Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 31600250, Y.Z.), vetenskap och teknikprojekt i Guangzhou City (Grant nr 201804020015, H.N.), och Kinas jordbruks forsknings system (Grant No. BILAR-04-PS09, H.N.).

1. primer design
<ol><li>Designa genspecifika primers för omvänd Transkription (RT) med hjälp av PCR primer Design Software (tabell över material) baserat på de allmänna reglerna för primer design17. Anmärkning: RT primers är mycket specifika för mål avskrifter, och de är i allmänhet förankrade på 5 ' del av kodning sekvenser (mogna mRNAs och föregångare RNAs), eller ~ 500 till 600 NT nedströms den förväntade 5 ' End (18S och 26S rRNAs).</...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

I en tidigare studie, total och mitokondriell RNAs från cellsuspension kultur Arabidopsis användes för att kartlägga mitokondriell avskrift Termini av CRT-PCR, och liknande resultat erhölls12. Emellertid, endast berikat mitokondriellt RNA användes för att kartlägga mitokondriella transkription Termini i många andra studier1,2,3,9. Vi fann att berikninge...

I växternas mitokonliker ackumuleras många mogna och föregångare rnas som flera isoformer, och de steady-state avskrifter kan delas in i två grupper baserat på skillnaden vid deras 5 ' slutar1,2,3, 4. De primära transkriptioner har 5 ' trifosfat ändar, som härrör från transkription initiering. Däremot har de bearbetade transkripterna 5 ' monofosfat som genererats genom post-transkriptionell bearbetning. Diskriminering och kartläggning av de två typerna av utskrifter är viktigt att riva upp de molekylära mekanismerna bakom transkription och avskrift mognad.
För att skilja mellan de primära och bearbetade transkriptioner i växternas mitokonbener har fyra viktiga strategier utvecklats. Den första strategin är att förbehandla den mitokondriella RNAs med tobaks syra pyrofosfatas (TAP), som omvandlar 5 ' trifosfat till monofosfat och gör det möjligt för primära avskrifter att cirkulariseras av RNA Ligase. Avskriften överflöd av Tap-behandlade och icke-behandlade RNA-prover jämförs sedan med snabb förstärkning av cDNA ändar (Race) eller cirkulär RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den andra strategin utarmas bearbetade utskrifter för det första från mitokondriell rnas med Terminator 5 '-fosfat beroende exonukleas (tex), och de primära avskrifter som lämnas sedan kartläggs med primer-förlängningsanalys5,6 . Den tredje strategin är att pre-Cap de primära avskrifter med guanylyl transferase, och sedan positionen av trifosfated 5 ' Termini bestäms av primer förlängning tillsammans med ribonukleas eller S1 Nuclease Protection Analysis7,8 ,9. Skiljer sig från de beroende på närvaron/frånvaron av 5 ' trifosfat, den fjärde strategin kombinerar in vitro-transkription, platsriktade mutagenes, och primer förlängnings analys för att karakterisera den förmodade initiativtagarna och bestämma transkription initiering platser8,10,11. Genom att använda dessa strategier har många primära och bearbetade avskrifter fastställts i växternas mitokona.
Emellertid, flera studier har rapporterat att 5 ' trifosfat av primära utskrifter var instabila, och de var lätt omvandlas till monofosfat av okänd anledning2,4,12,13. Detta problem hindrar en tydlig diskriminering av de två typerna av utskrifter genom att använda tekniker beroende på förekomst/frånvaro av 5 ' trifosfat, och tidigare ansträngningar för att systematiskt diskriminera mellan de primära och bearbetade avskrifter i växt mitokonbruen misslyckades2,12.
I detta protokoll kombinerar vi cRT-PCR, RNA 5 "polyfosfatasbehandling, RT-qPCR och Northern blot för att systematiskt särskilja de primära och bearbetade transkriptioner som stabilt ackumuleras i majs (Zea mays) Mitokonskernas (figur 1). cRT-PCR möjliggör samtidig kartläggning av 5 ' och 3 ' extremiteter av en RNA-molekyl, och den är oftast anpassad för att kartlägga avskrift Termini i växterna2,12,14,15. RNA 5 ' polyfosfatas kan ta bort två fosfater från trifosfated 5 ' Termini, vilket gör de primära avskrifter tillgängliga för själv-ligering av RNA Ligase. Tidigare studier visade att mogna 26S rRNA i majs hade bearbetat 5 ' Terminus, och det var okänsligt för RNA 5 ' polyfosfatas1,16. För att minimera påverkan av instabila trifosfat vid primär 5 ' Termini, den 5 ' polyfosfatas-behandlade och icke-behandlade RNAs normaliseras av mogna 26S rRNA, och de primära och bearbetade utskrifter differentieras sedan genom att jämföra cRT-PCR-produkter som erhålls från de två RNA-proverna. CRT-PCR kartläggning och diskriminering resultat verifieras av Northern blot och RT-qPCR, respektive. Slutligen används alternativa primers för att förstärka de avskrifter som upptäckts i norra blot men inte av cRT-PCR. Genom att använda denna cRT-PCR-baserade strategi har de flesta steady-state-avskrifter i mitokonskbaserad majs differentierats och kartlagts1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

I växternas mitokondrier har vissa steady-state-avskrifter 5 ' trifosfat som härrör från initiering av transkription (primära transkriptioner), medan de andra innehåller 5 ' monofosfat genererade post-transkriptionellt (bearbetade utskrifter). Att diskriminera mellan de två typerna av utskrifter, flera strategier har utvecklats, och de flesta av dem är beroende av närvaro/frånvaro av 5 ' trifosfat. Trifosfat i primär 5 ' Termini är dock instabilt, och det hindrar en tydlig diskriminering av de två typerna av utskrifter. För att systematiskt differentiera och kartlägga de primära och bearbetade transkriptioner stabilt ackumulerade i majs mitokonskernas, har vi utvecklat en cirkulär RT-PCR (cRT-PCR)-baserad strategi genom att kombinera cRT-PCR, RNA 5 "polyphoshpatase behandling, kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) och Northern blot. Som en förbättring, inkluderar denna strategi ett RNA normaliserings steg för att minimera påverkan av instabil 5 ' trifosfat.
I detta protokoll är det berikade mitokondriella RNA förbehandlat med RNA 5 ' polyfosfatas, som omvandlar 5 ' triphsophate till monofosfat. Efter circularization och omvänd Transkription, de två cDNAs som härrör från 5 ' polyfosfatas-behandlade och icke-behandlade RNAs normaliseras av majs 26S mogna rRNA, som har en bearbetad 5 ' och är okänslig för 5 ' polyfosfatas. Efter normalisering diskrimineras de primära och bearbetade transkripterna genom att jämföra cRT-PCR-och RT-qPCR-produkter som erhålls från den behandlade och icke-behandlade RNAs. Avskriften Termini bestäms genom kloning och sekvensering av cRT-PCR-produkterna och verifieras sedan av Northern blot.
Genom att använda denna strategi har de flesta steady-state avskrifter i majs mitokon På grund av den komplicerade avskrift mönstret av vissa mitokondriella gener, några steady-state avskrifter inte differentieras och/eller kartläggas, även om de upptäcktes i en nordlig blot. Vi är inte säkra på om denna strategi är lämplig att diskriminera och kartlägga steady-state-avskrifter i andra växters mitokona eller i plastids.

Uppskattning av mitokondriell RNA circularization effektivitet
I en tidigare studie, både totala och mitokondriella RNAs användes för cRT-PCR-mappning av mitokondriell avskrift Termini i Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), och de två typerna av rnas gav liknande kartläggning resultat12. Initialt använde vi också total RNAs för cRT-PCR-mappning av mitokondriell av...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskriminering och kartläggning av de primära och bearbetade Transkripterna i Mitokonskbaserade majs med hjälp av en cirkulär RT-PCR-baserad strategi

Vi presenterar en cirkulär RT-PCR-baserad strategi genom att kombinera cirkulär RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ' polyfosfatasbehandling, och Northern blot. Detta protokoll innehåller ett normaliserings steg för att minimera påverkan av instabil 5 ' trifosfat, och det är lämpligt för att diskriminera och kartlägga de primära och bearbetade transkriptioner stabilt ackumulerade i majs mitokondrier.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Detta protokoll används för kartläggning och diskriminering av de primära och bearbetade avskrifter i majs mitokondrier. Denna teknik inkluderar en RNA normalisering steg och det minimera påverkan av instabila fem främsta tripfosfat som hindrar en tydlig diskriminering mellan den primära och de bearbetade avskrifter. Förutom majsmitokondrierna skulle denna metod kunna tillämpas på plastider och andra växtmitokondrier.Börja med att samla 20 gram av att utveckla kärnor till ett 50 milliliter rör på is. Överför kärnorna till en färdigkyld murbruk och tillsätt 10 till 20 milliliter iskall extraktionsbuffert. Slipa kärnorna helt, tillsätt mer extraktionsbuffert och filtrera markvävnaden genom två lager av filterduk.Centrifugera filtratet vid 8, 000 gånger G i 10 minuter. Överför sedan supernatanten till ett nytt rör och kassera filtratet. Centrifugera röret vid 20, 000 gånger G i 10 minuter.Häll av supernatanten och dra upp pelleten på ny typ i sex milliliter tvättbuffert. Aliquot suspensionen i fem 1,5 milliliter RNase-fria rör och centrifug dem på 14, 000 gånger G i fem minuter. Kassera supernatanten och frys den mitokondriella pelleten i flytande kväve.Extrahera mitokondriellt RNA med hjälp av kommersiella reagens enligt tillverkarens anvisningar och inrätta en RNA fem prime polyfosfaas behandling. Sedan, återvinna RNA med en RNA reningssats. Reagensen som används för RNA-extraktion är farligt.Arbeta alltid med den i en draghuva och använd alltid labbrock och handskar. Förbered två cirkuläriseringsreaktioner med hjälp av samma mängder av fem främsta polyfosfatasbehandlade och icke-behandlade mitokondriella RNA-rna. Inkubera båda reaktionerna vid 16 grader celsius i 12 till 16 timmar och sedan återvinna självligerade RNA:s med en tidigare använd RNA-reningssats.Börja med att förbereda en primerblandning med ett lika stort förhållande på 26 SCRT och upp till sju andra omvända transkriptionsprimrar. Montera två omvända transkriptionsreaktionssystem enligt manuskriptriktningarna och inkubera dem i 42 grader celsius i 50 minuter. För att normalisera cDNA, förbereda två PCR reaktioner med samma volym cDNA: s från de fem främsta polyfosfatasbehandlade eller icke-behandlade RNA: s och köra reaktionen under termocykling villkor som beskrivs i manuskriptet.Normalisering med 26S mogna rRNA är ett viktigt steg för att diskriminera mellan den primära och de bearbetade avskrifter. Jämför överflödet av de två PCR-produkter och om det behövs, optimera normaliseringen genom att justera mängderna av mall cDNA's. Förbered par pcr reaktioner med lämpliga volymer av normaliserade cDNA: s och ett par avvikande primers som i de fem främsta till tre främsta korsningen av målet avskrifter och utföra PCR enligt manuskriptet riktningar.Använd sedan en gel DNA recovery kit för att isolera de framstående band som förstärks av kapslade PCR. Klona gelen renat PCR-produkter till en vektor med hjälp av standardtekniker och utföra koloni PCR för att välja positiva kloner som innehåller målinsatserna. Sekvens PCR-produkterna och anpassa sekvenseringsdata med majsens mitokondriella genom med hjälp av det grundläggande lokala inriktningssökverktyget eller BLAST.Välj organismen majs och sök databas nukleotid samling. Hitta de fem främsta till tre främsta korsningen av den cirkulära avskriften och bestämma positionerna för de fem främsta och tre främsta avskrift termini. Förstärka DNA-fragmentet som används för att förbereda RNA-sonden och klona det till den tidigare använda vektorn som innehåller en T7-promotor, 17 baspar uppströms av insättningsstället.Märk RNA-sonderna med dig-11-UTP och utför RNA-hybridisering med hjälp av kommersiella kit. Diskriminera de primära och bearbetade fem prime-ändarna genom att jämföra de cirkulära RT-PCR-produkterna som erhålls från de normaliserade fem prime polyfosfatasbehandlade och icke-behandlade RNA:rna. Sedan utformar kvantitativa RT-PCR-primers baserat på kartläggningsresultaten och verifierar diskrimineringsresultaten med RT-PCR.COX-2 genen användes som ett exempel för att visa kartläggning och diskriminering av majs mitokondriellt avskrifter med cirkulär RT-PCR baserad strategi. De normaliserade cDNA:erna användes som mallar för PCR, vilket resulterade i två framträdande band som förstärktes från de fem främsta polyfosfatasbehandlade provet. De två banden fick namnet COX-2 en och två återhämtat sig från gelen och klonade till vektorer.Colony PCR resultat visade att de positiva klonerna innehåller skär med variabel storlek vilket innebär att termini har heterogena fem prime eller tre prime termini. Sekvenseringsresultaten visade att COX-2 en och två har samma tre främsta ändar vid 39 nukleotider nedströms av stop-kodon medan deras fem främsta termini ligger på 992 till 1, 030 och 1, 276 till 1, 283 nukleotider uppströms start-kodon, respektive. RNA gel blot hybridisering utfördes för att verifiera den cirkulära RT-PCR kartläggning resultat och två stora band med storlekar som liknar COX-2 en och två upptäcktes.Ett annat par avvikande primers var utformade för att förstärka COX-2 tre och fyra band upptäcks med RNA gel blot men inte med första gången cirkulär RT-PCR. De kvantitativa RT-PCR resultaten bekräftade att COX-2 en, två, tre och fyra var känsliga för fem främsta polyphosphatase och att de hade primära fem prime termini. Primer-tilläggsanalys kunde utföras för att verifiera de fem främsta mappningsresultaten även om det inte ingår i det här protokollet.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartläggning och CRISPR / Cas9 redigering för att identifiera en läkemedelsresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mappning av Genome-wide tillgängliga kromatin i primära humana T-lymfocyter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Anpassa 3' slutar snabb förstärkning av CDNA för att mappa avskrifter i Cancer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Med hjälp av Ustilago maydis som en trojansk häst för i Situ leverans av majs proteiner

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karaktärisera Histon posttranslationella modifieringen förändringar i jäst neurodegenerativa Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...