Name: discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 31600250, y), bilim ve teknoloji projeleri Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) ve Çin tarımsal araştırma sistemi (Grant Hayır tarafından desteklenmektedir. ARABALAR-04-PS09, H.N.).

1. Primer tasarım
<ol><li>Astar tasarım17genel kurallarına dayalı PCR primer tasarım yazılımı (malzeme tablosu) kullanarak ters TRANSKRIPSIYON (RT) için gen-özel astar tasarımı. Not: RT astarlar hedef transkriptler için son derece özeldir, ve genellikle 5 ' (olgun mrnas ve habercisi Rnas), ya da ~ 500 – 600 NT beklenen 5 ' End (18s ve 26S rrnas) kodlama dizileri bir parçası üzerinde demirlemiş.</li>
	<li>CRT-PCR tarafından döngüsel tran...

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5&#39;-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize.">Major contribution of transcription initiation to 5&#39;-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li><li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants.">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li><li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria.">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li><li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis.">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li><li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5'+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana.">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li><li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana.">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li><li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase.">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li><li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions,+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units.">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li><li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features.">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li><li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis.">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li><li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene.">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li><li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana:+t-elements+contribute+to+5'+and+3'+end+formation.">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li><li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+5'+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs.">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li><li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing.">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li><li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing.">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li><li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5'-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing.">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li><li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes.">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li><li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity.">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li><li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis.">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes &amp; Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li><li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+RNA+metabolism.">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li></ol>

Önceki bir çalışmada, Arabidopsis hücre süspansiyon kültüründen toplam ve mitokondrial Rnas CRT-PCR tarafından mitokondriyal transkript Termini harita için kullanılan ve benzer sonuçlar elde edildi12. Ancak, mitokondriyal transkript Termini 'nin diğer birçok çalışmada1,2,3,9eşleminde sadece zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA kullanılmışt...

Bitki mitokondri, birçok olgun ve habercisi Rnas birden fazla isoformlar olarak birikir ve sabit devlet transkriptler onların 5 ' uçları1,2,3farkı dayalı iki gruba bölünebilir, 4' ü yapın. Primer transkriptlerin 5 ' trifosfat sonu vardır, bu da transkripsiyon başlamasında elde edilir. Buna karşılık, işlenmiş transkriptler Post-transcriptional işleme tarafından oluşturulan 5 ' monofosfat var. İki tür transkripti ayrımcılık ve haritalama, arka plandaki moleküler mekanizmaların ortaya çıkarmak için önemlidir.
Plant mitochondrion 'daki primer ve işlenmiş transkriptler arasında ayrım yapmak için dört büyük strateji geliştirilmiştir. İlk strateji mitokondriyal RNAs 'ı tütün asidi pirofosfataz (TAP) ile ön tedavi etmektir, bu da 5 ' trifosfat 'i monofosoza dönüştüren ve primer transkriptlerin RNA ligaz ile devre altında olmasını sağlar. Musluk tedavisi ve tedavi edilmeyen RNA örneklerinin transkript fazlalıkları daha sonra cDNA bitleri (yarış) veya dairesel RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4hızlı amplifikasyon ile karşılaştırılır. İkinci stratejide, işlenen transkriptler öncelikle Terminator 5 '-fosfat bağımlı eksonükleaz (Tex) kullanarak mitokondriyal Rnas 'dan tükeniyor ve sol primer transkriptler daha sonra primer uzatma Analizi5,6 ile eşleştirilir . Üçüncü strateji Guanil transferase kullanarak birincil transkriptler ön Cap için, ve daha sonra trifosfatla 5 ' Termini konumu ile birlikte ribonükleaz veya S1 nükleaz koruma analizi ile primer uzatma tarafından belirlenir7,8 ,9. 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlı olandan farklı, dördüncü strateji içinde vitro transkripsiyon birleştirir, site-yönlendirilmiş mutagenesis, ve primer uzatma Analizi sözde Rehberleri karakterize ve transkripsiyon belirlemek başlatma siteleri8,10,11. Bu stratejileri kullanarak, bitki mitokondri içinde birçok primer ve işlenmiş transkriptler belirlendi.
Ancak, birkaç çalışmada birincil transkriptlerin 5 ' trifosfat kararsız olduğunu bildirdi ve kolayca bilinmeyen nedeni2,4,12,13için monofosfat dönüştürülmüştür. Bu sorun, 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlı teknikleri kullanarak transkriptler iki tür net bir ayrımcılık engeller ve önceki çabaları sistematik olarak bitki primer ve işlenmiş transkriptler arasında ayrımcılık için Mitochondri2,12başarısız oldu.
Bu protokolde, cRT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase tedavisi, RT-qPCR ve Kuzey leke 'ı, Mısır (Zea mays) mitokondrion (Şekil 1) ' de stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek için birleştiriyoruz. cRT-PCR RNA molekülü 5 ' ve 3 ' ekstremite eşzamanlı haritalama sağlar ve genellikle bitkiler2,12,14,15harita transkript Termini adapte edilir. RNA 5 ' polyphosphataz, trifosfatlar 5 ' Termini 'den iki fosfatı kaldırabilir ve bu da birincil transkriptlerin RNA ligaz tarafından Self-ligasyon için kullanılabilir olmasını sağlar. Önceki çalışmalar, Mısır 'da olgun 26S rRNA 5 ' Terminus işlenmiş olduğunu gösterdi ve RNA 5 ' polyphosphatase1,16duyarsız oldu. Primer 5 ' Termini 'de kararsız trifosfat etkisini en aza indirmek için, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs olgun 26S rRNA tarafından normalleştirilmiş, ve birincil ve işlenmiş transkriptler daha sonra karşılaştırarak farklılaşmış iki RNA örneğinden elde edilen cRT-PCR ürünleri. CRT-PCR haritalama ve ayrımcılık sonuçları Kuzey leke ve RT-qPCR tarafından sırasıyla doğrulanır. Son olarak, alternatif astar Kuzey leke ancak cRT-PCR tarafından algılanan Bu transkriptler yükseltmek için kullanılır. Bu cRT-PCR tabanlı stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondri en kararlı durum transkriptler ayırt edilmiş ve1eşleştirilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>A112880</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>4359659</td>
			<td>Thermal cycler for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900134</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowest Agarose</td>
			<td>Biowest, Spain</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td>To resolve PCR products and RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>A1933</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>B8026</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900882</td>
			<td>Deactivation of RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG Northern starter kit</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>12039672910</td>
			<td>For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900106</td>
			<td>For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>E3889</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation system</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>To image the agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoldView II (5000x)</td>
			<td>Solarbio,. China</td>
			<td>G8142</td>
			<td>DNA staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-N+, Nylon membrane</td>
			<td>Amersham Biosciences, USA</td>
			<td>RPN119</td>
			<td>For Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>Image Lab 3.0</td>
			<td>Image gel, and compare the abundance of PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900041</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>P112284</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900399</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex</td>
			<td>Millipore, USA</td>
			<td>SLHP033RB</td>
			<td>To sterile extraction and wash buffers by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, USA</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td>To filter the ground kernel tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900306</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>2000C</td>
			<td>For RNA concentration and purity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900797</td>
			<td>For preparation of wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt simple cloning vector</td>
			<td>TransGen Biotech, China</td>
			<td>CB111</td>
			<td>Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>P505</td>
			<td>DNA polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone 40</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900008</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>PREMIER Biosoft, USA</td>
			<td>Primer Premier 6.24</td>
			<td>To design primers for reverse transcription and PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript II reverse transcriptase</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>2690</td>
			<td>To synthesize the first strand cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12183025</td>
			<td>For RNA purificaion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; polyphosphatase</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>RP8092H</td>
			<td>To convert 5&#39; triphosphate to monophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0314</td>
			<td>A component of RNA self-ligation and 5&#39; polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900212</td>
			<td>For preparation of running buffer for Northern blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>V900058</td>
			<td>To prepare 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFas evaGreen supermixes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>1725202</td>
			<td>For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1</td>
			<td>New England Biolabs, UK</td>
			<td>M0437</td>
			<td>For RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>221368</td>
			<td>For preparation of extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIANgel midi purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP209</td>
			<td>To purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Aladdin, China</td>
			<td>T110601</td>
			<td>To prepare 1x TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15596026</td>
			<td>To extract mitochondiral RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal DNA purification kit</td>
			<td>Tiangen Biotech, China</td>
			<td>DP214</td>
			<td>To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol FF</td>
			<td>Sigma-aldrich, USA</td>
			<td>X4126</td>
			<td>For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimintion and mapping of the primary and processed transcripts in maize mitochondrion using a circular rt-pcr-based strategy

Bitki mitokondri içinde, bazı sabit-devlet transkriptler 5 ' trifosfat transkripsiyon başlatma (primer transkript) türetilmiştir, diğerleri içeren ise 5 ' monofosfat Post-transcrip, oluşturulan (işlenmiş transkriptler). İki tür transkripti arasında ayrımcılık yapmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir ve çoğu 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlıdır. Ancak, primer 5 ' Termini 'de trifosfat kararsız, ve iki tür transkriptlerin net bir ayrımcılığı engelliyor. Mısır mitochondrion 'da stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek ve eşlemek için, CRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase tedavisi, nicel RT-PCR (RT-qPCR) ve Kuzey Blot. Bir gelişme olarak, bu strateji dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir RNA normalleştirme adımı içerir.
Bu protokolde, zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA RNA 5 ' poliphosphataz tarafından önceden tedavi edilir, bu da 5 ' triphsophate 'yi monofosfata dönüştürür. Devre sonrası ve ters transkripsiyondan sonra, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen Rnas 'dan türetilen iki cdnas, işlenmiş 5 ' uçtan ve 5 ' polyphosphataz 'a duyarsız olan, Mısır 26S olgun rRNA tarafından normalleştirilmiştir. Normalleştirme işleminden sonra, tedavi edilen ve işlenmeyen RNAs 'dan elde edilen cRT-PCR ve RT-qPCR ürünlerini karşılaştırarak birincil ve işlenen transkriptler ayrımcılık yapmaktadır. Transkripti Termini, cRT-PCR ürünlerinin klonlanması ve sıralanması ile belirlenir ve daha sonra Kuzey Blot tarafından doğrulanır.
Bu stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondrion 'daki en kararlı durum transkriptleri belirlenmiştir. Bazı mitokondriyal genlerin karmaşık transkripti deseni nedeniyle, birkaç sabit devlet transkriptleri farklılaşmadı ve/veya eşleştirilmedi, ancak Kuzey Blot 'da tespit edildi. Biz bu stratejinin ayrımcılık ve diğer bitki mitokondri veya plastids sabit devlet transkriptler harita uygun olup olmadığından emin değiliz.

Mitokondriyal RNA döngülerleştirme verimliliğinin tahmini
Önceki bir çalışmada, Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) mitokondriyal transkript termını cRT-PCR haritalama için toplam ve mitokondriyal RNAs kullanılmıştır ve Rnas iki tür benzer haritalama sonuçları12verdi. Başlangıçta, aynı zamanda Mısır 'da mitokondriyal transkript Termini cRT-PCR hari...

Watch this Scientific Journal Video about Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy at JoVE.com

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

Dairesel RT-PCR, nicel RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment ve Kuzey Blot 'u birleştirerek döngüsel bir RT-PCR tabanlı strateji sunuyoruz. Bu protokol dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir normalleştirme adım içerir, ve ayrımcılık ve, Mısır mitochondrion dengeli birikmiş birincil ve işlenmiş transkriptler haritalama için uygundur.

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Bu protokol, mısır mitokondrisinde birincil ve işlenmiş transkriptlerin haritalandırılması ve ayrımcılığı için kullanılır. Bu teknik bir RNA normalleştirme adımı içerir ve birincil ve işlenmiş transkriptler arasında net bir ayrımcılık engelleyen kararsız beş prime trifosfat etkisini en aza indirir. Mısır mitokondrisi yanı sıra, bu yöntem plastidler ve diğer bitki mitokondri uygulanabilir.Buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüp içine gelişmekte olan çekirdekleri 20 gram toplayarak başlayın. Çekirdekleri önceden soğutulmuş bir harçiçin aktarın ve 10 ila 20 mililitre buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu ekleyin. Çekirdekleri tamamen öğütün, daha fazla ekstraksiyon tamponu ekleyin ve zemin dokusunu iki filtre bezi katmanı üzerinden filtreleyin.10 dakika boyunca 8,000 kez G'de filtrasyon santrifüj edin. Sonra yeni bir tüp için supernatant aktarın ve filtrat atın. Tüpü 20,000 kez G'de 10 dakika santrifüj edin.Supernatant dökün ve yıkama tampon altı mililitre pelet yeniden askıya alın. Aliquot beş 1.5 mililitre RNase-free tüpler içine süspansiyon ve santrifüj onları santrifüj 14, 000 kez G beş dakika. Supernatant atın ve sıvı azot içinde mitokondriyal pelet dondurun.Üreticinin talimatlarına göre ticari reaktifler kullanarak mitokondriyal RNA ayıklayın ve bir RNA beş ana polifosfataz tedavi kurmak. Ardından, RNA'yı bir RNA temizleme kiti ile kurtarın. RNA ekstraksiyonu için kullanılan reaktif tehlikelidir.Her zaman bir duman başlık onunla çalışmak ve her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek. Beş prime polifosfataz tedavi ve tedavi edilmeyen mitokondriyal RNA aynı miktarda kullanarak iki daireselleştirme reaksiyonları hazırlayın. Her iki reaksiyonu da 16 derecede 12 ila 16 saat kuluçkaya yatırın ve daha önce kullanılmış bir RNA arıtma kiti ile kendi kendine bağlanan RNA'ları geri getirin.26 SCRT ve yedi diğer ters transkripsiyon astarı eşit oranda bir astar karışımı hazırlayarak başlayın. El yazması talimatlara göre iki ters transkripsiyon reaksiyon sistemi bir araya getirin ve 50 dakika boyunca 42 derecede kuluçkaya yatırın. CDNA'yı normalleştirmek için, işlenmiş veya tedavi edilmeyen rna'lardan aynı cDNA hacmine sahip iki PCR reaksiyonu hazırlayın ve el yazmasında açıklanan termobisiklet koşullarında reaksiyonuyguluyoruz.26S olgun rRNA ile normalleştirme birincil ve işlenmiş transkriptarasında ayrım yapmak için önemli bir adımdır. İki PCR ürününün bolluğunu karşılaştırın ve gerekirse şablon cDNA'ların miktarlarını ayarlayarak normalleştirmeyi optimize edin. Uygun hacimlerde normalleştirilmiş cDNA ve hedef transkriptlerin beş asal ile üç asal kavşaktaki gibi bir çift farklı astarla PCR reaksiyonları çiftleri hazırlayın ve el yazması yönlere göre PCR gerçekleştirin.Daha sonra, iç içe PCR tarafından güçlendirilmiş belirgin bantları izole etmek için bir jel DNA kurtarma kiti kullanın. Standart teknikler kullanarak jel saflaştırılmış PCR ürünlerini bir vektöre klonlamak ve hedef ekler içeren pozitif klonlar seçmek için koloni PCR gerçekleştirmek. PCR ürünlerini sırala ve sıralama verilerini temel yerel hizalama arama aracını veya BLAST'ı kullanarak mısır mitokondriyal genomu ile hizala.Organizma mısır ve arama veritabanı nükleotit toplama seçin. Dairesel transkriptin beş asal ile üç asal bağlantısını bulun ve beş asal ve üç asal transkript termini'nin konumlarını belirleyin. RNA sondasını hazırlamak için kullanılan DNA parçasını yükseltin ve daha önce kullanılan vektöre kopyalayın, bu vektörde bir T7 organizatörü, ekleme alanının yukarısında 17 baz çifti bulunur.RNA problarını dig-11-UTP ile etiketlendirin ve ticari kitleri kullanarak RNA hibridizasyonunu gerçekleştirin. Normalleştirilmiş beş asal polifosfataz tedavi edilmiş ve tedavi edilmeyen RNA'lardan elde edilen dairesel RT-PCR ürünlerini karşılaştırarak birincil ve işlenmiş beş asal uçları ayırın. Ardından, haritalama sonuçlarına göre nicel RT-PCR astarları tasarlayın ve ayrımcılık sonuçlarını RT-PCR ile doğrulayın.COX-2 geni, sirküler-PCR tabanlı strateji ile mısır mitokondriyal transkriptlerinin haritalandırılması ve ayrımcılığını göstermek için örnek olarak kullanılmıştır. Normalleştirilmiş cDNA'lar PCR için şablon olarak kullanıldı ve bu da beş ana polifosfataz tedavi örneğinden iki belirgin bantın güçlendirilmesiyle sonuçlandı. İki grup COX-2 bir ve iki jel kurtarıldı ve vektörler halinde klonlanmış seçildi.Colony PCR sonuçları pozitif klonların değişken boyutuna sahip ekler içerdiğini gösterdi ve bu da termini'nin heterojen beş asal veya üç asal termini olduğunu ima etti. Sıralama sonuçları, COX-2 bir ve ikisinin dur kodonun 39 nükleotitinde aynı üç asal uça sahip olduğunu, beş prime termini'nin ise sırasıyla start codon'un yukarı sında 992'ye 1, 030 ve 1, 276'ya 1, 283 nükleotitte bulunduğunu göstermiştir. Dairesel RT-PCR haritalama sonuçlarını doğrulamak için RNA jel leke hibridizasyonu yapıldı ve COX-2 bir ve iki'ye benzer boyutlarda iki ana bant tespit edildi.Farklı astarlar başka bir çift COX-2 üç ve dört bantları RNA jel leke ile tespit yükseltmek için tasarlanmıştır ama ilk kez dairesel RT-PCR ile değil. Kantitatif RT-PCR sonuçları COX-2 bir, iki, üç ve dört beş prime polifosfataz duyarlı olduğunu ve birincil beş prime termini olduğunu doğruladı. Bu protokole dahil edilmese de, beş asal eşleme sonuçlarını doğrulamak için astar uzantısı çözümlemesi yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...