Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (concesión no 31600250, Y.Z.), Proyectos de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Guangzhou (concesión no 201804020015, H.N.) y el Sistema de Investigación Agrícola de China (concesión no. CARS-04-PS09, H.N.).

1. Primer diseño
<ol><li>Diseñar imprimadores específicos de genes para transcripción inversa (RT) utilizando el software de diseño de imprimación PCR (Tablade Materiales)basados en las reglas generales del diseño de imprimación17. NOTA: Los imprimadores RT son muy específicos para las transcripciones de destino, y generalmente están anclados en la parte de 5' de las secuencias de codificación (RNN maduros y ARN precursores), o 500-600 nt aguas aba...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

En un estudio anterior, los ARN totales y mitocondriales del cultivo de suspensión celular de Arabidopsis se utilizaron para mapear la transcripción mitocondrial termini por cRT-PCR, y se obtuvieron resultados similares12. Sin embargo, sólo el ARN mitocondrial enriquecido se utilizó para mapear la transcripción mitocondrial termini en muchos otros estudios1,2,3,9...

En las mitocondrias vegetales, muchos ARN maduros y precursores se acumulan como múltiples isoformas, y las transcripciones de estado estacionario se pueden dividir en dos grupos basados en la diferencia en sus extremos de 5'1,2,3, 4. Las transcripciones primarias tienen extremos de trifosfato de 5', que se derivan de la iniciación de la transcripción. Por el contrario, las transcripciones procesadas tienen 5' monofosfato generado por el procesamiento post-transcripción. La discriminación y el mapeo de los dos tipos de transcripciones son importantes para desentrañar los mecanismos moleculares subyacentes a la transcripción y la maduración final de la transcripción.
Para distinguir entre las transcripciones primarias y procesadas en el mitocondrion vegetal, se han desarrollado cuatro estrategias principales. La primera estrategia es pretratar los ARN mitocondriales con pirofosfatasa de ácido tabaco (TAP), que convierte el trifosfato de 5' en monofosfato y permite que las transcripciones primarias sean circularizadas por ARN ligatado. Las abundancias de transcripción de muestras de ARN tratadas con TAP y no tratadas se comparan entonces por la amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) o RT-PCR circular (cRT-PCR)2,3,4. En la segunda estrategia, las transcripciones procesadas se agotan en primer lugar de los ARN mitocondriales utilizando exonucleasa dependiente del terminador 5'-fosfato (TEX), y las transcripciones primarias que quedan se mapean mediante el análisis de extensión de imprimación5,6 . La tercera estrategia es pre-tapar las transcripciones primarias usando guanylyl transferasa, y luego la posición de trifosfato 5' termini se determina mediante la extensión de imprimación junto con el análisis de protección de la nucleasa S17,8 ,9. A diferencia de las que dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5', la cuarta estrategia combina transcripción in vitro, mutagénesis dirigida por el sitio y análisis de extensión de imprimación para caracterizar a los promotores putativos y determinar la transcripción sitiosdeiniciación 8,10,11. Mediante el uso de estas estrategias, se han determinado muchas transcripciones primarias y procesadas en las mitocondrias vegetales.
Sin embargo, varios estudios han informado de que el trifosfato de 5' de transcripciones primarias eran inestables, y se convirtieron fácilmente en monofosfato por razón desconocida2,4,12,13. Este problema dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones mediante el uso de técnicas en función de la presencia/ausencia de trifosfato de 5', y esfuerzos anteriores para discriminar sistemáticamente entre las transcripciones primarias y procesadas en la planta mitocondrias falló2,12.
En este protocolo, combinamos cRT-PCR, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5', RT-qPCR y Northern blot para distinguir sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en maíz (Zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR permite el mapeo simultáneo de 5' y 3' extremidades de una molécula deARN, y generalmente se adapta a la transcripción de mapa termini en plantas 2,12,14,15. ARN 5' polifosfatasa podría eliminar dos fosfatos de la trifosfato 5' termini, lo que hace que las transcripciones primarias estén disponibles para la auto-ligación por ARN ligasa. Estudios anteriores mostraron que el ARNm maduro 26S en el maíz había procesado 5' terminus, y era insensible al ARN 5' polifosfatasa1,16. Para minimizar la influencia del trifosfato inestable en los 5' termini primarios, los ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5' se normalizan mediante arNM maduros de 26S, y las transcripciones primarias y procesadas se diferencian comparando las cRT-PCR obtenidos de las dos muestras de ARN. Los resultados de la asignación cRT-PCR y la discriminación son verificados por Northern blot y RT-qPCR, respectivamente. Por último, se utilizan imprimaciones alternativas para amplificar las transcripciones detectadas en Northern blot pero no por cRT-PCR. Mediante el uso de esta estrategia basada en cRT-PCR, la mayoría de las transcripciones de estado estacionario en mitocondrion de maíz se han diferenciado y mapeado1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

En las mitocondrias vegetales, algunas transcripciones en estado estacionario tienen 5' trifosfato derivado de la iniciación de la transcripción (transcripciones primarias), mientras que los otros contienen 5' monofosfato generado post-transcripción (transcripciones procesadas). Para discriminar entre los dos tipos de transcripciones, se han desarrollado varias estrategias, y la mayoría de ellas dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5'. Sin embargo, el trifosfato en la primaria 5' termini es inestable, y dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones. Para diferenciar y mapear sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas de forma estable en el mitocondrion de maíz, hemos desarrollado una estrategia circular basada en RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, tratamiento de polifoshpatase de ARN 5', cuantitativa RT-PCR (RT-qPCR) y Northern blot. Como mejora, esta estrategia incluye un paso de normalización de ARN para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5'.
En este protocolo, el ARN mitocondrial enriquecido es pretratado por la polifosfatasa de ARN 5', que convierte el triphsofato de 5' en monofosfato. Después de la circularización y la transcripción inversa, los dos CDNderivados derivados de ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5' se normalizan mediante el ARNm maduro de maíz 26S, que tiene un extremo procesado de 5' y es insensible a 5' polifosfatasa. Después de la normalización, las transcripciones primarias y procesadas se discriminan comparando los productos cRT-PCR y RT-qPCR obtenidos de los ARN tratados y no tratados. La transcripción termini se determina mediante clonación y secuenciación de los productos cRT-PCR, y luego verificada por Northern blot.
Mediante el uso de esta estrategia, se han determinado la mayoría de las transcripciones en estado estacionario en mitocondrion de maíz. Debido al complicado patrón de transcripción de algunos genes mitocondriales, algunas transcripciones en estado estacionario no se diferenciaron y/o mapearon, aunque se detectaron en una mancha del norte. No estamos seguros de si esta estrategia es adecuada para discriminar y mapear las transcripciones de estado estacionario en otras mitocondrias vegetales o en plastoides.

Estimación de la eficiencia de la circularización del ARN mitocondrial
En un estudio anterior, se utilizaron ARN totales y mitocondriales para la cartografía cRT-PCR de transcripción mitocondrial termini en Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), y los dos tipos de ARN dieron resultados cartográficos similares12. Inicialmente, también usamos ARN totales para el mapeo c...

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Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminción y mapeo de las transcripciones primarias y procesadas en mitocondrion de maíz utilizando una estrategia circular basada en RT-PCR

Presentamos una estrategia circular basada en RT-PCR combinando RT-PCR circular, RT-PCR cuantitativo, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5' y mancha norte. Este protocolo incluye un paso de normalización para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5', y es adecuado para discriminar y mapear las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en el mitocondrion de maíz.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Este protocolo se utiliza para mapear y discriminar las transcripciones primarias y procesadas en las mitocondrias de maíz. Esta técnica incluye un paso de normalización del ARN y minimiza la influencia de cinco trifosfatos primos inestables que dificultan una clara discriminación entre las transcripciones primarias y las procesadas. Además de las mitocondrias de maíz, este método podría aplicarse a los plastoides y otras mitocondrias vegetales.Comience por recoger 20 gramos de granos en desarrollo en un tubo de 50 mililitros sobre hielo. Transfiera los granos a un mortero preenfriado y agregue de 10 a 20 mililitros de tampón de extracción de frío helado. Moler los granos completamente, añadir más tampón de extracción y filtrar el tejido del suelo a través de dos capas de tela de filtro.Centrifugar el filtrado a 8.000 veces G durante 10 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el filtrado. Centrifugar el tubo a 20.000 veces G durante 10 minutos.Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en seis mililitros de tampón de lavado. Aliquot la suspensión en cinco tubos libres de RNase de 1,5 mililitros y centrifugarlos a 14.000 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y congele el pellet mitocondrial en nitrógeno líquido.Extraiga el ARN mitocondrial utilizando reactivos comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante y configure un ARN cinco tratamientos de polifosfatasa de primera calidad. A continuación, recupere el ARN con un kit de purificación de ARN. El reactivo utilizado para la extracción de ARN es peligroso.Trabaje siempre con ella en una campana de humo y siempre use bata de laboratorio y guantes. Preparar dos reacciones de circularización utilizando las mismas cantidades de ARN mitocondrial tratado y no tratado de primera calidad. Incubar ambas reacciones a 16 grados centígrados durante 12 a 16 horas y luego recuperar el ARN auto-ligado con un kit de purificación de ARN previamente utilizado.Comience preparando una mezcla de imprimación con una proporción igual de 26 SCRT y hasta siete otras imprimaciones de transcripción inversa. Montar dos sistemas de reacción de transcripción inversa de acuerdo con las instrucciones del manuscrito e incubarlos a 42 grados centígrados durante 50 minutos. Para normalizar el ADNc, prepare dos reacciones de PCR con el mismo volumen de ADNc de los cinco ARN tratados o no tratados con polifosfatasa de primera calidad y ejecute la reacción en las condiciones de termociclismo descritas en el manuscrito.La normalización por RRNA madura 26S es un paso clave para discriminar entre las transcripciones primarias y procesadas. Compare la abundancia de los dos productos de PCR y, si es necesario, optimice la normalización ajustando las cantidades de la plantilla cDNA. Preparar pares de reacciones PCR con volúmenes apropiados de ADNn y un par de imprimaciones divergentes como en la unión de cinco primos a tres de las transcripciones objetivo y realizar PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.A continuación, utilice un kit de recuperación de ADN de gel para aislar las bandas prominentes que se amplifican por PCR anidado. Clonar los productos de PCR purificados en gel en un vector utilizando técnicas estándar y realizar PCR de colonia para seleccionar clones positivos que contienen las inserciones de destino. Secuenciar los productos de PCR y alinear los datos de secuenciación con el genoma mitocondrial de maíz utilizando la herramienta básica de búsqueda de alineación local o BLAST.Elija el maíz del organismo y busque la colección de nucleótidos de la base de datos. Encuentra el cruce de cinco a tres primos de la transcripción circularizada y determina las posiciones de los cinco primos y tres termini de transcripción primo. Amplificar el fragmento de ADN utilizado para preparar la sonda de ARN y clonarlo al vector utilizado anteriormente que contiene un promotor T7, 17 pares base aguas arriba del sitio de inserción.Etiquete las sondas de ARN con dig-11-UTP y realice la hibridación de ARN utilizando kits comerciales. Discriminar los cinco extremos primarios y procesados comparando los productos RT-PCR circulares obtenidos de los cinco ARN primarios y no tratados normalizados. A continuación, diseñe imprimaciones RT-PCR cuantitativas basadas en los resultados de la asignación y verifique los resultados de la discriminación con RT-PCR.El gen COX-2 se utilizó como ejemplo para demostrar el mapeo y la discriminación de las transcripciones mitocondriales de maíz con la estrategia circular basada en RT-PCR. Los cDNA normalizados se utilizaron como plantillas para PCR, lo que dio lugar a dos bandas prominentes amplificadas a partir de la muestra tratada con polifosfatasa de primera. Las dos bandas fueron nombradas COX-2 una y dos recuperadas del gel y clonadas en vectores.Los resultados de colony PCR mostraron que los clones positivos contienen inserciones con tamaño variable, lo que implica que los termini tienen cinco primos heterogéneos o tres termini primo. Los resultados de la secuenciación mostraron que COX-2 uno y dos tienen los mismos tres extremos primos en 39 nucleótidos aguas abajo del codón de parada, mientras que sus cinco termini primos se encuentran en 992 a 1, 030 y 1, 276 a 1, 283 nucleótidos aguas arriba del codón de inicio, respectivamente. Se realizó la hibridación de manchas de gel de ARN para verificar los resultados circulares de la cartografía RT-PCR y se detectaron dos bandas principales con tamaños similares a COX-2 uno y dos.Otro par de imprimadores divergentes fueron diseñados para amplificar el COX-2 tres y cuatro bandas detectadas con la mancha de gel de ARN, pero no con la primera vez circular RT-PCR. Los resultados cuantitativos de RT-PCR confirmaron que COX-2 uno, dos, tres y cuatro eran sensibles a cinco polifosfatasas de primera calidad y que tenían cinco termini primarios. El análisis de extensión de primer se podría realizar para verificar los cinco resultados de mapeo primo aunque no está incluido en este protocolo.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Investigación

Genética

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