Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 31600250, Y.Z.), vitenskap og teknologi prosjekter i Guangzhou City (Grant no. 201804020015, H.N.), og China Agricultural Research system (Grant no. CARS-04-PS09, H.N.).

1. primer design
<ol><li>Design gen-spesifikke primere for omvendt transkripsjon (RT) ved hjelp av PCR primer design software (tabell av materialer) basert på de generelle reglene for primer design17. Merk: RT primere er svært spesifikke for målet transkripsjoner, og de er generelt forankret på 5 ' del av koding sekvenser (eldre mRNAs og forløper RNAs), eller ~ 500-600 NT nedstrøms av den forventede 5 ' end (18S og 26S rRNAs).</li>
	<li>Design par av av...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

I en tidligere studie, total og mitokondrie RNAs fra celle suspensjon kultur Arabidopsis ble brukt til å kartlegge mitokondrie transkripsjon Termini av CRT-PCR, og lignende resultater ble innhentet12. Men bare beriket mitokondrie RNA ble brukt til å kartlegge mitokondrie transkripsjon Termini i mange andre studier1,2,3,9. Vi fant ut at berikelse av mitokondrie...

I Plant mitokondrier, er mange modne og forløper RNAs akkumulert som flere isoformene, og steady-state transkripsjoner kan deles inn i to grupper basert på forskjellen på deres 5 ' ender1,2,3, firetil. Den primære transkripsjoner har 5 ' trifosfat ender, som er avledet fra transkripsjon innvielse. Til sammenligning har de behandlede transkripsjoner 5 ' monofosfat generert av post-transcriptional prosessering. Diskriminering og kartlegging av de to typer transkripsjoner er viktig å avdekke den molekylære mekanismer underliggende transkripsjon og transkripsjon slutten modning.
For å skille mellom de primære og behandlede transkripsjoner i anlegget mitokondrie, fire store strategier er utviklet. Den første strategien er å pre-behandle mitokondrie RNAs med Tobacco acid pyrophosphatase (TAP), som konverterer 5 ' trifosfat å monofosfat og gjør primær transkripsjoner å bli circularized av RNA ligase. Transkripsjon forekomster av trykk-behandlet og ikke-behandlet RNA prøver blir deretter sammenlignet med rask forsterkning av cDNA ender (Race) eller sirkulær RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den andre strategien, behandles transkripsjoner først utarmet fra mitokondrie RNAs bruker Terminator 5 '-fosfat-avhengige exonuclease (Tex), og den primære transkripsjoner venstre blir deretter kartlagt ved primer forlengelse analyse5,6 . Den tredje strategien er å pre-cap den primære transkripsjoner bruker guanylyl glutamyltransferase, og deretter plasseringen av triphosphated 5 ' Termini bestemmes av primer forlengelse sammen med ribonuklease eller S1 nuklease beskyttelse analyse7,8 ,9. Forskjellig fra de avhengig av tilstedeværelse/fravær av 5 ' trifosfat, den fjerde strategien kombinerer in vitro transkripsjon, site-regissert mutagenese, og primer forlengelsen analyse for å karakterisere antatte arrangører og bestemme transkripsjon Innvielse nettsteder8,10,11. Ved å bruke disse strategiene, mange primære og bearbeidet transkripsjoner har blitt bestemt i anlegget mitokondrier.
Imidlertid har flere studier rapportert at 5 ' trifosfat av primære transkripsjoner var ustabile, og de ble lett konverteres til monofosfat for ukjent grunn2,4,12,13. Dette problemet hindrer en klar diskriminering av de to typer transkripsjoner ved hjelp av teknikker avhengig av tilstedeværelse/fravær av 5 ' trifosfat, og tidligere forsøk på å systematisk diskriminere mellom de primære og bearbeidede transkripsjoner i anlegget mitokondrier mislyktes2,12.
I denne protokollen kombinerer vi cRT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase behandling, RT-qPCR og Northern blot for systematisk å skille de primære og behandlede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais (Zea Mays) mitokondrie (figur 1). cRT-PCR tillater samtidig kartlegging av 5 ' og 3 ' ekstremiteter av et RNA molekyl, og det er vanligvis tilpasset kart transkripsjon Termini i planter2,12,14,15. RNA 5 ' polyphosphatase kan fjerne to fosfater fra triphosphated 5 ' Termini, som gjør at de primære utskriftene er tilgjengelige for selv ligation av RNA-ligase. Tidligere studier viste at modne 26s rRNA i mais hadde behandlet 5 ' Terminus, og det var ufølsom for RNA 5 ' polyphosphatase1,16. For å minimere påvirkningen av ustabile trifosfat på primær 5 ' Termini, de 5 ' polyphosphatase og ikke-behandlet RNAs er normalisert av eldre 26s rRNA, og den primære og bearbeidede transkripsjoner er så differensiert ved å sammenligne cRT-PCR-produkter Hentet fra de to RNA-prøvene. Den cRT-PCR kartlegging og diskriminering resultater er verifisert av Northern blot og RT-qPCR, henholdsvis. Til slutt, alternative primere brukes til å forsterke de transkripsjoner påvist i Northern blot, men ikke av cRT-PCR. Ved å bruke denne cRT-PCR-basert strategi, har de fleste steady-state transkripsjoner i mais mitokondrie blitt differensiert og kartlagt1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

I anlegget mitokondrier, noen steady-state transkripsjoner har 5 ' trifosfat avledet fra transkripsjon innvielse (Primær transkripsjoner), mens de andre inneholder 5 ' monofosfat generert post-transcriptionally (bearbeidet transkripsjoner). Å diskriminere mellom de to typene av transkripsjoner, har flere strategier er utviklet, og de fleste av dem er avhengige av tilstedeværelse/fravær av 5 ' trifosfat. Imidlertid er trifosfat på primær 5 ' Termini ustabil, og det hindrer en klar diskriminering av de to typer transkripsjoner. For systematisk å differensiere og kartlegge de primære og behandlede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais mitokondrie, har vi utviklet en sirkulær RT-PCR (cRT-PCR)-basert strategi ved å kombinere cRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase behandling, kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR), og Northern blot. Som en forbedring, inkluderer denne strategien en RNA normalisering skritt for å minimere påvirkning av ustabile 5 ' trifosfat.
I denne protokollen er den beriket mitokondrie RNA pre-behandlet av RNA 5 ' polyphosphatase, som omdanner 5 ' triphsophate til monofosfat. Etter circularization og omvendt transkripsjon, de to cDNAs avledet fra 5 ' polyphosphatase-behandlet og ikke-behandlet RNAs er normalisert av mais 26S eldre rRNA, som har en bearbeidet 5 ' end og er ufølsom for 5 ' polyphosphatase. Etter normalisering blir de primære og behandlede transkripsjoner diskriminert ved å sammenligne cRT-PCR-og RT-qPCR-produkter som er Hentet fra de behandlede og ikke-behandlede RNAs. Transkripsjon Termini bestemmes av kloning og sekvensering av cRT-PCR produkter, og deretter verifisert av Northern blot.
Ved å bruke denne strategien, har de fleste steady-state transkripsjoner i mais mitokondrie blitt bestemt. På grunn av den kompliserte transkripsjon mønster av noen mitokondrie gener, noen steady-state transkripsjoner ikke var differensiert og/eller kartlagt, selv om de ble oppdaget i en Northern blot. Vi er ikke sikker på om denne strategien er egnet til å diskriminere og kart steady-state transkripsjoner i andre plante mitokondrier eller i plastids.

Estimering av mitokondrie RNA-circularization effektivitet
I en tidligere studie, både total og mitokondrie RNAs ble brukt for cRT-PCR kartlegging av mitokondrie transkripsjon Termini i Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), og de to typene RNAs ga lignende kartlegging resultater12. I utgangspunktet brukte vi også total RNAs for cRT-PCR kartlegging av mitokondrie transkri...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discrimintion og kartlegging av primær og behandlet transkripsjoner i mais mitokondrie bruke en sirkulær RT-PCR-basert strategi

Vi presenterer en sirkulær RT-PCR-basert strategi ved å kombinere sirkulær RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase og Northern blot. Denne protokollen inkluderer en normalisering skritt for å minimere påvirkning av ustabile 5 ' trifosfat, og det er egnet for diskriminerende og kartlegging den primære og bearbeidede transkripsjoner stabilt akkumulert i mais mitokondrie.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Denne protokollen brukes til kartlegging og diskriminering av de primære og bearbeidede transkripsjonene i mais mitokondrier. Denne teknikken inkluderer et RNA normaliseringstrinn, og det minimerer påvirkningen av ustabil fem førsteklasses trifosfat som hindrer en klar diskriminering mellom primær og de behandlede transkripsjonene. Foruten mais mitokondrier, kan denne metoden brukes på plastider og andre plante mitokondrier.Start med å samle 20 gram å utvikle kjerner i et 50 milliliter rør på is. Overfør kjernene til en forhåndskjølt mørtel og tilsett 10 til 20 milliliter iskald ekstraksjonsbuffer. Grind kjernene helt, tilsett mer ekstraksjonsbuffer og filtrer jordvevet gjennom to lag med filterklut.Sentrifuge filtratet ved 8000 ganger G i 10 minutter. Overfør deretter overnatanten til et nytt rør og kast filtratet. Sentrifuger røret ved 20.000 ganger G i 10 minutter.Hell av supernatant og re-suspendere pellet i seks milliliter vaskebuffer. Aliquot suspensjon i fem 1,5 milliliter RNase-frie rør og sentrifuge dem på 14,000 ganger G i fem minutter. Kast det overnaturlige og frys mitokondriepellet i flytende nitrogen.Trekk ut mitokondrie RNA ved hjelp av kommersielle reagenser i henhold til produsentens instruksjoner og sett opp en RNA fem førsteklasses polyfosfatasebehandling. Deretter gjenoppretter du RNA med et RNA-rensesett. Reagensen som brukes til RNA-ekstraksjon er farlig.Arbeid alltid med den i en røykhette og bruk alltid labfrakk og hansker. Forbered to sirkulæriseringsreaksjoner ved hjelp av de samme mengdene av fem førsteklasses polyfosfatase behandlet og ikke-behandlet mitokondrieRNA.Prepare two circularization reactions using the same amounts of five prime polyphosphatase treated and non-treated mitokondrie RNA's. Inkuber begge reaksjonene ved 16 grader celsius i 12 til 16 timer og deretter gjenopprette selv-ligated RNA-er med en tidligere brukt RNA rensing kit.Start med å forberede en primerblanding med et likt forhold på 26 SCRT og opptil syv andre omvendte transkripsjons primere. Sett sammen to omvendte transkripsjonsreaksjonssystemer i henhold til manuskriptets retninger og inkuber dem ved 42 grader celsius i 50 minutter. For å normalisere cDNA, forberede to PCR reaksjoner med samme volum av cDNA fra de fem viktigste polyfosfatase behandlet eller ikke-behandlet RNA og kjøre reaksjonen under termocycling forhold beskrevet i manuskriptet.Normalisering av 26S modne rRNA er et viktig skritt for å diskriminere mellom de primære og behandlede transkripsjonene. Sammenlign overflod av de to PCR-produktene og om nødvendig optimalisere normaliseringen ved å justere mengdene mal cDNA-er. Forbered par med PCR-reaksjoner med passende volumer av normaliserte cDNA-er og et par divergerende primere som i de fem prime til tre førsteklasses kryss av måltranskripsjonene og utfør PCR i henhold til manuskriptinstruksjonene.Deretter bruker du et gel-DNA-gjenopprettingssett for å isolere de fremtredende båndene som forsterkes av nestet PCR. Klone gel renset PCR produkter i en vektor ved hjelp av standard teknikker og utføre koloni PCR for å velge positive kloner som inneholder målet innsatser. Sekvenser PCR-produktene og juster sekvenseringsdataene etter mais mitokondriegenomet ved hjelp av det grunnleggende lokale justeringsøkeverktøyet eller BLAST.Velg organismen mais og søke database nukleotid samling. Finn de fem prime til tre prime krysset av sirkulære transkripsjon og bestemme plasseringene av de fem prime og tre prime transkripsjon termini. Forsterk DNA-fragmentet som brukes til å forberede RNA-sonden og klone den til den tidligere brukte vektoren som inneholder en T7-promotor, 17 basepar oppstrøms av innsettingsstedet.Merk RNA-sondene med dig-11-UTP og utfør RNA-hybridisering ved hjelp av kommersielle sett. Diskriminer de primære og bearbeidede fem prime ends ved å sammenligne de sirkulære RT-PCR-produktene hentet fra de normaliserte fem førsteklasses polyfosfatasebehandlede og ikke-behandlede RAs. Deretter utformer du kvantitative RT-PCR-primere basert på kartresultatene og verifiserer diskrimineringsresultatene med RT-PCR.COX-2-genet ble brukt som et eksempel for å demonstrere kartlegging og diskriminering av mais mitokondrietranskripsjoner med den sirkulære RT-PCR-baserte strategien. De normaliserte cDNA-ene ble brukt som maler for PCR, noe som resulterte i to fremtredende bånd forsterket fra den fem prime polyfosfatasebehandlede prøven. De to bandene ble kalt COX-2 en og to gjenopprettet fra gelen og klonet inn i vektorer.Koloni PCR resultater viste at de positive kloner inneholder innsatser med variabel størrelse som innebærer at termini har heterogene fem prime eller tre prime termini. Sekvenseringsresultatene viste at COX-2 en og to har de samme tre prime endene på 39 nukleotider nedstrøms av stoppkodonen, mens deres fem prime termini ligger på henholdsvis 992 til 1, 030 og 1, 276 til 1, 283 nukleotider oppstrøms av startkodonen. RNA gel blot hybridisering ble utført for å verifisere sirkulære RT-PCR kartlegging resultater og to store bånd med størrelser som ligner cox-2 en og to ble oppdaget.Et annet par divergerende primere ble designet for å forsterke COX-2 tre og fire band oppdaget med RNA gel blot, men ikke med første gang sirkulær RT-PCR. De kvantitative RT-PCR resultatene bekreftet at COX-2 en, to, tre og fire var følsomme for fem prime polyfosfatase og at de hadde primære fem prime termini. Primer-utvidelsesanalyse kan utføres for å bekrefte de fem viktigste kartleggingsresultatene selv om det ikke er inkludert i denne protokollen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartlegging og CRISPR / Cas9 redigering for å identifisere et stoffresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kartlegging genomet hele tilgjengelig Chromatin i primære menneskelige T-lymfocytter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Tilpasse 3 slutter raske forsterkning av CDNA å tilordne utskrifter i kreft

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Bruker Ustilago maydis som en trojansk hest for i Situ levering av mais proteiner

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karakterisere Histone post-translasjonell modifikasjon endringer i gjær nevrodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...