Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31600250, Y. , Science and Technology Projects of Guangzhou City (grant n. 201804020015, H.N.) e dal China Agricultural Research System (grant no. CARS-04-PS09, H.N.).

1. Progettazione di Primer
<ol><li>Progettare primer gene-specific per la trascrizione inversa (RT) utilizzando il software di progettazione del primer PCR (Table of Materials) in base alle regole generali di primer design17. NOT:</</c2> I primer RT sono altamente specifici per le trascrizioni di destinazione, e sono generalmente ancorati sulla parte 5' delle sequenze di codifica (mRNA maturi e RNA precursori), o 500-600 nt a valle della fine prevista 5' (18S e 26S r...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

In uno studio precedente, gli RNA totali e mitocondriali della coltura delle sospensioni cellulari dell'Arabidopsis sono stati utilizzati per mappare i termini trascrizione mitocondriale da cRT-PCR, e risultati simili sono stati ottenuti12. Tuttavia, solo l'RNA mitocondriale arricchito è stato utilizzato per mappare la trascrizione mitocondriale termini in molti altri studi1,2,3,<sup ...

Nei mitocondri vegetali, molti RNA maturi e precursori vengono accumulati come isoformi multipli, e le trascrizioni allo stato costante possono essere divise in due gruppi in base alla differenza alle loro 5 ' estremità1,2,3 4. Le trascrizioni primarie hanno 5' estremità triposphate, che derivano dall'avvio della trascrizione. Al contrario, le trascrizioni elaborate hanno 5' monofafato generato dall'elaborazione post-trascrizione. La discriminazione e la mappatura dei due tipi di trascrizioni sono importanti per svelare i meccanismi molecolari alla base della trascrizione e della maturazione finale della trascrizione.
Per distinguere tra le trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio vegetale, sono state sviluppate quattro strategie principali. La prima strategia consiste nel pretrattare gli RNA mitocondriali con il pirofosofasi acido del tabacco (TAP), che converte il tripfosfato 5' in monofagofato e consente alle trascrizioni primarie di essere circolati dalla ligase dell'RNA. L'abbondanza di trascrizioni di campioni di RNA trattati con TAP e non trattati viene quindi confrontata con una rapida amplificazione delle estremità cDNA (RACE) o RT-PCR circolari (cRT-PCR)2,3,4. Nella seconda strategia, le trascrizioni elaborate vengono prima esaurite dagli RNA mitocondriali utilizzando l'eonuclease dipendente dal terminator5-fosfatio (TEX), e le trascrizioni primarie rimaste vengono quindi mappate dall'analisi dell'estensione del primer5,6 . La terza strategia è quella di pre-cap le trascrizioni primarie utilizzando guanylyl transferase, e quindi la posizione di triposphated 5' è determinata dall'estensione primer insieme con ribonuclease o S1 nuclease protection analysis7,8 ,9. A differenza di quelli che dipendono dalla presenza/assenza di 7' triposfato, la quarta strategia combina la trascrizione in vitro, la mutagenesi diretta dal sito e l'analisi dell'estensione del primer per caratterizzare i promotori putativi e determinare la trascrizione siti di avvio8,10,11. Utilizzando queste strategie, molte trascrizioni primarie ed elaborate sono state determinate nei mitocondri delle piante.
Tuttavia, diversi studi hanno riferito che il trifosfato 5' delle trascrizioni primarie erano instabili, e sono stati facilmente convertiti in monofosfato per motivo sconosciuto2,4,12,13. Questo problema ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni utilizzando tecniche a seconda della presenza/assenza di trifosfato 5' e precedenti sforzi per distinguere sistematicamente tra le trascrizioni primarie ed elaborate nell'impianto mitocondri fallito2,12.
In questo protocollo, combiniamo cRT-PCR, trattamento polifosforo RNA 5', RT-qPCR e macchia settentrionale per distinguere sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mais (zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR consente la mappatura simultanea delle estremità 5' e 3' di una molecola di RNA, ed è di solito adattata alla trascrizione dei termini nelle piante2,12,14,15. Il polifosforasi di RNA 5' potrebbe rimuovere due fosfati dal termine di 1'trhafated 5', il che rende disponibili le trascrizioni primarie per l'auto-legatura da parte della ligase dell'RNA. Studi precedenti hanno dimostrato che il rRNA 26S maturo nel mais aveva elaborato il capolinea 5', ed era insensibile al polifosculo DI RNA 5 '1,16. Per ridurre al minimo l'influenza del triposfato instabile ai termini primari 5', i 5' RNA trattati con polifofofofosi e non trattati vengono normalizzati da rRNA 26S maturi, e le trascrizioni primarie ed elaborate vengono quindi differenziate confrontando cRT-PCR ottenuti dai due campioni di RNA. I risultati della mappatura cRT-PCR e della discriminazione sono verificati rispettivamente da Northern blot e RT-qPCR. Infine, i primer alternativi vengono utilizzati per amplificare le trascrizioni rilevate nella macchia settentrionale, ma non da cRT-PCR. Utilizzando questa strategia basata su cRT-PCR, la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais sono state differenziate e mappate1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

Nei mitocondri delle piante, alcune trascrizioni in stato costante hanno 5' triposfato derivato dall'initiazione della trascrizione (trascrizioni primaria), mentre le altre contengono 5' monofofafato generato post-transcriptionally (trascrizioni elaborate). Per discriminare tra i due tipi di trascrizioni, sono state sviluppate diverse strategie e la maggior parte di esse dipende dalla presenza/assenza di 7' triposfato. Tuttavia, il triplofato al termine primario 5' è instabile, e ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni. Per differenziare e mappare sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais, abbiamo sviluppato una strategia circolare basata su RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, trattamento quantitativo dei polifoshpatasi di RNA 5', RT-PCR (RT-qPCR) e Northern blot. Come miglioramento, questa strategia include un passo di normalizzazione dell'RNA per ridurre al minimo l'influenza del tripfosfato unstable 5'.
In questo protocollo, l'RNA mitocondriale arricchito è pre-trattato da RNA 5' polifosforasi, che converte il triphsofato da 5' in monofagofato. Dopo la circolarizzazione e la trascrizione inversa, i due cDNA derivati da 5' RNA trattati con polifofofosi e non trattati sono normalizzati dal mais 26S rRNA maturo, che ha una fine elaborata 5' ed è insensibile a 5' polifosfolasi. Dopo la normalizzazione, le trascrizioni primarie e trasformate vengono discriminate confrontando i prodotti cRT-PCR e RT-qPCR ottenuti dagli RNA trattati e non trattati. La prova di trascrizione è determinata dalla clonazione e dal sequenziamento dei prodotti cRT-PCR e quindi verificata da Northern blot.
Utilizzando questa strategia, sono state determinate la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais. A causa del complicato schema di trascrizione di alcuni geni mitocondriali, alcune trascrizioni a stato costante non sono state differenziate e/o mappate, anche se sono state rilevate in una macchia settentrionale. Non siamo sicuri se questa strategia sia adatta a discriminare e mappare le trascrizioni dello stato costante in altri mitocondri vegetali o in plastidi.

Stima dell'efficienza di circolarizzazione dell'RNA mitocondriale
In uno studio precedente, sia gli RNA totali che quelli mitocondriali sono stati utilizzati per la mappatura cRT-PCR della trascrizione mitocondriale termini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) e i due tipi di RNA hanno dato risultati di mappatura simili12. Inizialmente, abbiamo anche usato RNA totali pe...

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Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

Vi presentiamo una strategia circolare basata su RT-PCR combinando RT-PCR circolare, RT-PCR quantitativo, trattamento polifosculo DI RNA 5 e macchia settentrionale. Questo protocollo include una fase di normalizzazione per ridurre al minimo l'influenza del tripofatore instabile 5', ed è adatto per discriminare e mappare le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Questo protocollo viene utilizzato per la mappatura e la discriminazione delle trascrizioni primarie ed elaborate nei mitocondri di mais. Questa tecnica include una fase di normalizzazione dell'RNA e riduce al minimo l'influenza di cinque trifosfati primi instabili che ostacola una chiara discriminazione tra le trascrizioni primarie e elaborate. Oltre ai mitocondri di mais, questo metodo potrebbe essere applicato ai plastidi e ad altri mitocondri vegetali.Inizia raccogliendo 20 grammi di noccioli in via di sviluppo in un tubo da 50 millilitri sul ghiaccio. Trasferire i chicchi in una malta pre-raffreddata e aggiungere da 10 a 20 millilitri di tampone di estrazione del freddo ghiacciato. Macinare completamente i chicchi, aggiungere più tampone di estrazione e filtrare il tessuto macinato attraverso due strati di panno filtrante.Centrifugare il filtrato a 8.000 volte G per 10 minuti. Quindi trasferire il supernatante su un nuovo tubo e scartare il filtrato. Centrifugare il tubo a 20.000 volte G per 10 minuti.Versare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in sei millilitri di tampone di lavaggio. Aliquota la sospensione in cinque tubi senza RNasi da 1,5 millilitri e centrifugali a 14.000 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e congelare il pellet mitocondriale in azoto liquido.Estrarre l'RNA mitocondriale utilizzando reagenti commerciali secondo le istruzioni del produttore e impostare un trattamento RNA cinque polifosfatatasi primaria. Quindi, recuperare l'RNA con un kit di purificazione dell'RNA. Il reagente utilizzato per l'estrazione dell'RNA è pericoloso.Lavora sempre con esso in un cappuccio per fumi e indossa sempre camice da laboratorio e guanti. Preparare due reazioni di circolarizzazione usando le stesse quantità di cinque RNA mitocondriali trattati con polifosfatasi primaria e non trattati. Incubare entrambe le reazioni a 16 gradi celsius per 12-16 ore e quindi recuperare l'RNA auto-legato con un kit di purificazione dell'RNA precedentemente utilizzato.Inizia preparando una miscela di primer con un rapporto uguale di 26 SCRT e fino ad altri sette primer di trascrizione inversa. Assemblare due sistemi di reazione di trascrizione inversa in base alle direzioni del manoscritto e incubarli a 42 gradi celsius per 50 minuti. Per normalizzare il cDNA, preparare due reazioni PCR con lo stesso volume di cDNA dei cinque RNA di polifosfatasi primaria trattati o non trattati ed eseguire la reazione in condizioni termocicliche descritte nel manoscritto.La normalizzazione da parte dell'rRNA maturo 26S è un passaggio chiave per discriminare tra le trascrizioni primarie ed elaborate. Confrontare l'abbondanza dei due prodotti PCR e, se necessario, ottimizzare la normalizzazione regolando le quantità di cDNA modello. Preparare coppie di reazioni PCR con volumi appropriati di cDNA normalizzati e una coppia di primer divergenti come nella giunzione da cinque primi a tre primi delle trascrizioni bersaglio ed eseguire pcr secondo le direzioni del manoscritto.Quindi, utilizzare un kit di recupero del DNA in gel per isolare le bande prominenti amplificate dalla PCR nidificata. Clonare i prodotti PCR purificati in gel in un vettore utilizzando tecniche standard ed eseguire la PCR colonia per selezionare cloni positivi contenenti gli inserti di destinazione. Sequenziare i prodotti PCR e allineare i dati di sequenziamento con il genoma mitocondriale del mais utilizzando lo strumento di ricerca di allineamento locale di base o BLAST.Scegli il mais dell'organismo e cerca la raccolta nucleotidica del database. Trova la giunzione da cinque primi a tre primi della trascrizione circularizzata e determina le posizioni dei cinque termini di trascrizione primi e tre primi. Amplificare il frammento di DNA utilizzato per preparare la sonda RNA e clonarla nel vettore precedentemente utilizzato che contiene un promotore T7, 17 coppie di basi a monte del sito di inserimento.Etichettare le sonde RNA con dig-11-UTP ed eseguire l'ibridazione dell'RNA utilizzando kit commerciali. Discriminare le cinque estremità principali primarie e lavorate confrontando i prodotti circolari RT-PCR ottenuti dai cinque RNA di polifosfatasi primaria trattati e non trattati normalizzati. Quindi, progettare primer RT-PCR quantitativi basati sui risultati della mappatura e verificare i risultati della discriminazione con RT-PCR.Il gene COX-2 è stato usato come esempio per dimostrare la mappatura e la discriminazione delle trascrizioni mitocondriali di mais con la strategia circolare basata su RT-PCR. I cDNA normalizzati sono stati usati come modelli per PCR, il che ha portato a due bande prominenti amplificate dal campione trattato con polifosfatasi primaria. Le due bande sono state chiamate COX-2 una e due recuperate dal gel e clonate in vettori.I risultati della PCR della colonia hanno mostrato che i cloni positivi contengono inserti con dimensioni variabili che implicano che i termini hanno eterogenei cinque primi o tre termini primi. I risultati del sequenziamento hanno mostrato che COX-2 uno e due hanno le stesse tre estremità prime a 39 nucleotidi a valle del codone di arresto mentre i loro cinque primi termini si trovano rispettivamente a 992 a 1,030 e 1, da 276 a 1.283 nucleotidi a monte del codone iniziale. L'ibridazione del gel RNA blot è stata eseguita per verificare i risultati della mappatura RT-PCR circolare e sono state rilevate due bande principali con dimensioni simili a COX-2 una e due.Un'altra coppia di primer divergenti sono stati progettati per amplificare le tre e quattro bande COX-2 rilevate con la macchia di gel RNA ma non con la prima volta rt-PCR circolare. I risultati quantitativi rt-PCR confermarono che COX-2 uno, due, tre e quattro erano sensibili a cinque polifosfatasi primaria e che avevano cinque termini primi primari. L'analisi dell'estensione primer potrebbe essere eseguita per verificare i cinque risultati del mapping primario anche se non è inclusa in questo protocollo.

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