Name: a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü ve Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü NS096833 (CAM) tarafından desteklenmiştir.

1. Stok çözümleri nin ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Distile suda 1000 mM'lik son konsantrasyona kristal DTT eriterek dithiothreitol (DTT) stok çözeltisini hazırlayın. 1 M NaOH çözeltisi ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Distile suda 100 mM'lik son konsantrasyona kristal ATP eriterek ATP stok çözeltisini hazırlayın. 1 M NaOH çözeltisi ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>70 mM 3-(N-morfolino)propanülfonik asit (MOPS), 10 mM M...

<ol>
	<li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions.">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li><li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+superfamily+at+a+glance.">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li><li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+millennial+myosin+census.">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li><li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+myosins,+a+paneukaryotic+whole-genome+approach.">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li><li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+myosin+II+in+disease:+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li><li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases.">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li><li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives:+Optimization+and+Pharmacological+Potential.">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li><li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor.">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li><li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application.">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li><li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice.">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li><li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first,+selective,+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin.">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li><li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li><li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+soluble,+non-phototoxic,+non-fluorescent+blebbistatin+derivative.">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141 (2016).</li><li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+(S)-3'-hydroxyblebbistatin+and+(S)-3'-aminoblebbistatin:+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties.">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li><li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+(S)-blebbistatin+analogs.">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li><li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components.">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein.">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li><li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA++ATPase+p97.">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li><li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li><li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities.">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li><li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green:+an+improvement+and+evaluation.">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li><li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microassay+for+ATPase.">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization.">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).</li><li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+muscle+actin.">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II.">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li><li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II.">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li><li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus.">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li><li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+binding+data.">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li><li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay.">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li><li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament.">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li><li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity.">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li><li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIFC1:+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment?.">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?.</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li><li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity.">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li><li>Datta, A., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy.">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).</li></ol>

Protokoldeki kritik adımlar
Plaka düzenini yalnızca negatif kontrole sahip birkaç plaka çalıştırarak optimize edin (inhibitör olmadan ATPaz reaksiyonu). Reaksiyon oranlarındaki desenler için sonuçları dikkatle inceleyin. Örneğin, bunlar "bağlayıcı olmayan" plakaların hidrofilik yüzey kaplamasındaki kenar etkileri ve/veya kusurlardan kaynaklanabilir. Bir desen gözlenirse, yapıları en aza indirmek için plaka türünü ve/veya plaka düzenini değiştirin...

Miyozinler ökaryotlar da aktin sitoskeleton filamentleri boyunca yönlü hareket oluşturmak için adenozin trifosfat (ATP) hidrolize mekanokimyasal enerji transdüserler vardır1,2. Onlar hem yapısal hem de kinetically çeşitli hücre içi fonksiyonları adapte var, organellerin taşınması gibi, kas kasılması veya sitoskelet alçit üretimi1,2. Miyozin süper familyası insan genomundaki ~12 farklı miyozin sınıflarına ait ~40 miyozin geni ile temsil edilir3,4. Miyozin sınıflarının üyeleri çeşitli kanserler, nörolojik bozukluklar, iskelet miyopatileri ve hipertrofik kardiyomiyopati5,6gibi çok çeşitli bozukluklar kümesinde çeşitli roller oynamaktadır. Bu moleküler motorların fizyolojik ve patolojik fonksiyonları çok sayıda göz önüne alındığında, bu koşullar çeşitli için giderek ilaç hedefleri olarak kabul ediliyor şaşırtıcı değildir7. Önemli ilerleme son zamanlarda yeni miyozin inhibitörleri keşfi yapılmıştır8,9,10 ve aktivatörler11, ve mevcut olanların özelliklerini geliştirmek için12, 13.000 , 14.000 , 15. yıl.
Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz testi uzun sarcoplasmic reticulum Ca2 + pompa ATPase 16 gibiçeşitli enzimlerin ATPase aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır , DNA onarım ATPase Rad5417, AAA + ATPaz p9718 veya mikrotübül motor kinesin19. Tne bir ATP rejenerasyon döngüsü kullanır. ATPaz tarafından üretilen adenozin difosfat (ADP), fosfoenolpiriuvat (PEP) molekülünü paralel olarak pirüvetmeye dönüştüren pirüvat kinaz (PK) ile ATP'ye yenilenir. Daha sonra, pirüuvat laktat dehidrogenaz (LDH) tarafından laktat azalır. Bu da NADH molekülünün bir molekülünü NAD'a oksitler. Bu nedenle, zaman fonksiyonu olarak NADH konsantrasyonunun azalması ATP hidroliz hızına eşittir. ATP rejenerasyon döngüsü ATP konsantrasyonu neredeyse sabit ve PEP mevcut olduğu sürece ADP konsantrasyonu düşük tutar. Bu, doğrusal zaman dersleri ile sonuçlanır, bu da ilk reaksiyon oranlarını belirlemeyi kolaylaştırır ve ADP19tarafından ürün inhibisyonunun önlenmesine yardımcı olur. NADH-birleştirilmiş ATPase testi zaten 96-iyiformat20adapte edilmiş olmasına rağmen, yüksek tepki hacimleri (~ 150 μL) reaktiflerin yüksek talep nedeniyle nispeten pahalı hale, daha az çok sayıda hızlı tarama için uygun hale Bileşik. ATPaz enzimi tarafından üretilen fosfatın saptanması nda dayanan malakit yeşili çıktı19,21gibi alternatif yöntemler, minyatürleştirme ve yüksek iş lenme taraması için daha uygun olduğu kanıtlanmıştır22 , 23.000 , 24- Ancak, bir uç nokta teşbit birkaç eserler (aşağıda ele) tarafından etkilenecek tir, tam zamanlı dersler yokluğunda keşfedilmemiş kalabilir.
Burada, NADH-birleştirilmiş ATPase tsay küçük molekül inhibitörleri yarı-yüksek iş taranması için optimize edilmiştir. İskelet ve kardiyak kas miyozin II ve miyozin inhibitörleri blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 ve para-nitroblebbistatin12 NADH dayanır tasnif gücünü göstermek için kullanılır bir okuma olarak floresan. Bu protokol, enzim üreten herhangi bir ADP'ye odaklanan projelerin taranmasına olanak sağlamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:956px;" width="955">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3575</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Aurora FRD-IB Dispenser</td>
			<td>Aurora Discovery, Inc.</td>
			<td>00017425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A31841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free)</td>
			<td>Akron Biotech</td>
			<td>AK1391&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4672080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">EnVision 2104 Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160; 12620-926&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td>
			<td>Cytoskeleton&#160;</td>
			<td>MY02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NADH (&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3 (Sodium azide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter CFP 470/24nm (Emission)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5850</td>
			<td>Barcode 240</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-5390</td>
			<td>Barcode 112</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Optical Module: Beta Lactamase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2100-4270</td>
			<td>Barcode 418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OriginPro 2017 software</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Aminoblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">para-Nitroblebbistatin</td>
			<td style="width:147px;">AMRI</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Custom synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Rabbit Muscle Acetone Powder</td>
			<td>Pel Freez Biologicals</td>
			<td>41995-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput adaptation of the nadh-coupled atpase assay for screening small molecule inhibitors

ATPaz enzimleri, adenozin trifosfatta depolanan serbest enerjiyi vivo'da kendiliğinden oluşmayan çok çeşitli endergonik biyokimyasal süreçleri katalize etmek için kullanırlar. Bu proteinler metabolizma, hücre bölünmesi, çevresel değişikliklere ve harekete tepkiler de dahil olmak üzere hücre yaşamının esasen tüm yönleri için çok önemlidir. Burada sunulan protokol, küçük molekül ATPaz inhibitörlerinin yarı-yüksek iş lenme taramasına adapte edilmiş bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) ile birleştirilmiş ATPaz testini tanımlar. Test, prensip kanıtı olarak iki aktin bazlı moleküler motor ATP'ler olan kardiyak ve iskelet kası miyozin II'sine uygulanmıştır. ATP'nin hidrolizi, nadh'ın oksidasyonu ile birleştiğinde, analizdeki enzimatik reaksiyonlar ile biraraya gelindiğinde. İlk olarak, ATP'ler tarafından oluşturulan ADP, pirüuvat kiaz (PK) ile ATP'ye yenilenir. PK paralel olarak piruvate fosfoenolpyruvate (PEP) geçiş katalizler. Daha sonra, pirüuvat laktat dehidrogenaz tarafından azalır (LDH), paralel olarak NADH oksidasyon katalizler. Böylece, ATP konsantrasyonundaki azalma nadh konsantrasyonundaki azalma ile doğrudan ilişkilidir ve bunu NADH'ın içsel floresansında değişim takip eder. PEP reaksiyon sisteminde mevcut olduğu sürece, ADP konsantrasyonu çok düşük kalır, kendi ürünü tarafından ATPase enziminin inhibisyonu kaçınarak. Ayrıca, ATP konsantrasyonu neredeyse sabit kalır, doğrusal zaman kursları verimli. Floresan sürekli olarak izlenir, bu da veri kalitesinin kolayca tahmin edilmesine olanak tanır ve potansiyel eserlerin (örneğin, bileşik yağış veya termal değişikliklerden kaynaklanan) filtrelenmesine yardımcı olur.

Tarama deneyleri için kullanılan tipik plaka düzeni haritası Şekil1'de gösterilmiştir. İlk ve son satırlar sırasıyla NADH kalibrasyonu ve pozitif kontrol (20 μM para-aminoblebbistatin, %0.5 DMSO) için ayrılmıştır. Kalan satırlar (B'den O'ya) bileşiklerin inhibitör aktivitesini test etmek için kullanılır. Burada, DMSO'daki 10 mM bileşik konsantrasyonundan başlayarak on beş adımlı seri 1:2 seyreltmeler hazırlanır ve bileş...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors at JoVE.com

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Bu protokol, temel araştırma için prob lar veya potansiyel klinik bileşikler için ATPaz inhibitörleri geliştirmeyi amaçlayan çok çeşitli tarama projeleri için geçerlidir. Bu yöntem yarı-yüksek iş elde tarama uygulamaları için optimize edilmiştir. Ayrıca birkaç ortak eserler önlemek için tasarlanmıştır ve tehlikeli maddelerin işlenmesi gerektirmez.Laboratuvarımızda metamfetamin kullanım bozukluğunun tedavisi için yeni ve spesifik kas dışı miyozin II inhibitörleri geliştirmek için bu tökezlemeyi kullanıyoruz. Teorik olarak, bu yöntem kolayca ATP üreten herhangi bir enzimler uygulanabilir. Görsel gösteri tüm önemli teknik ayrıntıları açıklığa kavuşturmak için yardımcı olur.Başlamak için, her 384-iyi siyah polistiren mikroplaka için 20 mikromolar seyreltilmiş aktin çözeltisi 4, 500 mikrolitre actin tampon konsantre actin stok çözeltisi seyrelterek hazırlayın. Viskozite ve heterojenliği azaltmak için aktin filamentleri kırmak için 30 kez yukarı ve aşağı boru lar atarak çözeltiyi iyice karıştırın. Sonra herhangi bir çökelti protein mevcut kaldırmak için çözelti santrifüj.Supernatant'ı temiz bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. İskelet kası miyozin II, 171,4 mikrolitre LDH çözeltisi ve 171,4 mikrolitre PK çözeltisini içeren bir deney için 3, 252,9 miyozin tamponunu birleştirerek her bir deney plakası için 15 mililitrelik konik santrifüj tüpünde ana enzim karışımını hazırlayın. 162,1 mikrolitre ATP, 162,1 mikrolitre PEP ve 324,1 mikrolitre NADH çözeltisini birleştirerek her plaka için 15 mililitrelik konik santrifüj tüpünde ana substrat karışımını hazırlayın.Toplama ve yağış önlemek için bu noktada aktin eklemeyin. Kalibrasyon için NADH yedi adımseri bir-iki seyreltme oluşturmak için, sekiz 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. 250 mikromolar çözelti yapmak için ilk tüpte 257,7 mikrolitre miyozin tampon ile NADH stok çözeltisinin 12,3 mikrolitresini karıştırın.Sonra kalan yedi tüpün her birine 135 mikrolitre miyozin tamponu yerleştirin. Çözeltinin 135 mikrolitresini ilk tüpten ikinci tüpe aktarın ve pipetleme ile karıştırın. Yedinci tüpulaşana kadar tekrarlayın.Son tüpü yalnızca arabellekle NADH denetimi olmayan olarak kullanın. Bileşik plakalar üzerinde her zaman pozitif ve negatif kontroller ve analiz plakalarında kalibrasyon için NADH seyreltmeleri ekleyin. Bu denetimler, veri analizi sırasında yapıları tanımlamak için son derece önemlidir.Sekiz kanallı pipet kullanarak, NADH kalibrasyon çözümlerinin 20 mikrolitresini bir analiz plakasındaki üç eritmelerde ilk sıraya aktarın. Şimdi enzim karışımına 4.2 mikrolitre iskelet kası miyozin II ekleyin. Girdap kısaca.Dağıtımdan hemen önce enzim karışımına miyozin ekleyin. Seyreltilmiş miyozin çözeltilerinin uzun kuluçka yada konnesyonu yağış nedeniyle aktivite kaybına ve plastik yüzeylere spesifik olmayan bağlanmaya neden olabilir. Hazırlanan miyozin enzim karışımını otomatik bir dağıtıcının numune kaplarından birine yükleyin.Plaka, ilk satır dışında, istin plaka her kuyuiçine miyozin enzim karışımı 8.4 mikrolitre dağıtmak. Daha sonra, 100 nanolitrelik iğne takım kafası ile donatılmış otomatik sıvı işleme sisteminin laboratuvar tutucu larının üzerine hesap plakasını ve bileşik plakayı yerleştirin. Daha sonra hazırlanan bileşik plakadan 100 nanolitre çözeltiyi analiz plakasına aktarmak için yazılımda uygun yöntemi çalıştırın.Daha sonra, 1, 200 rpm oda sıcaklığında bir dakika sallamak için bir mikroplaka shaker üzerinde yüzer plaka yerleştirin. Kısaca substrat karışımı ve girdap için santrifüj aktin çözeltisi 4, 052 mikrolitre ekleyin. Enzimatik reaksiyonu başlatmak için, ilk sıra hariç, otomatik bir dağıtıcı kullanarak test plakasının her kuyusuna 11,6 mikrolitre actin substrat karışımı dağıtın.Bir mikroplaka shaker, 1, 200 rpm oda sıcaklığında bir dakika için sayma plaka sıkışın. 30 saniye boyunca 101 kez g olarak yüzer plakayı santrifüj edin. Tahliller için 425 nanometre kesme dikroik ayna ile birlikte 380 nanometre, 10 nanometre bant genişliği uyarma filtresi ve 470 nanometre, 24 nanometre bant genişliği emisyon filtresi kullanın.Tahlilleri çalıştırmadan önce yanıp söner sayısını, dedektör kazancını, plaka boyutlarını ve ölçüm yüksekliğini optimize edin. Ölçümü yüksek konsantrasyon modunda çalıştırın. Plaka okuyucusunun iç sıcaklığının 25 santigrat derecede stabilize olduğundan emin olun.Plakayı plaka okuyucusuna yükleyin ve sıvı yüzeyin şeklini her kuyuda benzer hale getirmek ve plakanın ölçüm sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için 30 saniye daha sallayın. Plakayı 45 saniyearalıklarla tarayıp NADH floresanını 30 dakika boyunca kaydedin. İhraç edilen verilerle, gözlenen floresan yoğunluğuher kuyu için zamana göre çizin.Her kuyu için floresan yanıtlarının eğimini ve yolunu kesmek için basit doğrusal regresyon gerçekleştirin. Eğim, ATP tüketim oranının çok iyi bir yaklaşım olarak kullanılabilecek NADH tüketim oranı ile orantılıdır. Kesişme, ölçümün başındaki NADH konsantrasyonu ile orantılıdır.Daha sonra, PLAKANıN ilk satırı için elde edilen kesitleri NADH konsantrasyonuna karşı çizerek NADH için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Keserler başlangıçta ki gerçek floresan yoğunluklarını, başlangıçta okunan ham floresan yoğunluğunun ortalamasından çok daha fazla güvenle tahmin eder. NADH kalibrasyon hattının eğimini ve yolunu kesmek için basit doğrusal regresyon gerçekleştirin.Burada, kesişmeler nadh bulunmayan floresan arka plan sinyalini açıklarken, eğim tek bir molar NADH çözeltisinin ekstrapolated teorik floresan yoğunluğuna karşılık gelir. Floresan değişikliklerini ATP tüketim oranlarına dönüştürmek için, nadh kalibrasyon hattının eğimi ile kuyuların geri kalanı için elde edilen floresan tepkisinin eğimini bölün. Daha sonra, ATP tüketim oranlarını inhibitörün konsantrasyonuna göre çizin.İnhibitör sabitlerini belirlemek için, Origin 2017 gibi doğrusal olmayan eğri montajı yeteneğine sahip uygun istatistiksel yazılımları kullanın. Doz-yanıt verilerini basit bire bir bağlama denge modeline karşılık gelen kuadratik bir denkleme sığdıracak doğrusal olmayan eğriyi seçin. Y, ATP tüketim oranıdır.Y-minimum inhibitör yokluğunda ATP tüketim oranıdır. Y-maksimum% 100 inhibisyonu teorik ATP tüketim oranıdır. t ve t sırasıyla miyozin enzimve inhibitörütoplam konsantrasyonu vardır.KI inhibitör sabittir. Bu çalışmada, iskelet ve kardiyak kas miyozin II ATPase reaksiyonları kullanılan miyozin veya inhibitörlerin varlığıne bakılmaksızın doğrusal floresan yoğunluğu izleri gösterdi. Bazal ve aktin aktive ATPaz oranları iskelet veya kardiyak kas miyozin II.A tarama pencere katsayısı veya Z faktörü konsantrasyonu doğrusal bağımlılık gösterdi 0.78 çok iyi ayrılmış pozitif ve negatif kontroller ile güvenilir bir tsay gösterdi.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin ve para-Nitroblebbistatin bildirilen çözünürlük değerlerinin altında veya altında düzenli doz-yanıt eğrileri gösterdi. Hem kardiyak hem de iskelet kası miyozin II'si için inhibitör sabitler, verilere basit bir denge bağlama modelini temsil eden kuadratik bir denklem intiyaca katarak belirlendi. İskelet kası miyozin II kullanılarak ATPase testinde elde edilen blebbistatin için floresan yoğunluk izleri mevcut inhibitör miktarına bağlı olarak normal doğrusal azalan sinyal gösterdi.Ancak blebbistatin çözünürlüğünün üzerinde parlak floresan blebbistatin kristallerinin oluşumuna bağlı olarak sinyalde beklenmedik bir artış gözlenmiştir. Normal ham floresan şiddeti izleriyle para-Nitroblebbistatin durumunda, çözünürlüğü yukarıda elde edilen reaksiyon oranları yağış nedeniyle belirlenen doz-tepki eğrisinden saptı. Bu yöntemi kullanarak, temel araştırmalarda bilimsel araç olarak veya gelecekte doğrudan aday olarak kullanılabilecek yeni, güçlü ve seçici miyozin inhibitörleri geliştirdik.Her zaman gerçek ve yanlış pozitif isabet ayırt etmek için ilgi enzim özgü farklı bir ATPase veya diğer fonksiyonel bir tsay kullanılması tavsiye edilir. Tüm proteinler plastik yüzeyleri bağlar. Bu sorun sonuçları oldukça etkileyebilir, özellikle protein düşük konsantrasyonlarda mevcutsa.Her zaman gereksiz sıvı işleme kaçının ve bağlayıcı olmayan tüpler kullanın. Alternatif ATPAz tahlilleri genellikle sülfürik asit, toksik maddeler veya radyoaktif maddelerin işlenmesini gerektirir. Buna karşılık, NADH'a bağlı ATPase tsay ı sadece toksisiteye sahip veya çok düşük olan reaktifler gerektirir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Sitosolion Glutatyon S-Transferazlarının Potansiyel Inhibitörleri için Spektrofotometrik Tarama

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Küçük Molekül Bileşiklerinin Hızlı ve Nicel Tespiti için Yanal Akış İmmünokromatografik Şeridinin Geliştirilmesi

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...