Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
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이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (교부금 번호 31600250, Y.Z.), 광저우 시의 과학 기술 프로젝트 (보조금 번호 201804020015, H.N.), 중국 농업 연구 시스템 (보조금 없음)에 의해 지원되었다. CARS-04-PS09, H.N.).

1. 프라이머 디자인
<ol><li>PCR 프라이머 설계 소프트웨어(표오브 머티리얼)를이용하여 역전사(RT)를 위한 유전자 특이적 프라이머를 프라이머설계(17)의일반적인 규칙에 기초한다. 참고: RT 프라이머는 표적 전사체에 매우 특이적이며, 이들은 일반적으로 5' 코딩 서열(성숙한 mRNA 및 전구체 RNA) 또는 예상된 5' 말단(18S 및 26S rRNA)의 ~500-600 nt 다운스트림에 ?...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

이전 연구에서, 애기장대의 세포 현탁물 배양으로부터의 총 및 미토콘드리아 RNA는 cRT-PCR에 의해 미토콘드리아 전사체 종기를 매핑하는데 사용되었고, 유사한 결과를12로얻었다. 그러나, 농축된 미토콘드리아 RNA만이 많은 다른 연구에서 미토콘드리아 전사체 termini를 맵메이상으로 사용하였으며 1, 2,3,<s...

식물 미토콘드리아에서, 많은 성숙및 전구체 RNA는 다중 이소형태로 축적되고, 정상 상태 전사체는 그들의 5' 끝에있는 차이에 기초하여 2개의 단으로 분할될 수 있습니다 1,2,3, 4. 1 차적인 전사는 전사 개시에서 파생되는 5' 삼인산염 끝이 있습니다. 대조적으로, 처리된 전사체는 전사 후 처리에 의해 생성된 5' 단인산염을 갖는다. 2가지 유형의 전사체의 차별 및 매핑은 전사 및 전사 말기 성숙의 근본적인 분자 메커니즘을 해명하는 데 중요하다.
식물 미토콘드리아에서 1 차적인 및 가공된 전사체를 구별하기 위하여는, 4개의 중요한 전략이 개발되었습니다. 첫 번째 전략은 5'삼인산염을 모노포스페이트로 변환하고 RNA 리가제에 의해 원형화될 수 있도록 담배 산 열포스파타제(TAP)로 미토콘드리아 RNA를 미리 치료하는 것입니다. TAP 처리 및 비처리 RNA 샘플의 전사체 풍부는 cDNA 말단(RACE) 또는 원형 RT-PCR(cRT-PCR)의 신속한 증폭에 의해 비교된 후 2,3,4. 두 번째 전략에서, 처리된 전사체는 먼저 터미네이터 5'-인산염 의존성 외핵항 (TEX)을 사용하여 미토콘드리아 RNA로부터 고갈되고, 1차 적인 전사체는 프라이머 확장 분석 5, 6에 의해 매핑됩니다. . 세 번째 전략은 guanylyl 트랜스퍼라제를 사용하여 1차 전사체를 미리 캡을 씌우고, 트리포스피테5'의 위치는 리보누클레아제 또는 S1 뉴클레아제 보호 분석과 함께 프라이머 확장에 의해 결정되는7,8 ,9. 5' 삼인산염의 존재/부재에 따라 다른, 네 번째 전략은 시험관 내 전사, 사이트 지시 돌연변이 발생 및 프라이머 확장 분석을 결합하여 가양성 프로모터를 특성화하고 전사를 결정합니다. 개시 사이트8,10,11. 이러한 전략을 사용 하 여, 많은 기본 및 처리 된 전사체 식물 미토 콘 드리 아에서 결정 되었습니다.
그러나, 몇몇 연구 결과는 1 차적인 전사체의 5' 삼인산염이 불안정했다는 것을 보고하고, 그(것)들은 알 수 없는 이유 2, 4,12,13를위해 monophosphate로 쉽게 변환되었다. 이 문제는 5'triphosphate의 존재/부재에 따라 기술을 사용하여 두 가지 유형의 성적 증명서의 명확한 차별을 방해하고, 공장에서 기본 및 처리 된 성적 증명서 를 체계적으로 구별하기위한 이전의 노력 미토콘드리아실패 2,12.
본 프로토콜에서, 우리는 옥수수에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 구별하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제처리, RT-qPCR 및 노던 블롯을 결합한다(그림 1). cRT-PCR은 RNA 분자의 5' 및 3'사지의 동시 매핑을 허용하며, 일반적으로 식물 2,12,14,15에서전사체 termini를 매핑하도록 조정된다. RNA 5' 폴리포스파타제는 트리포스피페테5' 테르미니에서 2개의 인산염을 제거할 수 있으며, 이는 RNA 리가제에 의한 자가 결찰을 위해 1차 전사체를 사용할 수 있게 한다. 이전 연구는 옥수수에서 성숙한 26S rRNA가 5'종기를 처리했다는 것을 보여주었고, RNA 5'polyphosphatase1,16에민감하지 않았습니다. 1차 5'termini에서 불안정한 삼인산염의 영향을 최소화하기 위해, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA는 성숙한 26S rRNA에 의해 정규화되고, 1차 및 처리된 전사체는 다음을 비교하여 분화됩니다. 2개의 RNA 샘플로부터 수득된 cRT-PCR 제품. cRT-PCR 매핑 및 판별 결과는 각각 노던 블롯과 RT-qPCR에 의해 검증됩니다. 마지막으로, 대체 프라이머는 cRT-PCR에 의해서가 아니라 북부 블롯에서 검출된 전사체를 증폭시키는 데 사용된다. 이 cRT-PCR 기반 전략을 사용하여, 옥수수 미토콘드리아에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서는 차별화되고 매핑된1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

식물 미토콘드리아에서, 몇몇 정상 상태 전사체는 전사 개시 (1 차 적인 전사체)에서 파생된 5' 삼인산염이 있고, 그 외는 5' 단인산염 생성 후 전사 (처리된 전사)를 포함합니다. 성적 증명서의 두 가지 유형을 구별하기 위해, 몇 가지 전략이 개발되었으며, 그들 대부분은 5 '삼인산염의 존재 / 부재에 따라 달라집니다. 그러나, 1 차 5'termini에 있는 삼인산염은 불안정하고, 녹취록의 2개의 모형의 명확한 차별을 방해합니다. 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 차별화하고 매핑하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포슈파타제 처리, 정량적 을 결합하여 원형 RT-PCR(cRT-PCR) 기반 전략을 개발했습니다. RT-PCR(RT-qPCR) 및 북부 블롯. 개선으로, 이 전략은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 RNA 정규화 단계를 포함한다.
이 프로토콜에서 농축 된 미토콘드리아 RNA는 RNA 5 '폴리포스파타제에 의해 전처리되어 5'삼중산염을 모노포스페이트로 변환합니다. 순환화 및 역전사 후, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA는 5' 말단을 처리하고 5' 폴리포스파타제에 민감하지 않은 옥수수 26S 성숙한 rRNA에 의해 정규화된다. 정규화 후, 1차 및 처리된 전사체는 처리된 RNA로부터 수득된 cRT-PCR 및 RT-qPCR 제품을 비교하여 차별된다. 전사체 테르미니는 cRT-PCR 제품의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 결정된 다음, 북부 블롯에 의해 검증된다.
이 전략을 사용 하 여, 옥수수 미토 콘 드리 온에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서 결정 되었습니다. 일부 미토콘드리아 유전자의 복잡한 전사체 패턴으로 인해, 몇몇 정상 상태 전사체는 북부 얼룩에서 검출되었지만 분화 및/또는 매핑되지 않았습니다. 우리는 이 전략이 다른 식물 미토콘드리아또는 석고에 있는 정상 상태 전사체를 차별하고 지도로 지도하기에 적당한지 확실하지 않습니다.

미토콘드리아 RNA 원형화 효율 추정
이전 연구에서, 총 및 미토콘드리아 RNA는 모두 애기장대에서 미토콘드리아 전사체 종단의 cRT-PCR 매핑에 사용되었고(애기장대탈리아나),두 가지 유형의 RNA는 유사한 매핑 결과를12로주었다. 처음에, 우리는 또한 옥수수에 있는 미토콘드리아 전사체...

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Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

이 프로토콜은 옥수수 미토콘드리아에서 기본 및 처리 된 성적 증명서의 매핑 및 차별에 사용됩니다. 이 기술은 RNA 정규화 단계를 포함하고 1 차및 처리된 성적증명서 사이 명확한 차별을 방해하는 불안정한 5개의 프라임 triphosphate의 영향을 최소화합니다. 옥수수 미토콘드리아 외에, 이 방법은 플라스티드 및 기타 식물 미토콘드리아에 적용 될 수있다.먼저 20그램의 커널을 얼음 위에 50밀리리터 튜브로 모으십시오. 커널을 미리 냉각된 박격포로 옮기고 10~20밀리리터의 얼음 냉기 추출 버퍼를 추가합니다. 커널을 완전히 갈고, 추출 버퍼를 더 추가하고 필터 천의 두 층을 통해 지상 조직을 필터링합니다.10 분 동안 8, 000 배 G에서 여과를 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 새 튜브로 옮기고 여과물을 폐기합니다. 10 분 동안 20, 000 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다.상체를 붓고 6 밀리리터의 세척 버퍼로 펠릿을 다시 중단합니다. Aliquot는 서스펜션을 5개의 1.5 밀리리터 RNase 프리 튜브로 인용하고 5분 동안 14, 000배 G에서 원심분리합니다. 상체를 버리고 미토콘드리아 펠릿을 액체 질소로 동결하십시오.제조 업체의 지시에 따라 상용 시약을 사용하여 미토콘드리아 RNA를 추출하고 RNA 5 가지 주요 폴리 인산염 치료를 설정합니다. 이어서, RNA 정제 키트로 RNA를 회수한다. RNA 추출에 사용되는 시약은 위험합니다.항상 연기 후드에서 작업하고 항상 실험실 코트와 장갑을 착용. 처리된 5개의 주요 폴리포스파아제 및 비처리 미토콘드리아 RNA의 동일한 양을 사용하여 2개의 순환화 반응을 준비합니다. 12-16시간 동안 섭씨 16도에서 두 반응을 모두 배양한 다음 이전에 사용한 RNA 정제 키트로 자체 계합 RNA를 회수합니다.26 SCRT의 동일한 비율로 프라이머 혼합물을 준비하고 최대 7 개의 다른 역 전사 프라이머를 준비하여 시작합니다. 원고 방향에 따라 두 개의 역전사 반응 시스템을 조립하고 50 분 동안 섭씨 42도에서 배양하십시오. cDNA를 정상화하기 위해, 5개의 주요 폴리포스파타제 처리 또는 비처리 RNA에서 동일한 양의 cDNA의 2개의 PCR 반응을 준비하고 원고에 기술된 열순환 조건하에서 반응을 실행한다.26S 성숙한 rRNA에 의한 정규화는 1차 및 처리된 성적증명서를 구별하는 중요한 단계이다. 두 PCR 제품의 풍부를 비교하고 필요한 경우 템플릿 cDNA의 양을 조정하여 정규화를 최적화합니다. 정규화된 cDNA의 적절한 볼륨과 5개의 프라임에서 대상 성적증명서의 3가지 주요 접합체와 같은 이가지 프라이머 한 쌍으로 PCR 반응을 준비하고 원고 방향에 따라 PCR을 수행한다.그런 다음, 중첩 된 PCR에 의해 증폭되는 눈에 띄는 밴드를 분리하는 젤 DNA 복구 키트를 사용합니다. 표준 기술을 사용하여 젤 정제 PCR 제품을 벡터로 복제하고 콜로니 PCR을 수행하여 대상 인서트를 포함하는 양수 클론을 선택합니다. PCR 제품을 서열화하고 기본 국소 정렬 검색 도구 또는 BLAST를 사용하여 옥수수 미토콘드리아 게놈과 시퀀싱 데이터를 정렬합니다.유기체 옥수수를 선택하고 데이터베이스 뉴클레오티드 수집을 검색합니다. 원형 성적증명서의 5개의 프라임에서 3개의 프라임 접합을 찾아 5개의 프라임 및 3개의 주요 성적증명서 테르미니의 위치를 결정한다. RNA 프로브를 준비하고 T7 프로모터, 17개의 염기 쌍이 삽입 부위의 상류에 포함된 이전에 사용된 벡터로 복제하는 데 사용되는 DNA 단편을 증폭한다.RNA 프로브에 dig-11-UTP로 라벨을 지정하고 상용 키트를 사용하여 RNA 혼성화를 수행합니다. 정규화된 5가지 주요 폴리인세파아제 처리 및 비처리 RNA로부터 얻은 원형 RT-PCR 제품을 비교하여 1차 및 처리된 5개의 주요 끝을 차별한다. 그런 다음 매핑 결과를 기반으로 정량적 RT-PCR 프라이머를 설계하고 RT-PCR로 차별 결과를 확인합니다.COX-2 유전자는 원형 RT-PCR 기반 전략으로 옥수수 미토콘드리아 전사체의 매핑 및 차별을 입증하는 예로 사용되었다. 정규화된 cDNA는 PCR용 템플릿으로 사용되었으며, 그 결과 5개의 주요 폴리포스파타제 처리 샘플에서 두 개의 저명한 밴드가 증폭되었습니다. 두 밴드는 COX-2 1과 2개의 젤에서 회수되어 벡터로 복제되었습니다.콜로니 PCR 결과는 양성 클론이 가변 크기의 인서트를 포함하고 있으며, 이는 테르미니가 이질성 5개의 프라임 또는 3개의 프라임 테르미니를 가지고 있음을 의미한다. 시퀀싱 결과는 COX-2 1 과 2가 정지 코돈의 39 뉴클레오티드 하류에서 동일한 3개의 프라임 엔드를 가지고 있으며, 5개의 주요 종말은 각각 992 대 1, 030 및 1, 276 대 1, 283 뉴클레오티드 상류에 위치한 것으로 나타났다. RNA 젤 블롯 혼성화는 COX-2 1 및 2와 유사한 크기를 가진 원형 RT-PCR 매핑 결과 및 2개의 주요 대역을 검증하기 위해 수행되었다.또 다른 쌍의 이산 프라이머는 RNA 젤 블롯으로 검출된 COX-2 3 및 4개의 밴드를 증폭하도록 설계되었지만 처음 원형 RT-PCR로는 그렇지 않았습니다. 정량적 RT-PCR 결과는 COX-2 1, 2, 3 및 4가 5개의 주요 폴리포스파타제에 민감하고 5개의 주요 테르미니를 가졌다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜에는 포함되지 않지만 프라이머 확장 분석을 수행하여 5가지 주요 매핑 결과를 확인할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

연구

유전학

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3'

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...