cada poço.Realize uma regressão linear simples para determinar a inclinação e interceptação das respostas de fluorescência para cada poço. A inclinação é proporcional à taxa de consumo naDH que pode ser usada como uma aproximação muito boa da taxa de consumo ATP. A interceptação é proporcional à concentração de NADH no início da medição.Em seguida, construa uma curva de calibração para NADH plotando as interceptações obtidas para a primeira linha da placa contra a concentração de NADH. As interceptações estimam as intensidades reais de fluorescência no início com muito mais confiança do que a média da intensidade de fluorescência bruta lê no início. Realize uma regressão linear simples para obter a inclinação e interceptação da linha de calibração NADH.Aqui, as interceptações descrevem o sinal de fundo de fluorescência sem o presente naDH, enquanto a inclinação corresponde à intensidade de fluorescência teórica extrapolada de uma solução naDH molar. Para converter as alterações de fluorescência às taxas de consumo atp dividem a inclinação da resposta de fluorescência obtida para o resto dos poços pela inclinação da linha de calibração NADH. Em seguida, plote as taxas de consumo da ATP contra a concentração do inibidor.Para determinar as constantes inibitórias, use qualquer software estatístico apropriado capaz de encaixe de curva não linear, como o Origin 2017. Selecione a curva não linear adequada para encaixar os dados de dose-resposta a uma equação quadrática correspondente a um modelo simples de equilíbrio de ligação um-para-um. Y é a taxa de consumo ATP.Y-mínimo é a taxa de consumo ATP na ausência de inibidor. Y-máximo é a taxa teórica de consumo atp em 100% de inibição. t e t são a concentração total da enzima e inibidora da miosina, respectivamente.KI é a constante inibitória. Neste estudo, as reações de minosina esquelética e cardíaca II ATPase mostraram traços lineares de intensidade de fluorescência, independentemente da minosina utilizada ou da presença de inibidores. As taxas de ATPase ativadas por basal e actina mostraram dependência linear na concentração de minosina esquelética ou muscular cardíaca II.Um coeficiente de janela de triagem ou fator Z de 0,78 indicou um ensaio confiável com controles positivos e negativos muito bem separados.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin e para-Nitroblebbistatin mostraram curvas regulares de dose-resposta em ou abaixo de seus valores de solubilidade relatados. As constantes inibitórias para as IIs de miose muscular cardíaca e esquelética foram determinadas pela montagem de uma equação quadrática representando um modelo simples de ligação de equilíbrio aos dados. Traços de intensidade de fluorescência para blebbistatina obtidos em um ensaio ATPase usando mísia muscular esquelética II mostraram sinal de diminuição linear normal dependendo da quantidade de inibidor presente.No entanto, acima da solubilidade da blebbistatin, observou-se um aumento inesperado no sinal devido à formação de cristais blebbistatin brilhantemente florescente. No caso da para-Nitroblebbistatin com traços normais de intensidade de fluorescência bruta, as taxas de reação obtidas acima da solubilidade divergiram da determinada curva dose-resposta devido à precipitação. Usando este método, desenvolvemos novos inibidores de minosina, potentes e seletivos que podem ser usados como ferramentas científicas em pesquisas básicas ou como candidatos diretos no futuro.É sempre recomendável usar um ATPase diferente ou outro ensaio funcional específico para a enzima de interesse para distinguir entre hits reais e falsos positivos. Todas as proteínas ligam superfícies plásticas. Esse problema pode afetar muito os resultados, especialmente se a proteína estiver presente em baixas concentrações.Evite sempre o manuseio líquido desnecessário e use tubos não vinculantes. Ensaios alternativos de ATPase geralmente requerem o manuseio de ácido sulfúrico, substâncias tóxicas ou materiais radioativos. Em contraste, o ensaio ATPase ligado ao NADH requer reagentes apenas sem toxicidade ou muito baixa.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Bioquímica

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Triagem espectrofotométrica para potenciais inibidores de Glutathione Citosolítica S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Um ensaio de imagem de molécula única in vitro para a análise de cinética de tradução dependente da tampa

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Fazendo medições de FRET de molécula única precisas e precisas usando o smfBox de código aberto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Desenvolvimento de uma tira imunocromatográfica de fluxo lateral para detecção rápida e quantitativa de compostos de pequenas moléculas

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...