Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
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इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31600250, वाई.जेड.), गुआंग्झू शहर की विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाओं (अनुदान संख्या 201804020015, एच.एन.) और चीन कृषि अनुसंधान प्रणाली (नहीं) द्वारा समर्थित किया गया था। CARS-04-PS09, एच.एन.).

1. प्राइमर डिजाइन
<ol><li>पीसीआर प्राइमर डिजाइन सॉफ्टवेयर (सामग्रीकीतालिका) का उपयोग कर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमर डिजाइन प्राइमर डिजाइन17के सामान्य नियमों के ?...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

एक पिछले अध्ययन में, Arabidopsis के सेल निलंबन संस्कृति से कुल और mitochondrial आरएनए cRT-पीसीआर द्वारा mitochondrial प्रतिलिपि शब्दावली नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और इसी तरह के परिणामप्राप्त किए गए 12. तथ?...

संयंत्र mitochondria में, कई परिपक्व और अग्रदूत आरएनए कई आइसोफॉर्मकेस के रूप में जमा कर रहे हैं, और स्थिर राज्य प्रतिलिपि उनके 5 ' समाप्त होता है पर अंतर के आधार पर दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है1,2, 4. प्राथमिक प्रतिलिपि 5' triphosphate समाप्त होता है, जो प्रतिलेखन दीक्षा से प्राप्त कर रहे हैं. इसके विपरीत, संसाधित प्रतिलिपि है 5' मोनोफॉस्फेट पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल प्रोसेसिंग द्वारा उत्पन्न. भेदभाव और प्रतिलिपि के दो प्रकार के मानचित्रण के लिए आणविक प्रतिलेखन और प्रतिलिपि अंत परिपक्वता अंतर्निहित तंत्र को जानने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
संयंत्र माइटोकोन्ड्रिऑन में प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपियों के बीच अंतर करने के लिए, चार प्रमुख रणनीतियों को विकसित किया गया है। पहली रणनीति तंबाकू एसिड पायरोफॉस्टास (टीएपी) के साथ माइटोकोंड्रिल आरएनए का पूर्व उपचार करना है, जो 5' ट्राइफॉस्फेट को मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित करता है और प्राथमिक ट्रांसक्रिप्टकोआरए लिगेज द्वारा परिपत्रीकृत करने में सक्षम बनाता है। टेप इलाज और गैर इलाज आरएनए नमूनों की प्रतिलिपि बहुतायत तो cDNA समाप्त होता है (आरईएस) या परिपत्र आरटी-पीसीआर (सीआरटी-पीसीआर)2,3,4के तेजी से प्रवर्धन द्वारा तुलना कर रहे हैं। दूसरी रणनीति में, संसाधित प्रतिलिपि सबसे पहले माइटोकोंड्रिल आरएनए से टर्मिनेटर 5'-फॉस्फेट-निर्भर एक्सोनुलेस (टेक्स) का उपयोग करके समाप्त हो जाती है, और प्राथमिक प्रतिलिपियां छोड़ दी जाती हैं फिर प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण द्वारा मैप की जाती हैं5,6 . तीसरी रणनीति के लिए guanylyl transferase का उपयोग कर प्राथमिक प्रतिलिपि पूर्व टोपी है, और फिर triphosphated 5' टर्मिनी की स्थिति प्राइमर विस्तार द्वारा एक साथ ribonuclease या S1 nuclease संरक्षण विश्लेषण7,8 के साथ निर्धारित किया जाता है ,9. 5' ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अभाव के आधार पर उन लोगों से अलग, चौथी रणनीति इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, साइट-निर्देशित म्यूटेजनन, और प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण को जोड़ती है जो पुटेटिव प्रमोटरों की विशेषता है और प्रतिलेखन निर्धारित करती है दीक्षा स्थल8,10,11. इन रणनीतियों का उपयोग करके, कई प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि संयंत्र mitochondria में निर्धारित किया गया है.
तथापि, कई अध्ययनों से पता चला है कि प्राथमिक प्रतिलिपियों के 5' ट्राइफॉस्फेट अस्थिर थे, और वे आसानी से अज्ञात कारण2,4,12,13के लिए मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित हो गए थे। यह समस्या 5' ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अनुपस्थिति के आधार पर तकनीकों का उपयोग करके दो प्रकार की ट्रांसक्रिप्ट्स के स्पष्ट भेदभाव में बाधा डालती है, और संयंत्र में प्राथमिक और संसाधित ट्रांसक्रिप्ट्स के बीच व्यवस्थित रूप से भेदभाव करने के पिछले प्रयासों में बाधा डालती है। माइटोकोंड्रियाअसफल २,१२.
इस प्रोटोकॉल में, हम सीआरटी-पीसीआर, आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस उपचार, आरटी-क्यूपीसीआर, और उत्तरी दाग को व्यवस्थित रूप से मक्का में जमा प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपियों को व्यवस्थित रूप से अलग करने के लिए गठबंधन करते हैं (जीए मई) मिटोकोन्ड्रिऑन (चित्र 1)। cRT-PCR एक आरएनए अणु के 5' और 3' extremities के एक साथ मानचित्रण की अनुमति देता है, और यह आमतौर पर पौधों में प्रतिलिपि टर्मिनी नक्शा करने के लिए अनुकूलित किया जाता है2,12,14,15. आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटेस ट्राइफॉस्फेट5 टर्मिनी से दो फॉस्फेट निकाल सकता है, जो प्राथमिक प्रतिलिपि आरएनए लिगेस द्वारा आत्म-लिगेशन के लिए उपलब्ध बनाता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मक्का में परिपक्व 26S rRNA 5' टर्मिनस संसाधित किया था, और यह आरएनए 5 ' polyphosphatase1,16के प्रति असंवेदनशील था. प्राथमिक 5' टर्मिनी पर अस्थिर ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए, 5' पॉलीफॉस्फेटकास-उपचार और गैर-उपचारित आरएनए परिपक्व 26S RRNA द्वारा सामान्यीकृत हैं, और प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि फिर तुलना करके विभेदित हैं सीआरटी-पीसीआर उत्पादों दो आरएनए नमूनों से प्राप्त की। cRT-PCR मानचित्रण और भेदभाव के परिणाम क्रमशः उत्तरी दाग और आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा सत्यापित किए जाते हैं। अंत में, वैकल्पिक प्राइमर उत्तरी दाग में पता चला उन प्रतिलिपियों बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन cRT-पीसीआर द्वारा नहीं. इस cRT-PCR-आधारित रणनीति का उपयोग करके, मक्का mitochondrion में सबसे स्थिर राज्य प्रतिलिपि अलग और मैप किया गया है1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

संयंत्र mitochondria में, कुछ स्थिर राज्य प्रतिलिपि 5' triphosphate प्रतिलेखन दीक्षा (प्राथमिक प्रतिलिपि) से व्युत्पन्न है, जबकि अन्य होते हैं 5' मोनोफॉस्फेट उत्पन्न पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनलली (प्रसंस्कृत प्रतिलिपि). दो प्रकार की प्रतिलिपियों के बीच भेदभाव करने के लिए, कई रणनीतियों को विकसित किया गया है, और उनमें से अधिकांश 5' ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अभाव पर निर्भर करते हैं। हालांकि, प्राथमिक 5' टर्मिनी पर ट्राइफॉस्फेट अस्थिर है, और यह दो प्रकार के ट्रांसक्रिप्ट्स के स्पष्ट भेदभाव में बाधा डालता है। मक्का माइटोकोन्ड्रियोन में जमा प्राथमिक और प्रसंस्कृत प्रतिलिपियों में व्यवस्थित रूप से अंतर और मैप करने के लिए, हमने सीआरटी-पीसीआर, आरएनए 5' पॉलीफोशपैटस उपचार, मात्रात्मक के संयोजन से एक परिपत्र आरटी-पीसीआर (सीआरटी-पीसीआर) आधारित रणनीति विकसित की है। आरटी-पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर), और उत्तरी दाग। एक सुधार के रूप में, इस रणनीति अस्थिर 5' ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए एक आरएनए सामान्यीकरण कदम भी शामिल है।
इस प्रोटोकॉल में, समृद्ध माइटोकोंड्रियाल आरएनए का आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेट द्वारा पूर्व-उपचार किया जाता है, जो 5' त्रिफॉफेट को मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित करता है। परिपत्रीकरण और रिवर्स प्रतिलेखन के बाद, 5' पॉलीफॉस्फेटसे से व्युत्पन्न दो सीडीएनए इलाज और गैर-उपचारित आरएनए को मक्का 26एस परिपक्व आरएनए द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है, जिसमें एक संसाधित 5' अंत होता है और 5' पॉलीफॉस्फेटस के प्रति असंवेदनशील होता है। सामान्यीकरण के बाद, प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि इलाज और गैर इलाज RNAs से प्राप्त cRT-PCR और आरटी-QPCR उत्पादों की तुलना द्वारा भेदभाव कर रहे हैं। ट्रांसक्रिप्ट टर्मिनी को cRT-PCR उत्पादों की क्लोनिंग और अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया जाता है, और फिर उत्तरी दाग द्वारा सत्यापित किया जाता है।
इस रणनीति का उपयोग करके, मक्का mitochondrion में सबसे स्थिर राज्य प्रतिलिपि निर्धारित किया गया है. कुछ mitochondrial जीन की जटिल प्रतिलिपि पैटर्न के कारण, कुछ स्थिर राज्य प्रतिलिपि भेदभाव नहीं थे और / हमें यकीन है कि नहीं कर रहे हैं कि इस रणनीति के लिए भेदभाव और अन्य संयंत्र mitochondria में या प्लास्टिड में स्थिर राज्य प्रतिलिपि नक्शा उपयुक्त है.

माइटोकोंड्रियाल आरएनए परिपत्रीकरण दक्षता का अनुमान
पिछले एक अध्ययन में, दोनों कुल और mitochondrial RNAs Arabidopsis में mitochondrial प्रतिलिपि टर्मिनी के cRT-पीसीआर मानचित्रण के लिए...

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Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

एक परिपत्र आरटी-पीसीआर आधारित रणनीति का उपयोग कर मक्का Mitochondrion में प्राथमिक और प्रसंस्कृत ट्रांसस्क्रिप्ट के भेदभाव और मानचित्रण

हम परिपत्र आरटी-पीसीआर, मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचार, और उत्तरी दाग के संयोजन के द्वारा एक परिपत्र आरटी-पीसीआर आधारित रणनीति प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल अस्थिर 5' ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए एक सामान्यीकरण कदम भी शामिल है, और यह भेदभाव और प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि stably मक्का mitochondrion में जमा मानचित्रण के लिए उपयुक्त है.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग मक्का माइटोकॉन्ड्रिया में प्राथमिक और प्रसंस्कृत टेप के मानचित्रण और भेदभाव के लिए किया जाता है। इस तकनीक में एक आरएनए सामान्यीकरण कदम शामिल है और यह अस्थिर पांच प्राइम ट्राइफोस्फेट के प्रभाव को कम करता है जो प्राथमिक और प्रसंस्कृत टेप के बीच स्पष्ट भेदभाव में बाधा डालता है। मक्का माइटोकॉन्ड्रिया के अलावा, इस विधि को प्लास्टिड और अन्य पौधे माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू किया जा सकता है।बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 20 ग्राम विकासशील गुठली इकट्ठा करके शुरू करें। गुठली को प्री-कूल्ड मोर्टार में स्थानांतरित करें और 10 से 20 मिलीलीटर बर्फ ठंड निष्कर्षण बफर जोड़ें। गुठली को पूरी तरह से पीस लें, अधिक निष्कर्षण बफर जोड़ें और फिल्टर कपड़े की दो परतों के माध्यम से जमीन के ऊतकों को फ़िल्टर करें।10 मिनट के लिए 8, 000 बार जी पर फिल्ट्रेट अपकेंद्रित्र करें। फिर सुपरनेंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और फिलट्रेट को त्याग दें। 10 मिनट के लिए 20, 000 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।सुपरनेट को बंद करें और वॉश बफर के छह मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। पांच १.५ मिलीलीटर RNase मुक्त ट्यूबों में निलंबन Aliquot और पांच मिनट के लिए 14, 000 बार जी पर उन्हें अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को त्यागें और तरल नाइट्रोजन में माइटोकॉन्ड्रियल गोली को फ्रीज करें।निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक अभिकर्मकों का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल आरएनए निकालें और आरएनए पांच प्राइम पॉलीफॉस्फेटाज़ उपचार स्थापित करें। फिर, आरएनए शुद्धिकरण किट के साथ आरएनए को ठीक करें। आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला रिएजेंट खतरनाक है।हमेशा इसके साथ धूम हुड में काम करें और हमेशा लैब कोट और दस्ताने पहनें। पांच प्राइम पॉलीफोफैटाज़ उपचारित और गैर-इलाज माइटोकॉन्ड्रियल आरएनए की समान मात्रा का उपयोग करके दो परिपत्रकरण प्रतिक्रियाएं तैयार करें। 12 से 16 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर दोनों प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें और फिर पहले इस्तेमाल किए गए आरएनए शुद्धिकरण किट के साथ स्वयं-लिगाटेड आरएनए को ठीक करें।26 एससीआरटी के बराबर अनुपात और सात अन्य रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के साथ एक प्राइमर मिश्रण तैयार करके शुरू करें। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार दो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन सिस्टम को इकट्ठा करें और उन्हें 50 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सीडीएनए को सामान्य बनाने के लिए, पांच प्राइम पॉलीफोफैटाज़ उपचारित या गैर-इलाज आरएनए से सीडीएनए की एक ही मात्रा के साथ दो पीसीआर प्रतिक्रियाएं तैयार करें और पांडुलिपि में वर्णित थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों के तहत प्रतिक्रिया को चलाएं।26S परिपक्व आरएनए द्वारा सामान्यीकरण प्राथमिक और प्रसंस्कृत टेप के बीच भेदभाव करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। दो पीसीआर उत्पादों की बहुतायत की तुलना करें और यदि आवश्यक हो, तो टेम्पलेट सीडीएनए की मात्रा को समायोजित करके सामान्यीकरण को अनुकूलित करें। सामान्यीकृत सीडीएनए की उचित मात्रा के साथ पीसीआर प्रतिक्रियाओं के जोड़े तैयार करें और लक्ष्य टेप के पांच प्राइम से तीन प्राइम जंक्शन जैसे अलग-अलग प्राइमर की एक जोड़ी तैयार करें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पीसीआर प्रदर्शन करें।फिर, नेस्टेड पीसीआर द्वारा परिलक्षित होने वाले प्रमुख बैंडों को अलग करने के लिए जेल डीएनए रिकवरी किट का उपयोग करें। मानक तकनीकों का उपयोग करके जेल शुद्ध पीसीआर उत्पादों को वेक्टर में क्लोन करें और लक्ष्य आवेषण वाले सकारात्मक क्लोन का चयन करने के लिए कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करें। पीसीआर उत्पादों को अनुक्रम करें और बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण या ब्लास्ट का उपयोग करके मक्का माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम के साथ अनुक्रमण डेटा को संरेखित करें।जीव मक्का और खोज डेटाबेस न्यूक्लियोटाइड संग्रह चुनें। परिपत्रीकृत प्रतिलिपि के तीन प्रमुख जंक्शन के लिए पांच प्रधानमंत्री का पता लगाएं और पांच प्रधानमंत्री और तीन प्रधानमंत्री प्रतिलिपि टर्मिनी की स्थिति का निर्धारण । आरएनए जांच तैयार करने और पहले इस्तेमाल किए गए वेक्टर को क्लोन करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले डीएनए टुकड़े को बढ़ाना जिसमें एक T7 प्रमोटर, प्रविष्टि साइट के 17 आधार जोड़े अपस्ट्रीम शामिल हैं।डीआईजी-11-यूटीपी के साथ आरएनए जांच लेबल और वाणिज्यिक किट का उपयोग कर आरएनए संकरण प्रदर्शन करते हैं । सामान्यीकृत पांच प्राइम पॉलीफोफैटासे इलाज और गैर-इलाज आरएनए से प्राप्त परिपत्र आरटी-पीसीआर उत्पादों की तुलना करके प्राथमिक और संसाधित पांच प्राइम सिरों को भेदभाव करें। फिर, मैपिंग परिणामों के आधार पर मात्रात्मक आरटी-पीसीआर प्राइमर डिजाइन करें और आरटी-पीसीआर के साथ भेदभाव के परिणामों को सत्यापित करें।कॉक्स-2 जीन का उपयोग परिपत्र आरटी-पीसीआर आधारित रणनीति के साथ मक्का माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्ट के मानचित्रण और भेदभाव को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया गया था । सामान्यीकृत सीडीएनए का उपयोग पीसीआर के लिए टेम्पलेट्स के रूप में किया जाता था, जिसके परिणामस्वरूप पांच प्रमुख पॉलीफोफैटासे उपचारित नमूने से दो प्रमुख बैंड परिलक्षित होते थे। दो बैंड का नाम कॉक्स-2 वन और दो जेल से बरामद किया गया और वैक्टर में क्लोन किया गया ।कॉलोनी पीसीआर परिणामों से पता चला है कि सकारात्मक क्लोन में चर आकार के साथ आवेषण होते हैं जिसका अर्थ है कि टर्मिनी में विषम पांच प्राइम या तीन प्राइम टर्मिनी हैं। अनुक्रमण परिणामों से पता चला है कि कॉक्स-2 एक और दो में स्टॉप कोडन के ३९ न्यूक्लियोटाइड डाउनस्ट्रीम में एक ही तीन प्राइम एंड्स हैं जबकि उनकी पांच प्राइम टर्मिनी क्रमशः ९९२ से 1, ०३० और 1, २७६ से 1, २८३ न्यूक्लियोटिड्स स्टार्ट कॉडन के अपस्ट्रीम में स्थित हैं । आरएनए जेल दाग संकरण परिपत्र आरटी-पीसीआर मानचित्रण परिणामों को सत्यापित करने के लिए किया गया था और कॉक्स-2 १ और दो के समान आकार के साथ दो प्रमुख बैंड का पता चला ।अलग प्राइमर की एक और जोड़ी को कॉक्स-2 तीन और चार बैंड आरएनए जेल दाग के साथ पता चला बढ़ाना डिजाइन किया गया था, लेकिन पहली बार परिपत्र आरटी पीसीआर के साथ नहीं । मात्रात्मक आरटी-पीसीआर के परिणामों ने इस बात की पुष्टि की कि कॉक्स-2 एक, दो, तीन और चार पांच प्राइम पॉलीफोफैटाज के प्रति संवेदनशील थे और उनके पास प्राइमरी पांच प्राइम टर्मिनी थी । प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण पांच प्राइम मैपिंग परिणामों को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि यह इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL मैपिंग और सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 में एक ड्रग प्रतिरोध जीन को पहचानने के लिए संपादन<em&gt; टोक्सोप्लाज्मा गोंडी</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

वैश्विक बायोटिनिलेटेड Psoralen का उपयोग आरएनए-आरएनए अंतरण मैपिंग

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

मानचित्रण जीनोम-वाइड सुलभ क्रोमेटिन प्राथमिक मानव टी लिम्फोसाइटों में ATAC-Seq द्वारा

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-मध्यस्थता एक समरूपता-मध्यस्थ अंत में शामिल होने की रणनीति का उपयोग कर Vivo में लक्षित एकीकरण

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

3 ' अनुकूलन सीडीएनए के तेजी से प्रवर्धन के लिए कैंसर में टेप नक्शा समाप्त होता है

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

मकई प्रोटीन की सीटू प्रसव में के लिए एक ट्रोजन हॉर्स के रूप में Ustilago मेडिस का उपयोग

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

इन विट्रो और में-सेल आकार छोटे अणु प्रेरित पूर्व mRNA संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए का उपयोग करना

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

विशेषता हिस्one पोस्ट-translational में संशोधन परिवर्तन खमीर न्यूरोडेजेनेरेटिव प्रोटिनोपैथी मॉडल

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...