Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke och nationella institutet för drogmissbruk NS096833 (CAM).

1. beredning av stamlösningar och reagenser
<ol><li>Bered Ditiotreitol (dTT) stamlösning genom att lösa upp kristallint DTT i destillerat vatten till en slutlig koncentration av 1000 mm. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Och förvara vid-20 ° c.</li>
	<li>Förbered ATP stamlösning genom att lösa kristallint ATP i destillerat vatten till en slutlig koncentration av 100 mM. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Och förvara vid-20 ° c.</li>
	<li>Förbered 10X NADH buffert som innehåller 70 mM 3-(N-m...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

Kritiska steg i protokollet
Optimera plattan layout genom att köra flera plattor med negativ kontroll endast (ATPas reaktion utan inhibitor). Inspektera resultaten noggrant för mönster i reaktionshastigheter. Dessa kan till exempel bero på kanteffekter och/eller brister i den hydrofila ytbeläggningen på "icke-bindande" plåtar. Om ett mönster observeras, ändra platttyp och/eller plattlayout för att minimera artefakterna. Till exempel, en typisk dos-responskurva (16 ko...

Myosins är mechanochemical energigivare som hydrolysera adenosintrifosfat (ATP) att generera riktad rörelse längs glödtrådar av aktin cytoskelettet i Eukaryoter1,2. De har både strukturellt och Kinetically anpassas till deras olika intracellulära funktioner, såsom transport av organeller, muskelkontraktion eller generering av cytoskeletala spänningar1,2. Den myosin superfamiljen representeras av ~ 40 myosin gener som tillhör ~ 12 distinkta myosin klasser i den mänskliga arvsmassan3,4. Medlemmar av myosin klasserna spelar olika roller i en mycket varierande uppsättning av sjukdomar, såsom flera cancerformer, neurologiska sjukdomar, skelett myopatier, och hypertrofisk kardiomyopati5,6. Med tanke på det stora antalet fysiologiska och patologiska funktioner av dessa molekylära motorer, är det inte förvånande att de blir alltmer erkända som narkotika mål för en mängd olika villkor7. Betydande framsteg har gjorts nyligen i upptäckten av nya myosin-hämmare8,9,10 och aktivatorer11, och för att förbättra egenskaperna hos de befintliga12, 13 , fjorton , 15.
Den nikotinamid adenin--dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys har länge använts för att mäta ATPas aktivitet av olika enzymer, såsom sarkoplasmatiska nätmagen ca2 + pump ATPas16, DNA reparation ATPas Rad5417, AAA + ATPas p9718 eller mikrotubuli motor kinesinet19. Analysen sysselsätter en ATP förnyelsecykel. Adenosindifosfat (ADP) som genereras av ATPas regenereras till ATP av pyruvatkinas (PK), som omvandlar en molekyl av fosfoenolpyruvat (PEP) till Pyruvat parallellt. Därefter reduceras pyruvat till laktat genom laktatdehydrogenas (LDH). Det, i sin tur, oxiderar en molekyl av NADH till NAD. Minskningen av NADH-koncentrationen som en funktion av tiden är därför lika med ATP-Hydrolyshastigheten. ATP-regenereringscykeln håller ATP-koncentrationen nästan konstant och ADP-koncentrationen låg så länge som PEP är tillgänglig. Detta resulterar i linjära tidsförlopp, vilket gör det enkelt att fastställa de initiala reaktions frekvenserna och hjälper till att undvika produkt hämning av ADP19. Även om den NADH-kopplade ATPas-analysen redan har anpassats till en 96-brunn format20, den höga reaktions volymer (~ 150 μl) gör det relativt dyrt på grund av den höga efterfrågan av reagenser, göra det mindre mottaglig för snabb screening av ett stort antal Föreningar. Alternativa metoder, såsom den malakit gröna analysen19,21, som förlitar sig på upptäckten av fosfat som produceras av enzymet ATPas, var bevisat mer lämpade för miniatyrisering och hög genomflöde screening22 , 23 , 24. en Endpoint-analys är dock mer sannolikt att påverkas av flera artefakter (diskuteras nedan), som kan förbli oupptäckta i avsaknad av heltids kurser.
Här, den NADH-kopplade ATPas-analysen har optimerats för semi-High genomströmning screening av småmolekylära hämmare. Skelett-och hjärtmuskeln myosin II: s och myosin-hämmare blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 och para-nitroblebbistatin12 används för att demonstrera kraften i analysen, som förlitar sig på NADH fluorescens som en avläsning. Detta protokoll är mottagligt för screening projekt inriktade på alla ADP-producerande enzymer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

ATPas enzymer utnyttja den fria energi som lagras i adenosintrifosfat att katalysera en mängd olika endergonic biokemiska processer in vivo som inte skulle inträffa spontant. Dessa proteiner är avgörande för i huvudsak alla aspekter av cellulära liv, inklusive metabolism, celldelning, svar på miljöförändringar och rörelse. Det protokoll som presenteras här beskriver en nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys som har anpassats till semi-High genomströmning screening av små molekyler ATPas hämmare. Analysen har tillämpats på hjärt-och skelettmuskulaturen myosin II: s, två Actin-baserade molekylära motor ATPases, som ett bevis på princip. Hydrolys av ATP är kopplad till oxidation av NADH genom enzymatiska reaktioner i analysen. Först, ADP genereras av ATPas regenereras till ATP av pyruvatkinas (PK). PK katalyserar övergången av fosfoenolpyruvat (PEP) till Pyruvat parallellt. Därefter, pyruvat reduceras till laktat av laktatdehydrogenas (LDH), som katalyserar oxidation av NADH parallellt. Sålunda, minskningen i ATP koncentrationen är direkt korrelerad till minskningen i NADH koncentration, som följs av förändring till den inneboende fluorescensen av NADH. Så länge som PEP finns i Reaktionssystemet förblir ADP-koncentrationen mycket låg, vilket undviker hämning av enzymet ATPas av sin egen produkt. Dessutom förblir ATP koncentrationen nästan konstant, vilket ger linjära tidsförlopp. Fluorescensen övervakas kontinuerligt, vilket möjliggör enkel uppskattning av kvaliteten på data och hjälper till att filtrera bort potentiella artefakter (t. ex. till följd av sammansatt nederbörd eller termiska förändringar).

Den typiska plattlayoutkartan som används för screening experiment visas i figur 1. Den första och sista raden är reserverade för NADH kalibrering och positiv kontroll (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respektive. De återstående raderna (B till O) används för att testa den hämmande aktiviteten av föreningar. Här, femton-steg Serial 1:2 utspädningar från 10 mM sammansatta koncentration i DMSO bereds och överförs från den sam...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

En nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys har anpassats till semihigh genomströmning screening av små molekyler myosin-hämmare. Denna kinetiska analys körs i ett 384-väl mikroplattformat med totala reaktions volymer på endast 20 μL per brunn. Plattformen bör vara tillämplig på praktiskt taget alla ADP-producerande enzym.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Detta protokoll är tillämpligt på ett brett spektrum av screeningprojekt som syftar till att utveckla ATPase-hämmare, antingen som sonder för grundforskning eller för potentiella kliniska föreningar. Den här metoden har optimerats för semi-high-throughput screening applikationer. Det har också utformats för att undvika flera vanliga artefakter och det kräver inte hantering av farliga material.I vårt laboratorium har vi använt denna analys för att utveckla nya och specifika icke-muskel myosin II-hämmare för behandling av metamfetamin användning störning. I teorin kan denna metod enkelt tillämpas på alla enzymer som producerar ATP. Visuell demonstration hjälper till att klargöra alla viktiga tekniska detaljer.Till att börja, förbereda 4, 500 mikroliter av 20 mikromolar utspädd aktinlösning för varje 384-väl svart polystyren mikroplatta genom att späda den koncentrerade aktin lager lösning i aktin buffert. Blanda lösningen noggrant genom att pipettera upp och ner 30 gånger för att bryta aktinfilament för att minska viskositet och heterogenitet. Sedan centrifugera lösningen för att avlägsna eventuella utfällda protein närvarande.Överför försiktigt supernatanten till ett rent centrifugrör. Förbered master enzymblandning i en 15-milliliter konisk centrifugerör för varje analysplatta genom att kombinera 3, 252,9 mikroliter myosinbuffert för analysen som inbegriper skelettmuskel myosin II, 171,4 mikroliter LDH-lösning, och 171,4 mikroliter PK-lösning. Förbered master substrat mix i en 15-milliliter konisk centrifuge rör för varje platta genom att kombinera 162,1 mikroliter av ATP, 162,1 mikroliter PEP, och 324,1 mikroliter NADH lösning.Lägg inte till aktin i denna punkt för att undvika aggregering och nederbörd. För att skapa sjustegsserien en-till-två utspädningar av NADH för kalibrering, förbered åtta 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Blanda 12,3 mikroliter av NADH-stamlösning med 257,7 mikroliter myosinbuffert i det första röret för att göra en 250 mikromolarlösning.Sedan alikvot 135 mikroliter av myosin buffert i var och en av de återstående sju rör. Överför 135 mikroliter av lösningen från det första röret till det andra och blanda genom pipettering. Upprepa tills du når det sjunde röret.Använd det sista röret som no-NADH-kontroll med endast buffert. Inkludera alltid positiva och negativa kontroller på sammansatta plattor, och NADH-utspädningar för kalibrering på analysplattor. Dessa kontroller är extremt viktiga för att identifiera artefakter under dataanalys.Med hjälp av en åttakanalspipett överför du 20 mikroliter av NADH-kalibreringslösningarna till den första raden i tre exemplar i en analysplatta. Nu lägga 4,2 mikrobelättrar av skelettmuskulaturen myosin II till enzymblandningen. Vortex kort.Lägg myosin till enzymet mix rätt före dispensering. Lång inkubering av utspädda myosinlösningar kan leda till förlust av aktivitet på grund av nederbörd, och ospecifik bindning till plastytor. Ladda den förberedda myosinenzymblandningen i en av provbehållarna på en automatisk dispenser.I plattan, med undantag för den första raden, dispensera 8,4 mikroliter av myosin enzymblandningen i varje brunn av analysen plattan. Placera sedan analysplattan och den sammansatta plattan på labware positioners av ett automatiserat vätskehanteringssystem som är utrustat med en 100-nanoliter stift verktygshuvud. Kör sedan lämplig metod i programvaran för att överföra 100 nanoliter av lösningar från den förberedda sammansatta plattan till analysplattan.Därefter placerar du analysplattan på en mikroplatta shaker att skaka i en minut vid rumstemperatur vid 1, 200 rpm. Tillsätt 4, 052 mikroliter av den centrifugerade aktinlösningen till substratblandningen och virveln kort. För att starta den enzymatiska reaktionen, dispensera 11,6 mikroliter av aktin substrat blanda i varje brunn av analysen plattan med hjälp av en automatisk dispenser, utom den första raden.På en mikroplattskak, skaka analysplattan under en minut vid rumstemperatur vid 1, 200 rpm. Centrifugera analysplattan vid 101 gånger g i 30 sekunder. Använd en 380-nanometer, 10-nanometerband bredd excitation filter, och 470 nanometer, 24-nanometerband bredd utsläpp filter i samband med 425-nanometer cutoff dichroic spegel för analyserna.Optimera antalet blixtar, detektorökning, plåtdimensioner och mäthöjd innan du kör analyserna. Kör mätningen i högkoncentrationsläge. Se till att plattans innertemperatur har stabiliserats vid 25 grader Celsius.Ladda plattan i plattan läsaren och skaka i ytterligare 30 sekunder för att göra formen på vätskeytan liknande i varje brunn och låt plattan nå mättemperatur. Skanna plattan i 45-sekunders intervall och registrera NADH fluorescens i 30 minuter. Med de exporterade uppgifterna ritar du den observerade fluorescensintensiteten mot tiden för varje brunn.Utför enkel linjär regression för att bestämma lutningen och skärningspunkt för fluorescenssvaren för varje brunn. Lutningen är proportionell mot NADH förbrukningshastighet som kan användas som en mycket bra approximation av ATP förbrukningshastighet. Skärningspunkt är proportionell mot NADH-koncentrationen i början av mätningen.Konstruera sedan en kalibreringskurva för NADH genom att rita de skärningsningar som erhålls för den första raden av plattan mot koncentrationen av NADH. Fångarna uppskattar de verkliga fluorescensintensiteterna i början med mycket mer förtroende än genomsnittet av den råa fluorescensintensiteten läser i början. Utför enkel linjär regression för att erhålla lutning och skärningspunkt för NADH-kalibreringslinjen.Här beskriver fångarna fluorescens bakgrundssignalen utan NADH närvarande, medan lutningen motsvarar den extrapolerade teoretiska fluorescens intensiteten av en en molar NADH lösning. För att konvertera fluorescensförändringar till ATP-förbrukningshastigheter dela lutningen på fluorescenssvaret som erhållits för resten av brunnarna genom lutningen på NADH-kalibreringslinjen. Därefter rita ATP konsumtionshastigheter mot koncentrationen av hämmaren.För att bestämma de hämmande konstanterna, använd någon lämplig statistisk programvara som kan olinjär kurvpassning, såsom Origin 2017. Välj olinjär kurvpassning för att passa dos-respons-datan till en kvadratisk ekvation som motsvarar en enkel en-till-en-bindande jämviktsmodell. Y är ATP-förbrukningshastigheten.Y-minimum är ATP-förbrukningshastigheten i frånvaro av inhibitor. Y-maximum är den teoretiska ATP-förbrukningshastigheten vid 100%-hämning. t och t är den totala koncentrationen av myosinenzymet respektive inhibitorn.KI är den hämmande konstanten. I denna studie, skelett och hjärt muskel myosin II ATPase reaktioner visade linjär fluorescens intensitet spår oavsett myosin används eller förekomsten av hämmare. Basala och aktin-aktiverade ATPase priser visade linjära beroendet av koncentrationen av skelettet eller hjärt muskel myosin II.A screening fönster koefficient eller Z faktor 0,78 anges en tillförlitlig analys med mycket väl separerade positiva och negativa kontroller.Blebbistatin, para- Aminoblebbistatin och para-Nitroblebbistatin visade regelbundna dos- responskurvor vid eller under sina rapporterade löslighetsvärden. Hämmande konstanter för både hjärt och skelettmuskulaturen myosin IIs fastställdes genom att montera en kvadratisk ekvation som representerar en enkel jämvikt bindande modell till data. Fluorescens intensitet spår för blebbistatin som erhållits i en ATPase analys med hjälp av skelettmuskulaturen myosin II visade normala linjärt minskande signal beroende på mängden inhibitor närvarande.Men ovanför lösligheten av blebbistatin en oväntad ökning av signalen observerades mest sannolikt på grund av bildandet av starkt fluorescerande blebbistatin kristaller. När det gäller para-Nitroblebbistatin med normala råfluorescensintensitetsspår avvek reaktionsfrekvenserna som erhållits över löslighet från den fastställda dos- och responskurvan på grund av utfällning. Genom att använda denna metod har vi utvecklat nya, potenta och selektiva myosinhämmare som kan användas som vetenskapliga verktyg inom grundforskning eller som direkta kandidater i framtiden.Det är alltid rekommenderas att använda en annan ATPase eller annan funktionell analys som är specifika för enzymet av intresse för att skilja mellan verkliga och falska positiva träffar. Alla proteiner binder plastytor. Detta problem kan i hög grad påverka resultaten, särskilt om proteinet är närvarande vid låga koncentrationer.Undvik alltid onödig vätskehantering, och använd icke-bindande rör. Alternativa ATPase-analyser kräver vanligtvis hantering av svavelsyra, giftiga ämnen eller radioaktiva material. I motsats till detta kräver den NADH-länkade ATPase-analysen reagenser med endast ingen eller mycket låg toxicitet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening för Thermotoga maritima membran-bundna Pyrofosfatashämmare

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Spektrofotometrisk screening för potentiella hämmare av cytosolisk glutation S-Transferass

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En in vitro-analys för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Utveckling av en immunokromatografisk remsa för lateralt flöde för snabb och kvantitativ detektion av små molekylföreningar

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaserad endonukleaskopplad DNA-metyleringsanalys för att screena för DNA-metyltransferashämmare

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...