Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 31600250, Y.Z.), Science and Technology Projects van Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) en het China Agricultural Research systeem (Grant No. AUTO'S-04-PS09, H.N.).

1. ontwerp van de primer
<ol><li>Ontwerp genspecifieke primers voor reverse transcriptie (RT) met behulp van PCR-primer ontwerp software (Inhoudsopgave) op basis van de algemene regels van Primer design17. Opmerking: RT-primers zijn zeer specifiek voor de doel transcripten, en ze zijn over het algemeen verankerd op het 5 ' deel van programmeer sequenties (volwassen Mrna's en precursor Rna's), of ~ 500 – 600 NT stroomafwaarts van de verwachte 5 ' end (18S en...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

In een eerdere studie werden de totale en mitochondriale Rna's van celsuspensie cultuur van Arabidopsis gebruikt om de mitochondriale transcriptie Termini door CRT-PCR in kaart te krijgen, en vergelijkbare resultaten werden behaald12. Echter, alleen verrijkt mitochondriaal RNA werd gebruikt voor het in kaart te gaan van de mitochondriale transcript Termini in vele andere studies1,2,3,<...

In de mitochondriën van de plant, veel volwassen en precursor rna's worden opgebouwd als meerdere isoforms, en de steady-state transcripten kunnen worden onderverdeeld in twee groepen op basis van het verschil op hun 5 ' eindigt1,2,3, 4. De primaire transcripten hebben 5 ' trifosfaat uiteinden, die zijn afgeleid van transcriptie initiatie. De verwerkte transcripten daarentegen hebben 5 ' monofosfaat gegenereerd door post-transcriptionele verwerking. Discriminatie en mapping van de twee soorten transcripten zijn belangrijk voor het ontrafelen van de moleculaire mechanismen onderliggende transcriptie en transcriptie einde rijping.
Om onderscheid te maken tussen de primaire en verwerkte transcripten in de mitochondrion van de fabriek, zijn vier belangrijke strategieën ontwikkeld. De eerste strategie is het pre-behandelen van de mitochondriale Rna's met tabaks zuur pyrofosfatase (TAP), die 5 ' trifosfaat naar monofosfaat converteert en maakt het mogelijk primaire transcripten om te worden gecircuariseerd door RNA ligase. De transcriptie van de door tap behandelde en niet-behandelde RNA-monsters wordt vervolgens vergeleken met een snelle versterking van de cDNA-uiteinden (RAS) of de circulaire RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. In de tweede strategie worden verwerkte transcripten in de eerste plaats uitgeput van mitochondriale rna's met behulp van Terminator 5 '-fosfaat-afhankelijke exonuclease (tex), en de primaire transcripten links worden vervolgens in kaart gebracht door de primer extensie analyse5,6 . De derde strategie is de pre-Cap van de primaire transcripten met guanylyl transferase, en dan is de positie van trifosfated 5 ' Termini wordt bepaald door primer uitbreiding samen met ribonuclease of S1 Nuclease bescherming analyse7,8 ,9. Verschillend van die afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat, de vierde strategie combineert in vitro transcriptie, site-gerichte mutagenese, en primer extensie analyse om de putende promotors karakteriseren en bepalen de transcriptie initiatie plaatsen8,10,11. Door het gebruik van deze strategieën, veel primaire en verwerkte transcripten zijn vastgesteld in de mitochondriën van de plant.
Echter, verschillende studies hebben gemeld dat de 5 ' trifosfaat van primaire transcripten waren instabiel, en ze werden gemakkelijk omgezet in monofosfaat voor onbekendereden2,4,12,13. Dit probleem belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripties met behulp van technieken, afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat, en eerdere pogingen om systematisch onderscheid te maken tussen de primaire en verwerkte transcripten in plant mitochondriën mislukte2,12.
In dit protocol combineren we cRT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase Treatment, RT-qPCR en Northern Blot om systematisch de primaire en verwerkte transcripten te onderscheiden die stabiel zijn opgebouwd in maïs (Zea mays) mitochondrion (Figuur 1). cRT-PCR maakt gelijktijdige mapping mogelijk van 5 ' en 3 ' extremiteiten van een RNA-molecuul, en het is meestal aangepast aan de map transcript Termini in planten2,12,14,15. RNA 5 ' poly fosfatase kan twee fosfaten uit het trifosfaat 5 ' Termini verwijderen, waardoor de primaire transcripten beschikbaar zijn voor zelf-ligatie door RNA ligase. Eerdere studies toonden aan dat volwassen 26s rRNA in maïs 5 ' eindpunt had verwerkt en ongevoelig was voor RNA 5 ' poly fosfatase1,16. Om de invloed van unstable trifosfaat op primaire 5 ' Termini te minimaliseren, worden de 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's genormaliseerd door volwassen 26s rRNA, en de primaire en verwerkte transcripten worden vervolgens gedifferentieerd door het vergelijken van de cRT-PCR-producten verkregen uit de twee RNA-monsters. De cRT-PCR-mapping en de discriminatie resultaten worden gecontroleerd door respectievelijk Northern Blot en RT-qPCR. Tot slot worden alternatieve primers gebruikt om die transcripten die in Northern Blot zijn gedetecteerd, maar niet door cRT-PCR, te versterken. Door deze cRT-PCR-gebaseerde strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion gedifferentieerd en toegewezen1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

In de mitochondriën van de plant, sommige steady-state transcripten hebben 5 ' trifosfaat afgeleid van transcriptie initiatie (primaire transcripten), terwijl de anderen bevatten 5 ' monofosfaat gegenereerd post-transcriptioneel (verwerkte transcripties). Om onderscheid te maken tussen de twee soorten transcripties, zijn verschillende strategieën ontwikkeld, en de meeste ervan zijn afhankelijk van aanwezigheid/afwezigheid van 5 ' trifosfaat. Echter, het trifosfaat op primaire 5 ' Termini is instabiel, en het belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripten. Om de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn opgebouwd in maïs mitochondrion systematisch te differentiëren en in kaart te krijgen, hebben we een circulaire RT-PCR (cRT-PCR)-gebaseerde strategie ontwikkeld door de combinatie van cRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase Treatment, kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR) en Northern Blot. Als een verbetering, deze strategie omvat een RNA normalisatie stap om de invloed van unstable 5 ' trifosfaat te minimaliseren.
In dit protocol wordt het verrijkte mitochondriale RNA voorbehandeld door RNA 5 ' polyphosphatase, dat 5 ' triphsophate naar monofosfaat converteert. Na circularisatie en omgekeerde transcriptie worden de twee Cdna's die zijn afgeleid van 5 ' polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna's genormaliseerd door maïs 26S volwassen rRNA, die een verwerkte 5 ' end heeft en ongevoelig is voor 5 ' poly fosfatase. Na normalisatie worden de primaire en verwerkte transcripten gediscrimineerd door het vergelijken van cRT-PCR-en RT-qPCR-producten die zijn verkregen uit de behandelde en niet-behandelde Rna's. Het transcript Termini wordt bepaald door het klonen en sequentiëren van de cRT-PCR-producten, en vervolgens geverifieerd door Northern Blot.
Door deze strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion vastgesteld. Vanwege het gecompliceerde transcript patroon van sommige mitochondriale genen, werden een paar steady-state Transcripten niet gedifferentieerd en/of in kaart gebracht, hoewel ze in een Northern Blot werden aangetroffen. We zijn er niet zeker van of deze strategie geschikt is om de steady-state transcripten in andere mitochondriën van de plant of in plastiden te discrimineren en in kaart te krijgen.

Schatting van mitochondriale RNA circularisatie efficiëntie
In een eerdere studie werden zowel totale als mitochondriale Rna's gebruikt voor cRT-PCR-mapping van mitochondriale transcript Termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), en de twee soorten rna's gaven vergelijkbare mapping resultaten12. In eerste instantie gebruikten we ook Total Rna's voor cRT-PCR-mapping ...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

We presenteren een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie door het combineren van circulaire RT-PCR, kwantitatieve RT-PCR, RNA 5 ' poly hosphatase-Treatment, en Northern Blot. Dit protocol bevat een normalisatie stap om de invloed van onstabiel 5 ' trifosfaat te minimaliseren, en het is geschikt voor het discrimineren en in kaart brengen van de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn verzameld in maïs-mitochondrion.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Dit protocol wordt gebruikt voor het in kaart brengen en discrimineren van de primaire en verwerkte transcripties in maïsmitochondriën. Deze techniek omvat een RNA normalisatie stap en het minimaliseren van de invloed van onstabiele vijf prime triphosfate dat een duidelijke discriminatie tussen de primaire en de verwerkte transcripties belemmert. Naast maïsmitochondriën kan deze methode worden toegepast op plastiden en andere plantaardige mitochondriën.Begin met het verzamelen van 20 gram ontwikkelende pitten in een buis van 50 milliliter op ijs. Breng de pitten over op een voorgekoelde mortel en voeg 10 tot 20 milliliter ijskoude extractiebuffer toe. Maal de pitten volledig, voeg meer extractiebuffer toe en filter het grondweefsel door twee lagen filterdoek.Centrifuge het filtraat op 8.000 keer G gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe buis en gooi het filtraat weg. Centrifuge de buis op 20.000 keer G gedurende 10 minuten.Giet de supernatant af en hang de pellet opnieuw op in zes milliliter wasbuffer. Aliquot de schorsing in vijf 1,5 milliliter RNase-vrije buizen en centrifugeren ze op 14,000 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en bevries de mitochondriale pellet in vloeibare stikstof.Extraheeren mitochondriaal RNA met behulp van commerciële reagentia volgens de instructies van de fabrikant en het opzetten van een RNA vijf prime polyfosfaatase behandeling. Herstel vervolgens het RNA met een RNA-zuiveringskit. Het reagens dat wordt gebruikt voor RNA-extractie is gevaarlijk.Werk er altijd mee in een rookkap en draag altijd een labjas en handschoenen. Bereid twee circularisatiereacties voor met dezelfde hoeveelheden van vijf behandelde primaire polyfosfatase en niet-behandelde mitochondriale RNA's. Incubeer beide reacties op 16 graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur en herstel vervolgens de zelf-ligated RNA's met een eerder gebruikte RNA zuivering kit.Begin met het voorbereiden van een primer mengsel met een gelijke verhouding van 26 SCRT en maximaal zeven andere omgekeerde transcriptie primers. Monteer twee omgekeerde transcriptiereactiesystemen volgens de handschriftaanwijzing en broed ze gedurende 50 minuten uit op 42 graden Celsius. Om de cDNA te normaliseren, bereidt u twee PCR-reacties voor met hetzelfde volume cDNA's uit de vijf eerstgefosfatase behandelde of niet-behandelde RNA's en voert u de reactie uit onder thermocyclingomstandigheden die in het manuscript worden beschreven.Normalisatie door 26S volwassen rRNA is een belangrijke stap om onderscheid te maken tussen de primaire en de verwerkte transcripties. Vergelijk de overvloed van de twee PCR-producten en optimaliseer indien nodig de normalisatie door de hoeveelheden sjabloon-cDNA's aan te passen. Bereid paren van PCR reacties met de juiste volumes van genormaliseerde cDNA's en een paar divergerende primers zoals in de vijf prime tot drie prime junction van de doeltranscripties en voer PCR volgens het manuscript richtingen.Gebruik vervolgens een gel DNA recovery kit om de prominente banden te isoleren die worden versterkt door geneste PCR. Kloon de gel gezuiverde PCR-producten in een vector met behulp van standaardtechnieken en voer kolonie PCR uit om positieve klonen te selecteren die de doelinserts bevatten. Sequentie van de PCR-producten en lijn de sequencing gegevens met de maïs mitochondriaal genoom met behulp van de fundamentele lokale uitlijning search tool of BLAST.Kies de organismemaïs en zoek database nucleotide collectie. Zoek de vijf prime tot drie prime junction van de gecirculeerde transcript en bepalen van de posities van de vijf prime en drie prime transcript termini. Versterk het DNA-fragment dat wordt gebruikt om de RNA-sonde voor te bereiden en te klonen aan de eerder gebruikte vector die een T7-promotor bevat, 17 basisparen stroomopwaarts van de invoegplaats.Label de RNA-sondes met dig-11-UTP en voer RNA-hybridisatie uit met commerciële kits. Onderscheid de primaire en verwerkte vijf priemeinden door de circulaire RT-PCR-producten te vergelijken die zijn verkregen uit de genormaliseerde vijf hoofdpolyfotase die behandeld wordt en niet-behandelde RNA's. Ontwerp vervolgens kwantitatieve RT-PCR primers op basis van de kaartresultaten en controleer de discriminatieresultaten met RT-PCR.Het COX-2 gen werd gebruikt als voorbeeld om de mapping en discriminatie van maïs mitochondriale transcripties aan te tonen met de circulaire RT-PCR gebaseerde strategie. De genormaliseerde cDNA's werden gebruikt als sjablonen voor PCR, wat resulteerde in twee prominente banden versterkt uit de vijf prime polyfosfatase behandeld monster. De twee bands kregen de naam COX-2 een en twee hersteld van de gel en gekloond in vectoren.Kolonie PCR resultaten toonden aan dat de positieve klonen inserts met variabele grootte bevatten, wat impliceert dat de termini heterogene vijf prime of drie prime termini hebben. De sequencing resultaten toonden aan dat COX-2 een en twee hebben dezelfde drie priemgeste eindigt op 39 nucleotiden stroomafwaarts van de stop codon, terwijl hun vijf prime termini bevinden zich op 992 tot 1, 030 en 1, 276 tot 1, 283 nucleotides upstream van de start codon, respectievelijk. RNA gel blot hybridisatie werd uitgevoerd om de circulaire RT-PCR mapping resultaten te verifiëren en twee grote banden met maten vergelijkbaar met COX-2 een en twee werden gedetecteerd.Een ander paar divergerende primers werden ontworpen om de COX-2 drie en vier banden gedetecteerd met de RNA gel vlek te versterken, maar niet met de eerste keer circulaire RT-PCR. De kwantitatieve RT-PCR resultaten bevestigden dat COX-2 een, twee, drie en vier gevoelig waren voor vijf prime polyfosfatase en dat ze primaire vijf prime termini hadden. Primer-extensieanalyse kan worden uitgevoerd om de vijf prime mapping-resultaten te verifiëren, hoewel deze niet in dit protocol is opgenomen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Aanpassing 3' de snelle versterking van CDNA uiteinden kaart afschriften bij kanker

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...