Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Национального института неврологических расстройств и инсульта и Национального института по злоупотреблению наркотиками NS096833 (CAM).

1. Подготовка фондовых растворов и реагентов
<ol><li>Подготовка дитиотрейтол (DTT) бульонный раствор путем растворения кристаллического DTT в дистиллированной воде до конечной концентрации 1000 мм. Отрегулируйте рН до 7.0 с помощью 1 M NaOH. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.</li>
	<li>Подготовьт...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

Критические шаги в протоколе
Оптимизируйте расположение пластин, запустив несколько пластин только с отрицательным контролем (реакция ATPase без ингибитора). Тщательно проверяйте результаты на наличие закономерностей в темпах реакции. Например, они могут возник?...

Миозины механохимических преобразователей энергии, которые гидролизуют аденозин трифосфат (АТФ) для генерации направленного движения вдоль нитей актина цитоскелета в эукариотах1,2. Они имеют как структурно, так и кинетически адаптированы к их различных внутриклеточных функций, таких как транспорт органелл, сокращение мышц или генерации цитоскелетного напряжения1,2. Суперсемейка миозина представлена 40 генами миозина, принадлежащими к классумиосинов No12 в геноме человека 3,4. Члены классов миозина играют различные роли в весьма разнообразный набор расстройств, таких как несколько раковых заболеваний, неврологических расстройств, скелетных миопатий, и гипертрофической кардиомиопатии5,6. Учитывая большое количество физиологических и патологических функций этих молекулярных двигателей, неудивительно, что они становятся все более узнаваемыми в качестве лекарственных мишеней для различных условий7. Значительный прогресс был достигнут в последнее время воткрытии новых ингибиторов миозина 8,9,10 и активаторов11, и для улучшения свойств существующих12, 13 Год , 14 Год , 15.
Никотинамид аденин динуклеотид (NADH)-связанный анализ ATPase уже давно используется для измерения активности ATPase различных ферментов, таких как саркоплазма ретикулум Ca2 "насос ATPase16, РЕПАВ ATPase Rad5417, AAA ATPase p9718 или микротрубоум моторный кинезин19. В ассе используется цикл регенерации АТС. Аденозин дифосфат (ADP), генерируемый АТП, регенерируется аТФ с помощью пирувате киназы (PK), который параллельно преобразует одну молекулу фосфоненолпиррубвата (PEP). Впоследствии пируват е сводится к лактату при лактатной дигидрогеназе (LDH). Это, в свою очередь, окисляет одну молекулу NADH в NAD. Таким образом, снижение концентрации NADH как функции времени равно скорости гидролизу АТФ. Цикл регенерации АТС сохраняет концентрацию АТС почти постоянной, а концентрация ADP на низком уровне до тех пор, пока есть Pep. Это приводит к линейным курсам времени, что делает его простым, чтобы определить начальные показатели реакции и помогает избежать ингибирования продукта ADP19. Несмотря на то, что анализ ATPase, связанный с NADH, уже был адаптирован к формату 96 скважин20,высокие объемы реакции (150 л) делают его относительно дорогим из-за высокого спроса на реагенты, что делает его менее поддающимся быстрому скринингу большого количества Соединений. Альтернативные методы, такие как малахит зеленый анализ19,21, который опирается на обнаружение фосфатов, производимых ферментом ATPase, оказались более подходящими для миниатюризации и высокой пропускной платы скрининга22 , 23 , 24. Однако, конечной точки асссы, скорее всего, будут затронуты несколько артефактов (обсуждается ниже), которые могут оставаться неоткрытыми в отсутствие полный рабочий день курсов.
Здесь анализ NADH-связанных ATPase был оптимизирован для полувысокого скрининга пропускной записи малых ингибиторов молекулы. Скелетные и сердечные мышцы миозина II и ингибиторымиозина blebbistatin 8, para-aminoblebbistatin13 и пара-nitroblebbistatin12 используются для демонстрации силы анализа, который опирается на NADH флуоресценция как считывание. Этот протокол поддается скринингу проектов, ориентированных на любые ADP производства ферментов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

Ферменты ATPase используют свободную энергию, хранящуюся в аденозинтрифосфате, чтобы катализировать широкий спектр эндергонных биохимических процессов in vivo, которые не будут происходить спонтанно. Эти белки имеют решающее значение для практически всех аспектов клеточной жизни, включая обмен веществ, деление клеток, реакцию на изменения окружающей среды и движение. Протокол, представленный здесь, описывает никотинамид аденин динуклеотид (NADH)-связанный анализ ATPase, который был адаптирован к полувысокой пропускной скрининг абиторы малых молекул АТПасе. Анализ был применен к сердечной и скелетной мышцы миозина II, два актин основе молекулярного двигателя ATPases, в качестве доказательства принципа. Гидролиз АТФ связан с окислением NADH ферментативными реакциями в ходе асссея. Во-первых, ADP, генерируемый ATPase, регенерируется в АТФ пирувате киназой (PK). ПК катализает переход фосфоненолпирувата (PEP) в пируват параллельно. Впоследствии пируват сводится к лактату при лактате дегидрогеназы (ЛДГ), которая катализает окисление NADH параллельно. Таким образом, снижение концентрации АТФ напрямую коррелирует со снижением концентрации NADH, за которым следует изменение внутренней флуоресценции NADH. До тех пор, как PEP доступна в системе реакции, концентрация ADP остается очень низкой, избегая ингибирования фермента ATPase своим собственным продуктом. Кроме того, концентрация АТС остается почти постоянной, что дает линейные временные курсы. Флуоресценция постоянно контролируется, что позволяет легко оценить качество данных и помогает отфильтровывать потенциальные артефакты (например, в результате сложных осадков или тепловых изменений).

Типичная карта макета пластин, используемая для скрининговых экспериментов, показана на рисунке 1. Первая и последняя строки зарезервированы для калибровки NADH и положительного контроля (20 мкм пара-аминоблббистатин, 0,5% DMSO), соответственно. Остальн?...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы

Никотинамид аденин динуклеотид (NADH) -связанный анализ ATPase был адаптирован к полувысокой пропускной скрининга малых ингибиторов миозина молекулы. Этот кинетический анализ проводится в формате микроплиты 384 колодца с общими объемами реакции всего 20 Лл на скважину. Платформа должна быть применима практически к любому ферменту ADP.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Этот протокол применим к широкому кругу проектов скрининга, направленных на разработку ингибиторов ATPase, либо в качестве зондов для фундаментальных исследований, либо для потенциальных клинических соединений. Этот метод был оптимизирован для полу-высокой пропускной способности приложений скрининга. Он также был разработан, чтобы избежать нескольких распространенных артефактов, и это не требует обработки опасных материалов.В нашей лаборатории мы использовали этот анализ для разработки новых и конкретных немишечных ингибиторов миозин II для лечения расстройства использования метамфетамина. Теоретически этот метод можно легко применить к любым ферментам, производящим АТФ. Визуальная демонстрация помогает прояснить все важные технические детали.Для начала подготовьте 4500 микролитров 20 микромоляных разбавленных актиновых растворов для каждого 384-хорошого черного полистирола микроплея путем разбавления концентрированного раствора актиновых запасов в буфере актина. Смешайте раствор тщательно, трубя вверх и вниз 30 раз, чтобы сломать актин нити для снижения вязкости и неоднородности. Затем центрифуга раствор, чтобы удалить любой осажденный белок настоящее время.Тщательно перенесите супернатант в чистую центрифугу. Подготовка мастер фермента смесь в 15-миллилитровой конической центрифуг трубки для каждой анализной пластины путем объединения 3, 252,9 микролитров миозин буфера для анализа с участием скелетных мышц миозин II, 171,4 микролитров раствора LDH, и 171,4 микролитров PK решения. Подготовьте мастер-смесь субстрата в 15-миллилитровой конической центрифуге для каждой пластины, объединив 162,1 микролитров АТФ, 162,1 микролитров ПЭП и 324,1 микролитров раствора NADH.Не добавляйте актин в этот момент, чтобы избежать агрегации и осадков. Для создания семиступенчатых серийных разбавлений NADH для калибровки приготовьте восемь микроцентрифуговых трубок диаметром 1,5 миллилитра. Смешайте 12,3 микролитров раствора NADH с 257,7 микролитров миозин буфера в первой трубке, чтобы сделать 250 микромолярный раствор.Затем aliquot 135 микролитров миозин буфера в каждой из оставшихся семи труб. Перенесите 135 микролитров раствора из первой трубки во вторую и перемешайте с помощью труб. Повторяйте до достижения седьмой трубки.Используйте последнюю трубку в качестве управления no-NADH только с буфером. Всегда включают положительный и отрицательный контроль на сложных пластинах, и NADH разбавления для калибровки на анализе пластин. Эти элементы управления чрезвычайно важны для идентификации артефактов во время анализа данных.Используя восьмиканарный пипетку, перенесите 20 микролитров калибровочные растворы NADH в первый ряд в три раза в анализной пластине. Теперь добавьте 4,2 микролитров скелетного мышечного миозина II в ферментную смесь. Вортекс кратко.Добавьте миозин в ферментную смесь прямо перед раздачей. Длинная инкубация разбавленных растворов миозин может привести к потере активности из-за осадков и неспецифической привязке к пластиковым поверхностям. Загрузите подготовленную смесь фермента миозин в один из образцов контейнеров автоматического дозатора.В пластине, за исключением первого ряда, обойтись 8,4 микролитров фермента миозин смеси в каждом хорошо анализа пластины. Затем поместите анализ пластины и составной пластины на лабораторных позиционеров автоматизированной жидкостной системы обработки, которая оснащена 100-нанолитровый контактный инструмент головы. Затем запустите соответствующий метод в программном обеспечении для передачи 100 нанолитров растворов из подготовленной пластины соединения на анализ пластины.Затем поместите анализную пластину на шейкер микропластины, чтобы встряхнуть в течение одной минуты при комнатной температуре при температуре 1200 об/мин. Добавить 4, 052 микролитров центробежного раствора актина в субстрат смеси и вихря кратко. Чтобы начать энзиматические реакции, обойтись 11,6 микролитров актин субстрата смесь в каждом колодец анализ пластины с помощью автоматического дозатора, за исключением первого ряда.На микропластирной шейкере встряхните анализную пластину в течение одной минуты при комнатной температуре 1 200 об/мин. Центрифуга анализ пластины в 101 раз г в течение 30 секунд. Используйте 380-нанометровый, 10-нанометровый фильтр для возбуждения полосы и 470 нанометров, 24-нанометровый фильтр для выбросов полосы в сочетании с 425-нанометровым дихроическим зеркалом для анализа.Оптимизируйте количество вспышек, увеличение детектора, размеры пластин и высоту измерения перед запуском анализов. Вы запустите измерение в режиме высокой концентрации. Убедитесь, что внутренняя температура считыватель пластины стабилизировалась на 25 градусов по Цельсию.Загрузите пластину в считыватель пластины и встряхните еще 30 секунд, чтобы сделать форму жидкой поверхности похожей в каждой хорошо и позволить пластине достичь температуры измерения. Сканирование пластины в 45-секундных интервалах и запись NADH флуоресценции в течение 30 минут. С экспортируемыми данными, участок наблюдаемой интенсивности флуоресценции со временем для каждой хорошо.Выполните простую линейную регрессию для определения наклона и перехвата реакций флуоресценции для каждой колодец. Склон пропорционален скорости потребления NADH, которая может быть использована в качестве очень хорошего приближения скорости потребления АТФ. Перехват пропорционален концентрации NADH в начале измерения.Затем создайте кривую калибровки для NADH, наметив перехваты, полученные для первого ряда пластины против концентрации NADH. Перехваты оценивают реальную интенсивность флуоресценции в начале с гораздо большей уверенностью, чем средняя интенсивность сырой флуоресценции читает в начале. Выполните простую линейную регрессию для получения наклона и перехвата калибровочной линии NADH.Здесь перехват описывает фоновый сигнал флуоресценции без настоящего времени NADH, в то время как наклон соответствует экстраполированной теоретической интенсивности флуоресценции одного молярного решения NADH. Для преобразования изменений флуоресценции на показатели потребления АТФ разделить наклон реакции флуоресценции, полученной для остальных скважин по наклону калибровочной линии NADH. Далее, участок ставки потребления АТФ против концентрации ингибитора.Для определения ингибирующей константы используйте любое соответствующее статистическое программное обеспечение, способное к установке нелинейной кривой, например Origin 2017. Выберите нелинейную кривую, соответствующую данным о дозах и ответе, к квадратному уравнению, соответствующему простой модели соответствующего равновесия один на один. Y является уровень потребления АТФ.Y-минимум - это уровень потребления АТФ при отсутствии ингибитора. Y-максимум - это теоретическая скорость потребления АТФ на уровне 100% ингибирования. t и t являются общей концентрацией фермента миозин и ингибитора, соответственно.KI является ингибирующей константой. В этом исследовании, скелетных и сердечной мышцы миозин II ATPase реакции показали линейные следы интенсивности флуоресценции, независимо от используемого миозин или наличие ингибиторов. Базальные и актин-активированные ставки ATPase показали линейную зависимость от концентрации скелетных или сердечных мышц миозин II.A коэффициент окна скрининга или коэффициент 0,78 указал надежный анализ с очень хорошо разделенных положительных и отрицательных элементов управления.Blebbistatin, пара-Aminoblebbistatin, и пара-Nitroblebbistatin показали регулярные кривые дозы реакции на или ниже их сообщили значения solubility. Ингибиторные константы как для сердечного, так и для скелетного мышечного миозин-ИИ были определены путем установки квадратного уравнения, представляющего простую модель связывания равновесия с данными. Следы интенсивности флуоресценции для блефистатина, полученные в анализе ATPase с использованием скелетного мышечного миозина II, показали нормальный линейно уменьшаемый сигнал в зависимости от количества присутствуют ингибиторы.Однако выше растворимости блефистатина наблюдалось неожиданное увеличение сигнала, скорее всего, из-за образования ярко флуоресцентных кристаллов блефнистатина. В случае пара-нитроблбистатина с нормальными необработанными следами интенсивности флуоресценции, скорость реакции, полученная выше solubility, расходилась с обусловленной кривой реакции дозы из-за осадков. Используя этот метод, мы разработали новые, мощные и селективные ингибиторы миозин, которые могут быть использованы в качестве научных инструментов в фундаментальных исследованиях или в качестве прямых кандидатов в будущем.Всегда рекомендуется использовать различные ATPase или другие функциональные анализы, характерные для фермента интерес различать реальные и ложноположительные хиты. Все белки связывают пластиковые поверхности. Эта проблема может сильно повлиять на результаты, особенно если белок присутствует при низких концентрациях.Всегда избегайте ненужной обработки жидкости и используйте необязательные трубки. Альтернативные анализы ATPase обычно требуют обработки серной кислоты, токсичных веществ или радиоактивных материалов. В отличие от этого, NADH-связанных ATPase анализ требует реагентов без или очень низкой токсичности только.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Спектрофотометрический скрининг на потенциальные ингибиторы цитозоловых глутатиона S-transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Проведение точных и точных одномолекулярных измерений FRET с помощью smfBox с открытым исходным кодом

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Разработка боковой проточной иммунохроматографической полосы для быстрого и количественного обнаружения маломолекулярных соединений

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...