Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第31600250号、Y.Z.)、広州市科学技術プロジェクト(助成金第201804020015号、H.N.)、中国農業研究システム(助成金なし)によって支援されました。CARS-04-PS09,H.N.)。

1. プライマーデザイン
<ol><li>プライマー設計17の一般的な規則に基づいてPCRプライマー設計ソフトウェア(材料の表)を用いた逆転転写(RT)のための遺伝子特異的プライマーを設計する。 注:RTプライマーはターゲットトランスクリプトに非常に特異的であり、一般的にコーディングシーケンスの5'部分(成熟したmRNAおよび前駆体RNA)、または予想され?...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

以前の研究では、アラビドプシスの細胞懸濁培養物からの合計およびミトコンドリアRNAをcRT-PCRによるミトコンドリア転写テルミニーニのマッピングに使用し、同様の結果が12を得た。しかし、他の多くの研究1、2、3、9においてミトコンドリア転写テルミニをマッピングするために濃縮<sup c...

植物ミトコンドリアでは、多くの成熟した前駆体RNAが複数のアイソフォームとして蓄積され、定常状態の転写物は5'終端1、2、3の差に基づいて2つのグループに分けることができる。 4.一次転写物は、転写開始に由来する5'三リン酸端を有する。対照的に、処理された転写物は、転写後処理によって生成される5'モノリン酸を持っています。2種類の転写物の判別とマッピングは、転写および転写終了の成熟の基礎となる分子メカニズムを解明するために重要である。
植物ミトコンドリオンの一次転写物と加工トランスクリプトを区別するために、4つの主要な戦略が開発されました。最初の戦略は、5'三リン酸を一リン酸に変換し、一次転写物をRNAリゲスによって円形にすることを可能にするタバコ酸ピロホスファターゼ(TAP)でミトコンドリアRNAを前処理することです。TAP処理および非処理RNAサンプルの転写物の豊富さは、次いで、cDNA端部(RACE)または円形RT-PCR(cRT-PCR)2、3、4の迅速な増幅によって比較される。第2の戦略では、処理された転写物は、まずターミネータ5'-リン酸塩依存性エキノールクレアーゼ(TEX)を使用してミトコンドリアRNAから枯渇し、残された一次転写物はプライマー延長分析5、6によってマッピングされる。.第3の戦略は、グアニルトランスフェラーゼを使用して一次転写物をプレキャップし、その後、トリリン化された5'ターミニの位置は、リボヌクレアーゼまたはS1ヌクレアーゼ保護分析7、8と一緒にプライマー延長によって決定されます 、9.5'三リン酸の有無に応じて異なり、第4の戦略は、インビトロ転写、部位指向変異形成、およびプライマー拡張分析を組み合わせて、形成促進剤を特徴付け、転写を決定する開始サイト8,10,11.これらの戦略を使用することにより、多くの一次および処理された転写物は、植物ミトコンドリアで決定されている。
しかし、いくつかの研究は、一次転写物の5'三リン酸が不安定であり、それらは2、4、12、13の未知の理由で簡単に一リン酸塩に変換されたと報告している。この問題は、5'三リン酸の有無に応じて技術を使用して、2種類の転写物の明確な差別を妨げ、および植物の一次転写と処理された転写物を系統的に区別する以前の努力を妨げるミトコンドリアは失敗した 2,12.
このプロトコルでは、cRT-PCR、RNA 5'ポリホスファターゼ処理、RT-qPCR、およびノーザンブロットを組み合わせて、トウモロコシに安定に蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別する(Zeamays)ミトコンドリオン(図1)。cRT-PCRは、RNA分子の5'および3'四肢の同時マッピングを可能にし、通常、植物2、12、14、15における転写ターミニをマッピングするように適応される。RNA 5' ポリホスファターゼは、三リン酸化された5'テルミニから2つのリン酸塩を除去することができ、これはRNAリガーゼによる自己ライゲーションのために一次転写物を利用できるようにする。以前の研究では、トウモロコシの成熟した26S rRNAが5'終産を処理し、RNA 5'ポリホスファターゼ1、16に対して無感覚であったことが示された。原発5'ターミニニにおける不安定な三リン酸の影響を最小限に抑えるために、5'ポリホスホナーゼ処理および非処理RNAは成熟した26S rRNAによって正規化され、その後、一次および処理された転写物は、2つのRNAサンプルから得られたcRT-PCR産物。cRT-PCR マッピングと判引結果は、それぞれノーザン ブロットと RT-qPCR によって検証されます。最後に、代替プライマーは、cRT-PCRではなく、北部ブロットで検出されたそれらの転写物を増幅するために使用されます。このcRT-PCRベースの戦略を使用することにより、トウモロコシミトコンドリオンのほとんどの定常状態の転写物が区別され、マッピングされた1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

植物ミトコンドリアでは、一部の定常転写物は転写開始(一次転写)に由来する5'三リン酸を有し、他のものは転写後に生成された5'モノリン酸(処理された転写物)を含む。2種類の転写物を区別するために、いくつかの戦略が開発され、それらのほとんどは5'三リン酸の存在/不在に依存しています。しかし、原発5'ターミニーニにおける三リン酸は不安定であり、2種類の転写物の明確な判別を妨げる。トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別してマッピングするために、cRT-PCR、RNA 5'ポリフォシュパターゼ処理、定量的な組み合わせにより、循環RT-PCR(cRT-PCR)ベースの戦略を開発しました。RT-PCR (RT-qPCR)、およびノーザン ブロット。改善として、この戦略は、不安定な5'三リン酸の影響を最小限に抑えるためのRNA正規化ステップを含む。
このプロトコルでは、濃縮されたミトコンドリアRNAは、RNA 5'ポリホスファターゼによって前処理され、5'トリフショファトを一リン酸に変換する。円形化および逆転転写後、5'ポリホスファターゼおよび非処理RNAに由来する2つのcDNは、処理された5'末端を有し、5'ポリホスファターゼに無感覚であるトウモロコシ26S成熟rRNAによって正規化される。正規化後、一次転写物と処理された転写物は、治療されたRNAおよび非処理されたRNAから得られたcRT-PCRおよびRT-qPCR産物を比較することによって判別される。トランスクリプトターミニは、cRT-PCR産物のクローニングとシーケンシングによって決定され、次いでノーザンブロットによって検証されます。
この戦略を用いることで、トウモロコシミトコンドリオンにおける最も定常状態の転写物が決定された。いくつかのミトコンドリア遺伝子の複雑な転写パターンのために、いくつかの定常転写は、北部のブロットで検出されたが、分化および/またはマッピングされなかった。この戦略が他の植物ミトコンドリアまたはプラスティドで定常状態の転写物を差別し、マッピングするのに適しているかどうかは分かりません。

ミトコンドリアRNA循環効率の推定
以前の研究では、合計およびミトコンドリアRNAの両方がアラビドプシスにおけるミトコンドリア転写ターミナのcRT-PCRマッピングに使用され(アラビドプシス・タリアナ)、および2種類のRNAは同様のマッピング結果12を与えた。当初は、トウモロコ...

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Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

円形RT-PCRベースの戦略を用いたトウモロコシミトコンドリオンにおける一次写物と処理された転写物の判別とマッピング

円形RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'ポリホスファターゼ処理、ノーザンブロットを組み合わせることで、循環RT-PCRベースの戦略を提示する。このプロトコルには、不安定な5'三リン酸の影響を最小限に抑えるための正規化ステップが含まれており、トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次および処理された転写物を識別およびマッピングするのに適しています。

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

このプロトコルは、トウモロコシミトコンドリアにおける一次および処理された転写物のマッピングおよび識別に使用されます。この技術はRNAの正規化ステップを含み、一次と処理された転写物間の明確な識別を妨げる不安定な5つの素数三リン酸の影響を最小にする。トウモロコシミトコンドリアのほかに,この方法はプラスチドおよび他の植物ミトコンドリアに適用することができる。氷の上の50ミリリットルの管に開発カーネルの20グラムを収集することによって開始します。カーネルを冷却したモルタルに移し、10~20ミリリットルの氷冷抽出バッファーを追加します。カーネルを完全に粉砕し、抽出バッファーを追加し、フィルタークロスの2つの層を通して地面組織をフィルタリングします。濾液を8,000倍Gで10分間遠心する。その後、上清を新しいチューブに移し、濾液を捨てます。チューブを20,000倍Gで10分間遠心する。上清を注ぎ、6ミリリットルの洗浄バッファーにペレットを再び懸濁します。懸濁液を5つの1.5ミリリットルRNaseフリーチューブにアリコートし、14,000倍Gで5分間遠心分離する。上清を捨て、ミトコンドリアペレットを液体窒素で凍結します。メーカーの指示に従って市販の試薬を使用してミトコンドリアRNAを抽出し、RNA 5プライムポリホスファターゼ処理を設定します。次いで、RNA精製キットでRNAを回収します。RNA抽出に使用する試薬は危険です。常にヒュームフードで動作し、常にラボコートと手袋を着用してください。5つのプライムポリホスファターゼ処理と非処理ミトコンドリアRNAの同量を使用して2回の回覧反応を調製する。2つの反応を摂氏16度で12~16時間インキュベートし、以前に使用したRNA精製キットで自己合統性RNAを回収します。26 SCRTの等しい比率と最大7つの他の逆転写プライマーを持つプライマー混合物を調製することによって開始します。原稿の指示に従って2つの逆転写反応系を組み立て、50分間摂氏42度でインキュベートする。cDNAを正常化するには、5つの主なポリホスファターゼ処理または非処理RNAから同じ量のcDNAを用いて2つのPCR反応を調製し、原稿に記載されたサーモサイクル条件下で反応を実行する。26S成熟rRNAによる正規化は、一次と処理されたトランスクリプトを区別するための重要なステップです。2つのPCR産物の量を比較し、必要に応じてテンプレートcDNAの量を調整して正規化を最適化します。標的写本の5つの素数から3つの素数接合部に適切な量の正規化されたcDNAと一対の発散プライマーを用いてPCR反応のペアを調製し、原稿の指示に従ってPCRを行う。次に、ゲルDNA回収キットを使用して、入れ子になったPCRによって増幅される顕著なバンドを分離します。標準的な手法を使用してゲル精製PCR産物をベクターにクローン化し、コロニーPCRを実行して標的インサートを含む陽性クローンを選択します。基本的な局所アライメント検索ツールまたはBLASTを使用して、PCR産物を配列し、シーケンシングデータをトウモロコシミトコンドリアゲノムに位置合わせします。生物トウモロコシを選択し、データベースヌクレオチドコレクションを検索します。回合された転写物の5つの素数から3つの素数接合を見つけ、5つの素数および3つの素数転写物の項の位置を決定する。RNAプローブを調製するために使用されるDNA断片を増幅し、T7プロモーターを含む以前に使用されたベクターにクローン化し、挿入部位の上流に17塩基対を含む。DIG-11-UTPでRNAプローブにラベルを付け、市販キットを使用してRNAハイブリダイゼーションを行います。正規化された5つのプライムポリホスファターゼ処理と非処理RNAから得られた円形RT-PCR産物を比較することにより、一次および処理された5つの素端を判別します。次に、マッピング結果に基づいて定量的RT-PCRプライマーを設計し、RT-PCRで判別結果を検証します。COX-2遺伝子を例に挙げ、環状RT-PCR法によるマイズミトコンドリア転写物のマッピングと識別を実証した。正規化されたcDNAはPCRのテンプレートとして使用され、その結果、5つのプライムポリホスファターゼ処理サンプルから2つの顕著なバンドが増幅されました。2つのバンドは、ゲルから回収されたCOX-2 1と2と命名され、ベクターにクローン化された。コロニーPCRの結果は、陽性クローンが、末語が5つの素数または3つの素数末語を有することを意味する可変サイズの挿入物を含んでいることを示した。シーケンシングの結果から、COX-2の1と2はストップコドンの下流の39ヌクレオチドで同じ3つの素端を有し、5つの素端点はそれぞれ992〜1、030および1、276〜1、283ヌクレオチドが開始コドンの上流に位置することを示した。RNAゲルブロットハイブリダイゼーションを行い、回回RT-PCRマッピング結果を検証し、COX-21と2と同様のサイズを有する2つの主要バンドを検出した。別のダイバージェントプライマーのペアは、COX-2 3および4つのバンドをRNAゲルブロットで検出し、初回の円形RT-PCRでは増幅しないように設計されました。定量的RT-PCRの結果により、COX-2 1、2、3、4は5つのプライムポリホスファターゼに敏感であり、主要な5つのプライムテルミニを持っていることを確認した。このプロトコルには含まれていませんが、5 つの素数マッピング結果を検証するために、Primer 拡張分析を実行できます。

Research

JoVE Journal

Genetics

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CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

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Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

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Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...