Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 31600250, Y.Z.), Science and Technology Projects of Guangzhou City (Grant-Nr. 201804020015, H.N.) und dem China Agricultural Research System (Grant-Nr. CARS-04-PS09, H.N.).

1. Primer Design
<ol><li>Entwerfen Sie genspezifische Primer für die Reverse Transkription (RT) mit PCR Primer Design Software (Table of Materials) basierend auf den allgemeinen Regeln des Primer Designs17. HINWEIS: RT-Primer sind sehr spezifisch für die Zieltranskripte und sind in der Regel auf dem 5' Teil der Codierungssequenzen (reife mRNAs und Vorläufer-RNAs) oder 500–600 nt stromabwärts des erwarteten 5'-Ends (18S und 26S rRNAs) verankert.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

In einer früheren Studie wurden totale und mitochondriale RNAs aus der Zellsuspensionskultur von Arabidopsis verwendet, um mitochondriale Transkript-Termini durch cRT-PCR zu kartieren, und ähnliche Ergebnisse wurden12erzielt. Jedoch, nur angereicherte mitochondriale RNA wurde verwendet, um mitochondriale Transkript termini in vielen anderen Studien1,2,3,9. Wir...

In pflanzlichen Mitochondrien werden viele reife und Vorläufer-RNAs als mehrere Isoformen angesammelt, und die stationären Transkripte können in zwei Gruppen unterteilt werden, basierend auf der Differenz an ihren 5' Enden1,2,3, 4. Die primären Transkripte haben 5' Triphosphatendenden, die aus der Transkriptionioninitiation abgeleitet sind. Im Gegensatz dazu haben die verarbeiteten Transkripte 5' Monophosphat, das durch posttranskriptielle Verarbeitung erzeugt wird. Diskriminierung und Kartierung der beiden Arten von Transkripten sind wichtig, um die molekularen Mechanismen zu entwirren, die der Transkription und Transkriptendreifung zugrunde liegen.
Um zwischen den primären und verarbeiteten Transkripten im pflanzlichen Mitochondrion zu unterscheiden, wurden vier Hauptstrategien entwickelt. Die erste Strategie besteht darin, die mitochondrialen RNAs mit Tabaksäurepyrophosphatase (TAP) vorzubehandeln, die 5' Triphosphat in Monophosphat umwandelt und die Zirkularisierung von Primärtranskripten durch RNA-Ligase ermöglicht. Die Transkriptsfülle von TAP-behandelten und nicht behandelten RNA-Proben wird dann durch schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) oder kreisförmiger RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4verglichen. In der zweiten Strategie werden die verarbeiteten Transkripte zunächst von mitochondrialen RNAs mit Terminator 5'-phosphatabhängiger Exonuklease (TEX) aufgebraucht, und die primären Transkripte werden dann durch Primer-Erweiterungsanalyse5,6 . Die dritte Strategie besteht darin, die primären Transkripte mit Guanylyltransferase vorab zu begrenzen, und dann wird die Position der triphosphierten 5' Termini durch Primerverlängerung zusammen mit der Ribonuklease- oder S1-Nukleaseschutzanalyse7,8 bestimmt. ,9. Anders als je nach Vorhandensein/Abwesenheit von 5'-Triphosphat kombiniert die vierte Strategie In-vitro-Transkription, standortgesteuerte Mutagenese und Primer-Erweiterungsanalyse, um die vermeintlichen Promotoren zu charakterisieren und die Transkription zu bestimmen. Initiationsstandorte8,10,11. Durch die Verwendung dieser Strategien wurden viele primäre und verarbeitete Transkripte in pflanzlichen Mitochondrien bestimmt.
Mehrere Studien haben jedoch berichtet, dass die 5' Triphosphat der primären Transkripte instabil waren, und sie wurden leicht in Monophosphat aus unbekanntem Grund umgewandelt2,4,12,13. Dieses Problem verhindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten, indem Techniken verwendet werden, die vom Vorhandensein/Fehlen von 5'-Triphosphat abhängen, und frühere Bemühungen, systematisch zwischen den primären und den verarbeiteten Transkripten in Pflanzen zu unterscheiden. mitochondrien fehlgeschlagen2,12.
In diesem Protokoll kombinieren wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung, RT-qPCR und Northern Blot, um systematisch die primären und verarbeiteten Transkripte zu unterscheiden, die in Mais (Zea mays) Mitochondrion angesammelt wurden (Abbildung 1). cRT-PCR ermöglicht die gleichzeitige Kartierung von 5' und 3' Extremitäten eines RNA-Moleküls, und es ist in der Regel angepasst, um Transkript-Termini in Pflanzen2,12,14,15. DIE Polyphosphatase von RNA 5 könnte zwei Phosphate aus dem triphosphatierten 5' Termini entfernen, wodurch die primären Transkripte für die Selbstligation durch RNA-Ligase verfügbar sind. Frühere Studien zeigten, dass reife 26S rRNA in Mais 5' Endstation verarbeitet hatte, und es war unempfindlich gegen RNA 5' Polyphosphatase1,16. Um den Einfluss von instabilem Triphosphat auf primäre 5' Termini zu minimieren, werden die 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs durch ausgereifte 26S rRNA normalisiert, und die primären und verarbeiteten Transkripte werden dann durch cRT-PCR-Produkte, die aus den beiden RNA-Proben gewonnen wurden. Die CRT-PCR-Mapping- und Diskriminierungsergebnisse werden von Northern Blot bzw. RT-qPCR überprüft. Schließlich werden alternative Primer verwendet, um die Transkripte zu verstärken, die im nördlichen Blot, aber nicht durch cRT-PCR erkannt wurden. Durch die Verwendung dieser cRT-PCR-basierten Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion differenziert und kartiert1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

In pflanzlichen Mitochondrien enthalten einige stationäre Transkripte 5' Triphosphat, das aus der Transkriptioninitiierung abgeleitet wurde (primäre Transkripte), während die anderen 5' Monophosphat enthalten, das posttranskriptional erzeugt wurde (verarbeitete Transkripte). Um zwischen den beiden Arten von Transkripten zu unterscheiden, wurden mehrere Strategien entwickelt, und die meisten von ihnen hängen von der Anwesenheit/Abwesenheit von 5' Triphosphat ab. Das Triphosphat bei primären 5' Termini ist jedoch instabil und behindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten. Um die primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt wurden, systematisch zu differenzieren und abzubilden, haben wir eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie entwickelt, indem wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphoshpatase-Behandlung, quantitative RT-PCR (RT-qPCR) und Northern Blot. Als Verbesserung beinhaltet diese Strategie einen RNA-Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren.
In diesem Protokoll wird die angereicherte mitochondriale RNA mit RNA 5' Polyphosphatase vorbehandelt, die 5' Triphsophat in Monophosphat umwandelt. Nach Zirkularisierung und umgekehrter Transkription werden die beiden cDNAs, die aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs abgeleitet wurden, durch Mais 26S reife rRNA normalisiert, die ein verarbeitetes 5' Ende hat und unempfindlich gegen 5' Polyphosphatase ist. Nach der Normalisierung werden die primären und verarbeiteten Transkripte durch den Vergleich von cRT-PCR- und RT-qPCR-Produkten aus den behandelten und nicht behandelten RNAs diskriminiert. Die Transkript-Termini werden durch Klonen und Sequenzieren der cRT-PCR-Produkte bestimmt und dann durch Northern Blot überprüft.
Mit dieser Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion bestimmt. Aufgrund des komplizierten Transkriptmusters einiger mitochondrialer Gene wurden einige stationäre Transkripte nicht unterschieden und/oder kartiert, obwohl sie in einem nördlichen Fleck nachgewiesen wurden. Wir sind nicht sicher, ob diese Strategie geeignet ist, die stationären Transkripte in anderen pflanzenmitochondrien oder in Plastiden zu unterscheiden und abzubilden.

Abschätzung der mitochondrialen RNA-Zirkularisierungseffizienz
In einer früheren Studie wurden sowohl totale als auch mitochondriale RNAs für die cRT-PCR-Mapping von mitochondrialen Transkripttermini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) verwendet, und die beiden Arten von RNAs ergaben ähnliche Kartierungsergebnisse12. Anfangs verwendeten wir auch totale RNAs für di...

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Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

Wir präsentieren eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie, indem wir kreisförmige RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung und Northern Blot kombinieren. Dieses Protokoll enthält einen Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren, und es eignet sich zur Unterscheidung und Kartierung der primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt werden.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Dieses Protokoll wird für die Kartierung und Diskriminierung der primären und verarbeiteten Transkripte in Maismitochondrien verwendet. Diese Technik beinhaltet einen RNA-Normalisierungsschritt und minimiert den Einfluss von instabilen fünf Primetriphosphat, die eine klare Diskriminierung zwischen dem primären und den verarbeiteten Transkripten behindert. Neben Maismitochondrien könnte diese Methode auch auf Plastide und andere pflanzliche Mitochondrien angewendet werden.Beginnen Sie mit dem Sammeln von 20 Gramm sich entwickelnden Kernen in einer 50 Milliliter Tube auf Eis. Die Kerne auf einen vorgekühlten Mörtel übertragen und 10 bis 20 Milliliter eiskalten Extraktionspuffer hinzufügen. Schleifen Sie die Kerne vollständig, fügen Sie mehr Extraktionspuffer hinzu und filtern Sie das geschliffene Gewebe durch zwei Schichten Filtertuch.Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 8 000 mal G für 10 Minuten. Dann den Überstand in ein neues Rohr geben und das Filtrat entsorgen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 20.000 mal G für 10 Minuten.Gießen Sie den Überstand ab und hängen Sie das Pellet in sechs Milliliter Waschpuffer wieder auf. Aliquot die Suspension in fünf 1,5 Milliliter RNase-freie Rohre und zentrifugieren sie bei 14. 000 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das mitochondriale Pellet in flüssigem Stickstoff ein.Extrahieren Sie mitochondriale RNA mit kommerziellen Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers und richten Sie eine BEHANDLUNG mit fünf Prime Polyphosphaatase aus. Dann erholen Sie die RNA mit einem RNA-Reinigungskit. Das für die RNA-Extraktion verwendete Reagenz ist gefährlich.Arbeiten Sie immer mit ihm in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie immer Labormantel und Handschuhe. Bereiten Sie zwei Zirkularisierungsreaktionen mit den gleichen Mengen von fünf Prime Polyphosphatase behandelt und nicht behandelt mitochondrialen RNA. Inkubieren Sie beide Reaktionen bei 16 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden und erholen Sie dann die selbstgeligaten NAs mit einem zuvor verwendeten RNA-Reinigungskit.Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Primermischung mit einem gleichen Verhältnis von 26 SCRT und bis zu sieben weiteren Reverse-Transkriptions-Primern. Montieren Sie zwei Reverse-Transkriptionsreaktionssysteme nach den Manuskriptrichtungen und inkubieren Sie sie bei 42 Grad Celsius für 50 Minuten. Um die cDNA zu normalisieren, bereiten Sie zwei PCR-Reaktionen mit dem gleichen Volumen von cNDS aus den fünf prime polyphosphatase behandelten oder nicht behandelten RNA s und führen Sie die Reaktion unter thermocycling Bedingungen im Manuskript beschrieben.Die Normalisierung durch 26S reife rRNA ist ein wichtiger Schritt, um zwischen dem primären und den verarbeiteten Transkripten zu unterscheiden. Vergleichen Sie die Häufigkeit der beiden PCR-Produkte und optimieren Sie ggf. die Normalisierung, indem Sie die Mengen der Template-CDLs anpassen. Bereiten Sie Paare von PCR-Reaktionen mit entsprechenden Volumina normalisierter CDAs und einem Paar divergierender Primer wie in den fünf Primzahl- bis drei Prim-Junction der Zieltranskripte vor und führen Sie PCR entsprechend den Manuskriptrichtungen durch.Verwenden Sie dann ein Gel-DNA-Recovery-Kit, um die prominenten Bänder zu isolieren, die durch verschachtelte PCR verstärkt werden. Klonen Sie die gelgereinigten PCR-Produkte mithilfe von Standardtechniken in einen Vektor und führen Sie Kolonie-PCR durch, um positive Klone auszuwählen, die die Zieleinsätze enthalten. Sequenzieren Sie die PCR-Produkte und richten Sie die Sequenzierungsdaten mit dem mitochondrialen Maisgenom mithilfe des grundlegenden lokalen Ausrichtungssuchwerkzeugs oder BLAST aus.Wählen Sie den Organismus Mais und Suchdatenbank Nukleotid Sammlung. Finden Sie die fünf Prim- bis drei Hauptknoten des kreisförmigen Transkripts und bestimmen Sie die Positionen der fünf Prime- und drei Prime-Transkript-Termini. Verstärken Sie das DNA-Fragment, das zur Vorbereitung der RNA-Sonde verwendet wird, und klonen Sie es auf den zuvor verwendeten Vektor, der einen T7-Promotor enthält, 17 Basenpaare vor der Einfügestelle.Beschriften Sie die RNA-Sonden mit dig-11-UTP und führen Sie die RNA-Hybridisierung mit kommerziellen Kits durch. Diskimperieren Sie die primären und verarbeiteten fünf Hauptenden, indem Sie die kreisförmigen RT-PCR-Produkte vergleichen, die aus den normalisierten fünf primierten Polyphosphatase behandelten und nicht behandelten RNA s gewonnen wurden. Entwerfen Sie dann quantitative RT-PCR-Primer basierend auf den Mapping-Ergebnissen und überprüfen Sie die Diskriminierungsergebnisse mit RT-PCR.Das COX-2-Gen wurde als Beispiel verwendet, um die Kartierung und Diskriminierung von Maismitochondrial-Transkripten mit der kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie zu demonstrieren. Die normalisierten cDNA es wurden als Schablonen für PCR verwendet, was zu zwei prominenten Bändern führte, die aus der fünf hauptpolyphosphatase behandelten Probe verstärkt wurden. Die beiden Bänder wurden COX-2 eins und zwei aus dem Gel geborgen und in Vektoren geklont.Die Ergebnisse der Kolonie-PCR zeigten, dass die positiven Klone Inserts mit variabler Größe enthalten, was impliziert, dass die Termini heterogene fünf Prime- oder drei Prime-Termini aufweisen. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass COX-2 eins und zwei die gleichen drei Primlägeden bei 39 Nukleotiden unterhalb des Stop-Codons haben, während ihre fünf Prime-Termini bei 992 bis 1, 030 bzw. 1, 276 bis 1, 283 Nukleotiden vor dem Startcodon liegen. Die RNA-Gel-Blot-Hybridisierung wurde durchgeführt, um die kreisförmigen RT-PCR-Mapping-Ergebnisse zu überprüfen, und es wurden zwei Hauptbänder mit Größen ähnlich wie COX-2 eins und zwei nachgewiesen.Ein weiteres Paar divergenter Primer wurde entwickelt, um die COX-2 drei und vier Bänder zu verstärken, die mit dem RNA-Gel-Blot, aber nicht mit dem ersten kreisförmigen RT-PCR nachgewiesen wurden. Die quantitativen RT-PCR-Ergebnisse bestätigten, dass COX-2 eins, zwei, drei und vier empfindlich auf fünf Prime-Polyphosphatase reagierten und dass sie primäre fünf Prime-Termini hatten. Primer-Erweiterungsanalyse könnte durchgeführt werden, um die fünf Prim-Mapping-Ergebnisse zu überprüfen, obwohl sie nicht in diesem Protokoll enthalten sind.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Forschung

Genetik

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

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QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

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CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

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Mit Ustilago Maydis als ein Trojanisches Pferd für In Situ Lieferung von Mais Proteine

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...