Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den nationale Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 31600250, Y.Z.), videnskab og teknologiprojekter i Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.), og det kinesiske Landbrugsforsknings system (Grant No. BILER-04-PS09, H.N.).

1. primer design
<ol><li>Design gen-specifikke primere for reverse transskription (RT) ved hjælp af PCR primer design software (tabel over materialer) baseret på de generelle regler for primer design17. Bemærk: RT primere er meget specifikke for målet udskrifter, og de er generelt forankret på 5 ' del af kodning sekvenser (modne mRNAs og forløber RNAs), eller ~ 500-600 NT nedstrøms for den forventede 5 ' ende (18s og 26s rrnas).</li>
	<li>Design par af...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

I en tidligere undersøgelse, samlede og mitokondrie RNAs fra cellesuspension kultur Arabidopsis blev brugt til at kort mitokondrie transkriptionen Termini af CRT-PCR, og lignende resultater blev opnået12. Men, kun beriget mitokondrie RNA blev brugt til at kort mitokondrie transkriptionen Termini i mange andre undersøgelser1,2,3,9. Vi fandt, at tilsætning af ...

I plante mitokondrier akkumuleres mange modne og forløbere RNAs som flere isoformer, og Steady-State udskrifter kan opdeles i to grupper baseret på forskellen på deres 5 ' Ends1,2,3, 4. De primære udskrifter har 5 ' trifosfat ender, som er afledt af transkription indledning. Derimod har de forarbejdede transskriptioner 5 ' monophosphat genereret ved post-transkriptional behandling. Diskrimination og kortlægning af de to typer af udskrifter er vigtigt at optrævle de molekylære mekanismer underliggende transskription og transkriptionen ende modning.
For at skelne mellem de primære og forarbejdede transskriptioner i plante mitokondrier er fire store strategier blevet udviklet. Den første strategi er at pre-behandle mitokondrie RNAs med tobak syre pyrofosfatase (TAP), som konverterer 5 ' trifosfat til monophosphat og gør det muligt for primære udskrifter at være cirkulariseret af RNA-Ligase. Afskriften af TAP-behandlede og ikke-behandlede RNA-prøver sammenlignes derefter ved hurtig forstærkning af cDNA-afslutninger (race) eller cirkulær RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den anden strategi, er forarbejdede udskrifter først udtømt fra mitokondrie RNAs bruger Terminator 5 '-fosfat-afhængige exonuclease (tex), og de primære udskrifter venstre er derefter kortlagt af primer Extension analyse5,6 . Den tredje strategi er at pre-Cap de primære udskrifter ved hjælp af bundne transferase, og derefter placeringen af triphosphated 5 ' Termini bestemmes af primer udvidelse sammen med ribonuklease eller S1 nuclease beskyttelse analyse7,8 ,9. Forskellig fra dem, afhængigt af tilstedeværelsen/fraværet af 5 ' trifosfat, den fjerde strategi kombinerer in vitro transskription, site-instrueret mutagenese, og primer forlængelse analyse til at karakterisere de formodede initiativtagere og bestemme transkriptionen startsteder8,10,11. Ved at bruge disse strategier, mange primære og forarbejdede udskrifter er blevet fastlagt i plante mitokondrier.
Men, flere undersøgelser har rapporteret, at 5 ' trifosfat af primære udskrifter var ustabile, og de var let omdannes til monophosphate for ukendt årsag2,4,12,13. Dette problem hindrer en klar diskrimination af de to typer af udskrifter ved hjælp af teknikker afhængigt af tilstedeværelsen/fraværet af 5 ' trifosfat, og tidligere bestræbelser på systematisk at diskriminere mellem de primære og forarbejdede udskrifter i plante mitokondrier mislykkedes2,12.
I denne protokol kombinerer vi cRT-PCR, RNA 5 ' polyfosfatasebehandling, RT-qPCR og Northern blot for systematisk at skelne mellem de primære og de behandlede udskrifter, som er stabilt akkumuleret i majs (Zea mays) mitokondrion (figur 1). cRT-PCR tillader samtidig kortlægning af 5 ' og 3 ' ekstremiteter af et RNA-molekyle, og det er normalt tilpasset til at kortlægge transkriptionen Termini i planter2,12,14,15. RNA 5 ' polyfosfatase kan fjerne to phosphater fra triphosphated 5 ' Termini, hvilket gør de primære udskrifter tilgængelige for selv ligering af RNA-Ligase. Tidligere undersøgelser viste, at modne 26s rRNA i majs havde forarbejdet 5 ' Terminus, og det var ufølsom over for RNA 5 ' polyfosfatase1,16. For at minimere indflydelsen af ustabil trifosfat i primær 5 ' Termini, normaliseres de 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs af modne 26s rRNA, og de primære og forarbejdede udskrifter differentieres derefter ved at sammenligne cRT-PCR-produkter fremstillet af de to RNA-prøver. Resultaterne af cRT-PCR-kortlægning og-diskrimination verificeres af henholdsvis Northern blot og RT-qPCR. Endelig anvendes alternative primere til at forstærke de udskrifter, der opdages i det nordlige blot, men ikke af cRT-PCR. Ved at bruge denne cRT-PCR-baserede strategi, er de fleste Steady-State udskrifter i majs betyder blevet differentieret og kortlagt1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

I plante-mitokondrier har nogle Steady-State udskrifter 5 ' trifosfat afledt af transkriptionsinitiering (primære udskrifter), mens de andre indeholder 5 ' monophosphat genereret post-transkriptivt (forarbejdede transkriptioner). At diskriminere mellem de to typer af udskrifter, er flere strategier blevet udviklet, og de fleste af dem er afhængige af tilstedeværelse/fravær af 5 ' trifosfat. Trifosfat i primær 5 ' Termini er imidlertid ustabil, og det hindrer en klar diskrimination af de to typer udskrifter. Vi har udviklet en cirkulær RT-PCR (cRT-PCR)-baseret strategi ved at kombinere cRT-PCR, RNA 5 ' polyfoshpatase-behandling, kvantitativ, for systematisk at differentiere og kort gøre de primære og forarbejdede transskriptioner, der er stabilt akkumuleret i majs mitochondrion. RT-PCR (RT-qPCR) og Northern blot. Som en forbedring omfatter denne strategi et RNA-normaliserings trin for at minimere indflydelsen fra ustabil 5 ' trifosfat.
I denne protokol er det berigede mitokondrielle RNA forbehandlet af RNA 5 ' polyfosfatase, som omdanner 5 ' triphsophad til monophosphat. Efter cirkularisering og reverse transskription, de to cDNAs afledt af 5 ' polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs er normaliseret med majs 26S modne rRNA, som har en forarbejdet 5 ' ende og er ufølsom over for 5 ' polyfosfatase. Efter normalisering diskrimineres de primære og forarbejdede udskrifter ved at sammenligne cRT-PCR-og RT-qPCR-produkter, der er fremstillet af de behandlede og ikke-behandlede RNAs. Transkriptionen Termini er bestemt ved kloning og sekvensering af cRT-PCR-produkterne og derefter verificeret af Northern blot.
Ved at bruge denne strategi, er de fleste Steady-State udskrifter i majs betyder blevet bestemt. På grund af den komplicerede afskrift mønster af nogle mitokondrie gener, et par Steady-State udskrifter blev ikke differentieret og/eller kortlagt, selv om de blev påvist i en Northern blot. Vi er ikke sikker på, om denne strategi er egnet til at diskriminere og kort de Steady-State udskrifter i andre plante mitokondrier eller i blødninger.

Vurdering af mitokondrie RNA-cirkulariserings effektivitet
I en tidligere undersøgelse, både total og mitokondrie RNAs blev brugt til cRT-PCR kortlægning af mitokondrie transkriptionen Termini i Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), og de to typer af RNAs gav lignende kortlægning resultater12. I første omgang brugte vi også total RNAs til cRT-PCR-kortlægning af mito...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskrimination og kortlægning af primære og forarbejdede transskriptioner i majs mitokondrier ved hjælp af en cirkulær RT-PCR-baseret strategi

Vi præsenterer en cirkulær RT-PCR-baseret strategi ved at kombinere cirkulær RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ' polyfosfatase-behandling og Northern blot. Denne protokol indeholder en normalisering skridt til at minimere indflydelsen af ustabile 5 ' trifosfat, og det er egnet til at diskriminere og kortlægge de primære og forarbejdede udskrifter stabilt akkumuleret i majs mitochondrion.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Denne protokol anvendes til kortlægning og forskelsbehandling af de primære og forarbejdede udskrifter i majs mitokondrier. Denne teknik omfatter et RNA-normaliseringstrin, og den minimerer indflydelsen fra ustabile fem prime tripfosfat, der hindrer en klar forskelsbehandling mellem den primære og den behandlede udskrifter. Ud over majs mitokondrier, kunne denne metode anvendes på plastids og andre plante mitokondrier.Start med at samle 20 gram udvikle kerner i et 50 milliliter rør på is. Overfør kernerne til en forkølet mørtel og tilsæt 10 til 20 milliliter iskold ekstraktionsbuffer. Grind kernerne helt, tilsæt mere ekstraktionsbuffer og filtrer jordvævet gennem to lag filterklud.Centrifuge filtrat ved 8, 000 gange G i 10 minutter. Overfør derefter supernatanten til et nyt rør og kassér filtratet. Centrifuge røret ved 20,000 gange G i 10 minutter.Hæld supernatanten af og re-suspendere pellet i seks milliliter vask buffer. Suspensionen anbringes i fem 1,5 milliliter RNase-frie rør og centrifugeres ved 14.000 gange G i fem minutter. Kassér supernatanten og fastfrys mitokondriel pellet i flydende nitrogen.Ekstrakt mitokondriel RNA ved hjælp af kommercielle reagenser i henhold til producentens anvisninger og oprette en RNA fem prime polyphosphaatase behandling. Derefter gendanne RNA med en RNA rensning kit. Reagensen til RNA-ekstraktion er farligt.Arbejd altid med den i en røghætte, og brug altid laboratoriekittel og handsker. Forbered to circulariseringsreaktioner med de samme mængder af fem primære polyfosfatasebehandlede og ikke-behandlede mitokondrielle RNA'er. Inkuber begge reaktioner ved 16 grader celsius i 12 til 16 timer og gendan derefter de selvasterede RNA'er med et tidligere brugt RNA-renseanlæg.Start med at forberede en primer blanding med et lige forhold på 26 SCRT og op til syv andre omvendt transskription primere. Saml to omvendte transskriptionsreaktionssystemer i henhold til manuskriptretningerne og inkuber dem ved 42 grader celsius i 50 minutter. For at normalisere cDNA skal du forberede to PCR-reaktioner med samme volumen cDNA'er fra de fem primære polyfosfatasebehandlede eller ikke-behandlede RNA'er og køre reaktionen under termocyklingsbetingelser, der er beskrevet i manuskriptet.Normalisering med 26S moden rRNA er et vigtigt skridt til at diskriminere mellem den primære og den forarbejdede udskrifter. Sammenlign overfloden af de to PCR-produkter, og optimer om nødvendigt normaliseringen ved at justere mængden af skabelon-cDNA'er. Forbered par PCR reaktioner med passende mængder af normaliserede cDNA's og et par divergerende primere som i de fem prime til tre prime krydset af målet udskrifter og udføre PCR i henhold til manuskriptet retninger.Brug derefter et gel DNA recovery kit til at isolere de fremtrædende bånd, der forstærkes af indlejret PCR. Klon gelen renset PCR produkter i en vektor ved hjælp af standard teknikker og udføre koloni PCR at vælge positive kloner, der indeholder målet skær. Sekvenser PCR-produkterne, og juster sekvensdataene til majs mitokondrielle genom ved hjælp af det grundlæggende lokale justeringssøgeværktøj eller BLAST.Vælg organismen majs og søgedatabase nukleotid indsamling. Find de fem prime til tre prime krydset af den cirkulære udskrift og bestemme placeringen af de fem prime og tre prime udskrift termini. Forstærke dna-fragmentet, der anvendes til at forberede RNA-sonden og klone den til den tidligere anvendte vektor, som indeholder en T7 promotor, 17 basepar opstrøms for indsætningsstedet.Mærk RNA-sonderne med dig-11-UTP, og udfør RNA-hybridisering ved hjælp af kommercielle sæt. Diskriminere den primære og forarbejdede fem prime ender ved at sammenligne de cirkulære RT-PCR produkter fremstillet af den normaliserede fem prime polyphosphatase behandlet og ikke-behandlet RNA's. Design derefter kvantitative RT-PCR-primere baseret på kortlægningsresultaterne, og kontroller diskriminationsresultaterne med RT-PCR.COX-2-genet blev brugt som eksempel til at påvise kortlægning og forskelsbehandling af majs mitokondrielle udskrifter med den cirkulære RT-PCR-baserede strategi. De normaliserede cDNA'er blev brugt som skabeloner til PCR, hvilket resulterede i to fremtrædende bånd forstærket fra de fem prime polyphosphatase behandlet prøve. De to bands blev navngivet COX-2 en og to inddrives fra gelen og klonet i vektorer.Colony PCR resultater viste, at de positive kloner indeholder skær med variabel størrelse, hvilket indebærer, at termini har heterogene fem prime eller tre prime termini. Sekvenseringsresultaterne viste, at COX-2 et og to har de samme tre primære ender ved 39 nukleotider neden for stop-codon, mens deres fem primære termini er placeret på henholdsvis 992 til 1, 030 og 1, 276 til 1, 283 nukleotider opstrøms for start-codon. RNA gel blot hybridisering blev udført for at kontrollere den cirkulære RT-PCR kortlægning resultater og to store bånd med størrelser svarende til COX-2 en og to blev opdaget.Et andet par divergerende primere blev designet til at forstærke COX-2 tre og fire bånd opdaget med RNA gel blot, men ikke med første gang cirkulære RT-PCR. De kvantitative RT-PCR-resultater bekræftede, at COX-2 en, to, tre og fire var følsomme over for fem prime polyphosphatase, og at de havde primær fem prime termini. Der kan udføres primer-udvidelsesanalyse for at verificere de fem primære tilknytningsresultater, selvom den ikke er inkluderet i denne protokol.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping og CRISPR / Cas9 redigering for at identificere et lægemiddelresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kortlægning Genome-wide tilgængelige kromatin i primære humane T lymfocytter af ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Tilpasse 3' slutter hurtige forstærkning af CDNA for at kortlægge udskrifter i kræft

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Ved hjælp af Ustilago maydis som en trojansk hest for i Situ levering af majs proteiner

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Kendetegner Histon posttranslationel modifikation ændringer i gær Neurodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...