Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (subvention no 31600250, Y.Z.), les projets scientifiques et technologiques de la ville de Guangzhou (subvention no 201804020015, H.N.), et le China Agricultural Research System (subvention no. CARS-04-PS09, H.N.).

1. Conception d'apprêt
<ol><li>Concevoir des amorces spécifiques aux gènes pour la transcription inversée (RT) à l'aide d'un logiciel de conception d'amorce PCR (Table of Materials) basé sur les règles générales de conception d'amorce17. REMARQUE: Les amorces DE sont très spécifiques aux transcriptions cibles, et elles sont généralement ancrées sur la partie 5' des séquences de codage (ARNm matures et ARN précurseurs), ou 500 à 600 nt en aval...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux de la culture de suspension cellulaire d'Arabidopsis ont été employés pour cartographier le termini mitochondrial de transcription par cRT-PCR, et des résultats semblables ont été obtenus12. Cependant, seulement l'ARN mitochondrial enrichi a été employé pour cartographier le termini de transcription mitochondrial dans beaucoup d'autres études1,2,<s...

Dans les mitochondries végétales, de nombreux ARN matures et précurseurs sont accumulés sous forme d'isoformes multiples, et les transcriptions à état stable peuvent être divisées en deux groupes en fonction de la différence à leurs 5' extrémités1,2,3, 4. Les transcriptions primaires ont des extrémités triphosphate de 5' qui sont dérivées de l'initiation de transcription. En revanche, les transcriptions traitées ont 5' monophosphate généré par le traitement post-transcriptionnel. La discrimination et la cartographie des deux types de transcriptions sont importantes pour démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transcription et à la maturation de fin de transcription.
Pour faire la distinction entre les transcriptions primaires et traitées dans la mitochondrie végétale, quatre stratégies majeures ont été élaborées. La première stratégie consiste à prétraiter les ARN mitochondriaux avec de la pyrophosphatase (TAP) à l'acide du tabac, qui convertit le triphosphate de 5 po en monophosphate et permet de circulariser les transcriptions primaires par la ligase d'ARN. Les abondances de transcription des échantillons d'ARN TAP-traités et non-traités sont alors comparées par l'amplification rapide des extrémités de cDNA (RACE) ou circulaires RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. Dans la deuxième stratégie, les transcriptions traitées sont d'abord épuisées des ARN mitochondriaux à l'aide de l'exonuclease (TEX) de terminator 5'-phosphate-dépendant, et les transcriptions primaires restantes sont ensuite cartographiées par l'analyse d'extension d'amorce5,6 . La troisième stratégie consiste à précaper les transcriptions primaires à l'aide de la gouanylyl transferase, puis la position du termini triphosphated 5' est déterminée par extension d'amorce avec l'analyse de protection de nucléane de ribonuclease ou de S17,8 ,9. Différente de celles selon la présence/absence du triphosphate de 5', la quatrième stratégie combine la transcription in vitro, la mutagénèse dirigée par le site, et l'analyse d'extension d'amorce pour caractériser les promoteurs putatifs et déterminer la transcription sites d'initiation8,10,11. En utilisant ces stratégies, de nombreuses transcriptions primaires et traitées ont été déterminées dans les mitochondries végétales.
Cependant, plusieurs études ont rapporté que le triphosphate de 5' des transcriptions primaires étaient instables, et ils ont été facilement convertis en monophosphate pour la raison inconnue2,4,12,13. Ce problème entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions en utilisant des techniques en fonction de la présence/absence de triphosphate de 5', et les efforts antérieurs pour discriminer systématiquement entre les transcriptions primaires et traitées dans les usines mitochondries a échoué2,12.
Dans ce protocole, nous combinons cRT-PCR, RNA 5' traitement polyphosphatase, RT-qPCR, et la tache du Nord pour distinguer systématiquement les transcriptions primaires et traitées stablement accumulées dans le maïs (Zea mays) mitochondndrion (Figure 1). cRT-PCR permet la cartographie simultanée des extrémités de 5' et 3' d'une molécule d'ARN, et il est généralement adapté pour cartographier les termini de transcription dans les plantes2,12,14,15. La polyphosphatase de l'ARN 5' pourrait enlever deux phosphates du termini triphosphated 5', qui rend les transcriptions primaires disponibles pour l'auto-ligaation par ligase d'ARN. Des études antérieures ont montré que l'ARNr 26S mature dans le maïs avait traité le terminus de 5' et qu'il était insensible à la polyphosphatase1,16. Afin de minimiser l'influence du triphosphate instable au termini primaire de 5', les ARN de 5' traités par polyphosphatase et non traités sont normalisés par l'ARNr 26S mature, et les transcriptions primaires et traitées sont ensuite différenciées en comparant le cRT-PCR provenant des deux échantillons d'ARN. Les résultats de la cartographie et de la discrimination cRT-PCR sont vérifiés par Northern blot et RT-qPCR, respectivement. Enfin, d'autres amorces sont utilisées pour amplifier les transcriptions détectées dans Northern blot, mais pas par cRT-PCR. En utilisant cette stratégie basée sur le cRT-PCR, la plupart des transcriptions à état stable dans la mitochondrie du maïs ont été différenciées et cartographiées1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

Dans les mitochondries végétales, certaines transcriptions à état stable contiennent un triphosphate de 5' dérivé de l'initiation à la transcription (transcriptions primaires), tandis que les autres contiennent 5' monophosphate généré sapostolassme post-transcriptionnelle (transcriptions traitées). Pour faire la distinction entre les deux types de transcriptions, plusieurs stratégies ont été élaborées, et la plupart d'entre elles dépendent de la présence ou de l'absence de triphosphate de 5'. Cependant, le triphosphate au termini primaire de 5' est instable, et il entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions. Pour différencier et cartographier systématiquement les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs, nous avons développé une stratégie circulaire basée sur la RT-PCR (cRT-PCR) en combinant cRT-PCR, RNA 5' traitement polyphoshpatase, quantitatif RT-PCR (RT-qPCR), et Northern blot. À titre d'amélioration, cette stratégie comprend une étape de normalisation de l'ARN pour minimiser l'influence du triphosphate instable de 5'.
Dans ce protocole, l'ARN mitochondrial enrichi est pré-traité par l'ARN 5' polyphosphatase, qui convertit 5' triphsophate en monophosphate. Après la circularisation et la transcription inverse, les deux CDNA dérivés de 5' polyphosphatase-traités et non-traités RNAs sont normalisés par le maïs 26S rRNA mature, qui a une extrémité traitée de 5' et est insensible à 5' polyphosphatase. Après normalisation, les transcriptions primaires et traitées sont discriminées en comparant les produits cRT-PCR et RT-qPCR obtenus à partir des ARN traités et non traités. Les termini de transcription sont déterminés par le clonage et le séquençage des produits cRT-PCR, puis vérifiés par la tache nordique.
En utilisant cette stratégie, la plupart des transcriptions à l'état stable dans la mitochondrie du maïs ont été déterminées. En raison du modèle compliqué de transcription de quelques gènes mitochondriques, quelques transcriptions stables-état n'ont pas été différenciées et/ou cartographiées, bien qu'elles aient été détectées dans une tache nordique. Nous ne sommes pas sûrs si cette stratégie est appropriée pour discriminer et cartographier les transcriptions à état stable dans d'autres mitochondries végétales ou dans les plastides.

Estimation de l'efficacité de la circularisation de l'ARN mitochondrial
Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux ont été utilisés pour la cartographie cRT-PCR de termini de transcription mitochondriale dans Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), et les deux types d'ARN ont donné des résultats de cartographie similaires12. Au départ, nous avons ?...

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Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discrimintion et cartographie des transcriptions primaires et traitées dans la mitochondndrion de maïs à l'aide d'une stratégie circulaire basée sur rt-PCR

Nous présentons une stratégie circulaire basée sur RT-PCR en combinant la RT-PCR circulaire, la RT-PCR quantitative, le traitement polyphosphatase d'ARN 5' et la tache nordique. Ce protocole comprend une étape de normalisation pour minimiser l'influence du triphosphate instable de 5' et il convient de discriminer et de cartographier les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Ce protocole est utilisé pour la cartographie et la discrimination des transcriptions primaires et traitées dans les mitochondries de maïs. Cette technique comprend une étape de normalisation de l’ARN et elle minimise l’influence de cinq triphosphates premiers instables qui entravent une discrimination claire entre les transcriptions primaires et traitées. Outre les mitochondries de maïs, cette méthode pourrait être appliquée aux plastides et autres mitochondries végétales.Commencez par recueillir 20 grammes de grains en développement dans un tube de 50 millilitres sur la glace. Transférer les grains dans un mortier pré-refroidi et ajouter 10 à 20 millilitres de tampon d’extraction du froid glacé. Moudre complètement les grains, ajouter plus de tampon d’extraction et filtrer le tissu au sol à travers deux couches de tissu filtrant.Centrifuger le filtrate à 8000 fois G pendant 10 minutes. Ensuite, transférez le supernatant dans un nouveau tube et jetez le filtrate. Centrifuger le tube à 20 000 fois G pendant 10 minutes.Verser le supernatant et suspendre à nouveau la pastille en six millilitres de tampon de lavage. Aliquot la suspension en cinq tubes sans RNase de 1,5 millilitre et les centrifugeuse à 14 000 fois G pendant cinq minutes. Jeter le supernatant et congeler la pastille mitochondriale dans de l’azote liquide.Extraire l’ARN mitochondrial à l’aide de reagents commerciaux selon les instructions du fabricant et mettre en place un ARN cinq traitement de polyphosphaatase premier. Ensuite, récupérez l’ARN avec un kit de purification de l’ARN. Le reagent utilisé pour l’extraction de l’ARN est dangereux.Toujours travailler avec elle dans une hotte de fumée et toujours porter un manteau de laboratoire et des gants. Préparez deux réactions de circularisation en utilisant les mêmes quantités de cinq polyphosphatase de premier choix traités et non traités ARN mitochondrial. Incuber les deux réactions à 16 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures, puis récupérer l’ARN auto-ligated avec un kit de purification de l’ARN précédemment utilisé.Commencez par préparer un mélange d’apprêt avec un rapport égal de 26 SCRT et jusqu’à sept autres amorces de transcription inversée. Assembler deux systèmes de réaction de transcription inverse selon les instructions manuscrites et les incuber à 42 degrés Celsius pendant 50 minutes. Pour normaliser l’ADNC, préparez deux réactions pcr avec le même volume d’ADN des cinq principaux ARN traités ou non traités et exécutez la réaction dans des conditions de thermocyclisme décrites dans le manuscrit.La normalisation par rRNA mature 26S est une étape clé pour discriminer entre les transcriptions primaires et traitées. Comparez l’abondance des deux produits PCR et, si nécessaire, optimisez la normalisation en ajustant les quantités d’ADN modèle. Préparez des paires de réactions PCR avec des volumes appropriés d’ADN normalisé et une paire d’amorces divergentes comme dans la jonction de cinq premiers à trois premiers des transcriptions cibles et effectuez pcr selon les directives manuscrites.Ensuite, utilisez un kit de récupération d’ADN de gel pour isoler les bandes proéminentes qui sont amplifiées par pcr imbriqué. Clonez les produits PCR purifiés par gel en un vecteur à l’aide de techniques standard et effectuez le PCR de la colonie pour sélectionner des clones positifs contenant les inserts cibles. Séquencez les produits PCR et alignez les données de séquençage avec le génome mitochondrial du maïs à l’aide de l’outil local de recherche d’alignement de base ou BLAST.Choisissez la collection de nucléotides de la base de données de recherche et de maïs de l’organisme. Trouvez la jonction principale à trois de la transcription circulaire et déterminez les positions des cinq termini de transcription principaux et de trois principaux. Amplifiez le fragment d’ADN utilisé pour préparer la sonde ARN et clonez-la au vecteur précédemment utilisé qui contient un promoteur T7, 17 paires de base en amont du site d’insertion.Étiquetez les sondes ARN avec dig-11-UTP et effectuez l’hybridation de l’ARN à l’aide de kits commerciaux. Discriminer les cinq extrémités primaires et traitées en comparant les produits circulaires RT-PCR obtenus à partir des cinq polyphosphatase primaires normalisées traitées et non traitées arn. Ensuite, concevez des amorces quantitatives RT-PCR basées sur les résultats de la cartographie et vérifiez les résultats de discrimination avec RT-PCR.Le gène COX-2 a été utilisé comme exemple pour démontrer la cartographie et la discrimination des transcriptions mitochondriques du maïs avec la stratégie circulaire basée sur rt-PCR. Les CDNA normalisés ont été utilisés comme modèles pour pcr, qui ont eu comme conséquence deux bandes proéminentes amplifiées des cinq échantillons traités principaux de polyphosphatase. Les deux bandes ont été nommées COX-2 une et deux récupérées du gel et clonées en vecteurs.Les résultats du PCR de colonie ont montré que les clones positifs contiennent des inserts de taille variable, ce qui implique que les termini ont hétérogène cinq premiers ou trois termini premiers. Les résultats de séquençage ont montré que COX-2 un et deux ont les mêmes trois extrémités principales à 39 nucléotides en aval du codon d’arrêt tandis que leurs cinq termini principaux sont situés à 992 à 1,030 et 1, 276 à 1, 283 nucléotides en amont du codon de départ, respectivement. L’hybridation circulaire de tache de gel d’ARN a été exécutée pour vérifier les résultats circulaires de cartographie de RT-PCR et deux bandes principales avec des tailles semblables à COX-2 un et deux ont été détectées.Une autre paire d’amorces divergentes ont été conçues pour amplifier les bandes COX-2 trois et quatre détectées avec la tache de gel d’ARN mais pas avec rt-PCR circulaire de première fois. Les résultats quantitatifs de RT-PCR ont confirmé que COX-2 un, deux, trois et quatre étaient sensibles à cinq polyphosphatase primaire et qu’ils ont eu les cinq termini principaux primaires. L’analyse de l’extension de l’amorce pourrait être effectuée pour vérifier les cinq principaux résultats de la cartographie, bien qu’elle ne soit pas incluse dans ce protocole.

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