Name: design, synthesis, and photochemical properties of clickable caged compounds
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds at JoVE.com

وكان هذا العمل مدعوما من قبل JSPS KAKENHI منحه رقم JP16H01282 (TF) ، ومنحه في المعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكره "دينامية الذاكرة" ، و JP19H05778 (TF) ، "MolMovies".

ليس لدينا ما نكشف عنه

وضعنا سابقا bhc المركبات قفص من مختلف الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تظهر كفاءه عاليه الضوئية28،45،46،47. وبهدف توسيع نطاق مرجع مجموعات bhc ، أبلغنا أيضا عن منصات للمركبات الحبيسة المعيارية التي يمكن تعديلها بسهوله عنطريق إدخال وحدات وظيفيةمختلفه 32 ،40،41. ولذلك فان هذا البروتوكول يمثل طريقه لتوليف سلائف قابله للنقر عليها من مجموعات Bhc التي يمكن تعديلها عن طريق النحاس (I)-الذي يحفز الخلايا الخلوية. وقد تحقق توليف السلائف القابلة للنقر ، باباتش2آوه (2) ، عن طريق تسلسل رد فعل من أربع خطوات بدءا من المتاحة تجاريا 4-بروموريسورسينول (الشكل 1a). وميزه هذا البروتوكول هي انه لا يلزم اتخاذ خطوات تنقيه مضنيه (مثل فصل الفواصل اللونية للعمود).
كما السلائف القابلة للنقر باباتش2آوه (2) يمكن استخدامها لإخفاء المجموعات الوظيفية المختلفة ، المركبات قفص قابل للنقر من الأمينات والكحول ، وتم توليفها الأحماض الكربوكسيليه باستخدام 2 كما السلائف (الشكل 1b). تم تعديل الأمينات كما بكارباميت في حين تم تعديل الكحول والكربونات الخاصة بهم. في الإجراءات العامة 1 و 2 ، تم استخدام CDI لاعداد carbamates القابلة للنقر ، في حين تم استخدام 4-نيتروف# ينيل كلوروفورماتي لاعداد الكربونات. كما هو مبين من قبل اليه رد الفعل ، يمكن استخدام كل من الكواشف لاعداد كارباماتيس والكربونات. وتجدر الاشاره أيضا إلى ان الغلة من المجمع قفص المطلوب يعتمد علي التركيب الكيميائي لجزيء ان يكون في قفص. ويمكن النظر إلى أمثله أخرى في تقاريرنا السابقة28،30،33،48.
انقر فوق التعديل ثم أجريت باستخدام تعديل طفيف للاجراء المبلغ عنه49. أضافه تريس (تريرازيلميثيل) المستندة إلى أمين يغاندس ضروري للحصول علي المنتجات المطلوبة في جيده لغلات عاليه. منذ مجموعه متنوعة من أزيد متاحه بسهوله علي حد سواء من المصادر التجارية ومن الإجراءات الادبيه ، يمكننا اعداد مختلف المركبات قفص وحدات مع خصائص اضافيه مثل الذوبان في الماء والقدرة علي استهداف الخلوية (الشكل 2).
ثم قيس المحصول الكمي من التحلل الضوئي وفقا للاجراء المبلغ عنه28،50. ويبين الشكل 3 ان استهلاك الصور الضوئية من 2 غاربار--Glc-بابهموك-ptx والإفراج عن ptx كانت تقريبيه الاضمحلال الاسي واحد وارتفاع ، علي التوالي ، مما يوحي بعدم وجود تصفيه داخلية للإشعاع أو الآثار الثانوية غير المرغوب فيها. لوحظ تحسن في غله الكم الكمي (φ) وكفاءه التحلل الضوئي (εφ) لمركبات باباتش القابلة للنقر بالمقارنة مع مركبات bhc المحبوسةسابقا (الجدول 1)41، 43. وبما ان كفاءه التحلل الضوئي (εφ) من مركبات bhc في قفص هي أكثر من 100 مره اعلي من تلك المركبات 2-نيتروالبنزيل-نوع قفص48، والتحسن الملحوظ بسبب وجود مجموعات الشيخوخة باباتش بشكل واضح ميزه لهذا النظام.
كتجربة إثبات المفهوم ، أدخلت شارده المائية إلى 2 غاربار-بابهموك-ptx (4) والخلوية استهداف يجند أدخلت إلى مجمع 3 (الشكل 2). وكان ذوبان الماء من 2 غاربار--glc-بابهموك-PTX 650 مرات اعلي من ذلك من PTX الأصل (الجدول 1). وتم تحقيق الاستهداف الخلوي الانتقائي باستخدام نظام التحقق من العلامات ، وكانت بابهموك-عرافه-FITC/Halo (8) التي تحمل الجهاز halotag واستهدفت بنجاح إلى غشاء الخلية من خلايا الثدييات مثقف التعبير عن البروتين الانصهار halotag/egfr ( الشكل 4). كما تم التوصل إلى تحوير الصورة الخلوية للكيناز باستخدام المركب المحبوس القابل للنقر 5 (الشكل 5).
في الختام ، نجحنا في إثبات طريقه لاعداد منصات قابله للنقر للمركبات الصورة في قفص من جزيئات مثيره للاهتمام بيولوجيا التي يمكن تعديلها بسهوله مع خصائص اضافيه ، مثل الذوبان في الماء والخلوية استهداف القدرة. وبما انه يمكن استخدام مجموعه "باباتش" لاعداد اي جزيئات ذات مجموعات وظيفية قابله للتعديل ، فان تطبيق هذا البروتوكول لا يقتصر علي الجزيئات الموصوفة هنا. باستخدام منصة وحدات ، وهي مجموعه باباتش الشيخوخة ، ويمكن اعداد المركبات قفص المطلوب بسهوله ، ويمكن التضمين خصائصها الفيزيائية والكيميائية عن طريق تعديل النقر.

تم تصميم المركبات قفص الجزيئات الاصطناعية التي الوظائف الاصليه هي ملثمين وقتيا بواسطة المرفقة تساهميا الصور القابلة للازاله حماية المجموعات. ومن المثير للاهتمام ، والمركبات قفص من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا توفر وسيله لا غني عنها للسيطرة المكانية من فسيولوجيا الخلوية1،2،3،4،5 ،6. في 1977 ، ذكر انجلس و Schlaeger استر 2-نيتروالبنزيل من كامب كغشاء نفاذيه ومشتق photolabile من كامب7. في العام التالي ، وذكرت كابلان 1-(2-نيتروف# ينيل) استر ايثيل من ATP (NPE-ATP) وسميت هذا المركب "قفص" ATP8. ومنذ ذلك الحين ، مجموعه من المجموعات الكيميائية القابلة للازاله الضوئية مثل 2-نيتروبنزيلز ، ف-هيدروكسي فيناثلس9، 2-(2-نيتروففنين) اثيلس10،11، 7-نيتروينولين-1-ايلس 12، 13، و (coumarin-4-yl) ميثليس14،15،16 وقد استخدمت لاعداد المركبات قفص.
ومن المتوقع ان يؤدي تركيب المركبات الحبيسة ذات الخصائص الاضافيه المستصوبه مثل نفاذيه الغشاء ، والذوبان في الماء ، وقدره الاستهداف الخلوي إلى تيسير التطبيقات البيولوجية للخلايا. وبما ان الخواص الفيزيائية والكيميائية لهذه الجزيئات تعتمد في المقام الأول علي التركيب الكيميائي لمجموعات الحماية القابلة للازاله الضوئية المستخدمة في اعدادها ، فانه يلزم وجود ذخيرة متنوعة من مجموعات الصور. ومع ذلك ، فان التنوع الهيكلي للمجموعات المتاحة حاليا التي تظهر كفاءه عاليه في التحلل الضوئي محدود. وقد يشكل ذلك عقبه امام زيادة استخدام المركبات الحبيسة.
ولمعالجه هذه المسالة ، تم توسيع ذخيرة مجموعات الصور الفوتوغرافية بواسطة التعديل الكيميائي لمجموعات الحماية القابلة للازاله الضوئية الموجودة أو تصميم الكروم الضوئية الجديدة ذات الخواص الفوتوفيسيكاله الفائقة والكيميائية الضوئية. ومن الامثله علي ذلك نيتروديبنيوبورون (ndbf)17، [3-(4 ، 5-dimethoxy-2-نيتروفيف# ينيل) -2 بوتيل] (دمنبب)18،19، والكالسيوم حساسة 2-نيتروالبنزيل الضوئية20، المستبدلة الكومارينيلميثيل (DEAC45021 , Deadccm22, 7-azetidinyl-4-ميثيلكومارين23, و styryl كومارينس24), مشتقات كستنائي (كستنائي-pan)25, ومشتقات bodipy26,27.
الاضافه إلى ذلك ، قمنا مسبقا بتطوير (6-برومو-7-هيدروكسي كومارين-4-yl) مجموعه الميثيل (bhc) وتوليفها بنجاح مختلف المركبات قفص من الناقلات العصبية28، الرسل الثاني29،30، و [اوليغكليوكليدس]31,32,33 يبدي كبيره واحده-و [2-فوتون] أثاره [كروس-لدس]. إذا كان يمكن تثبيت خصائص اضافيه بسهوله في المجموعات حبس دون المساس بحساسيتها للضوء ، ثم مرجع المركبات قفص يمكن توسيع34،35،36، 37،38،39. ولذلك فقد صممنا مركبات حبيسه مكونه من ثلاثه أجزاء ، وهي مجموعه Bhc كنواه مستجيبة للصور ، ومقابض كيميائية لتركيب وظائف اضافيه ، والجزيئات التي سيتم إخفاؤها40، 41.
وهكذا ، توفر هذه المادة طريقه عمليه لاعداد المركبات في قفص من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا. يصف هذا البروتوكول طرق اعداد منصة قابله للنقر للمجموعات المصورة ، وإدخال وظائف اضافيه لتوسيع ذخيرة المركبات الحبيسة ، وقياس المواد الكيميائية الفيزيائية والضوئية خصائص ، والاستهداف الانتقائي من نوع الخلية لمركب محبوس قابل للنقر لمزيد من التطبيقات الخلوية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetonitrile, EP</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00404-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile, super dehydrated</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>010-22905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-bromoresorcinol</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>B0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-carbonyldiimidazole</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>034-10491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>07278-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9%</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>032-12511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane, dehydrated</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>11338-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Diisopropylcarbodiimide (DIPC)</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide, dehydrated -super-</td>
			<td>Kanto</td>
			<td>10380-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>054-07225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 4-Chloroacetoacetate</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>C0911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 with L-Glutamine and Phenol Red</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>087-08335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>087-01076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted fluorescent microscope IX-71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOLUTE Phase Separator, 15 mL</td>
			<td>Biotage</td>
			<td>120-1906-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>196-01252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>lipofection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>345-01804</td>
			<td>MOPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-nitrophenylchloroformate (4-NPC)</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>C1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td>reduced serum medium contains no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,10&#8208;Phenanthroline Monohydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26707-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps</td>
			<td>Rayonet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>W01SRM19-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31115-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>199-05985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid, 96-98%</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>190-04675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>762342-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tri&#8208;Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31404-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source, MAX-303</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design, synthesis, and photochemical properties of clickable caged compounds

المركبات قفص تمكين التلاعب الصورة بوساطة من فسيولوجيا الخلية مع القرار المكانية عاليه. ومع ذلك ، فان التنوع الهيكلي المحدود للمجموعات المتاحة حاليا والصعوبات في التعديلات التركيبية دون التضحية بكفاءة التحلل الضوئي هي عقبات امام توسيع ذخيرة المركبات الحبيسة للخلايا الحية التطبيقات. وبما ان التعديل الكيميائي للمجموعات المصورة من نوع الكومارين يعد نهجا واعدا لاعداد المركبات الحبيسة ذات الخواص الفيزيائية والكيميائية المتنوعة ، فاننا نقوم بالإبلاغ عن طريقه لتوليف المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي يمكن تعديلها بسهوله مع مختلف الوحدات الوظيفية عن طريق النحاس (I)-تحفيز Huisgen الخلوية. جزيء منصة وحدات يحتوي علي (6-برومو-7-هيدروكسي كومارين-4-yl) الميثيل (Bhc) مجموعه كمجموعه الصورة الشيخوخة ، الذي يسلك كفاءه عاليه التحلل الضوئي مقارنه مع تلك التقليدية 2-نيتروبنزيلز. يتم عرض الإجراءات العامة لاعداد المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي تحتوي علي الأمينات والكحوليات والكربوكسيلات. يمكن ادراج خصائص اضافيه مثل القدرة علي الذوبان في الماء واستهداف الخلايا بسهوله في المركبات الحبيسة القابلة للنقر. وعلاوة علي ذلك ، تم قياس الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية ، بما في ذلك الغلة الكمية لانحلال الضوء ، وتبين انها اعلي من تلك الموجودة في المركبات الموازية في قفص Bhc. ولذلك يمكن اعتبار البروتوكول الموصوف حلا محتملا للافتقار إلى التنوع الهيكلي في المجمعات الحبيسة المتاحة.

مركبات قفص قابل للنقر من بعض الجزيئات المثيرة للاهتمام بيولوجيا ، بما في ذلك حمض الاراشيدوريك و paclitaxel ، تم توليفها بنجاح (الشكل 1)28،41. وقدمت خصائص اضافيه مثل الذوبان في الماء والقدرة علي استهداف الخلوية في بابهموك-PTX عن طريق النحاس (I)-تحفيز Huisgen cyclization ("انقر" رد فعل) (الشكل 2). ثم تم فحص هذه PTXs القابلة للنقر في قفص لإنتاج PTXs الام عند التشعيع عند 350 نانومتر (الشكل 3) ، ويلخص الجدول 1 الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية للمركبات القابلة للنقر في القفص. غله الكم من المركبات قفص قابل للنقر 2 غاربار--glc-بابهموك-PTX (φديس 0.14) و باباتش-AA (φديس 0.083) كانت أكثر من ضعف تلك المركبات التقليدية قفص BHC 2 غاربار-bhcموك-ptx (Φديس 0.040) و Bhc-AA (Φdis 0.038)43. الاضافه إلى ذلك ، لوحظ تحسن الذوبان في الماء لمده 2 غاربار-glc-بابهموك-PTX ، الذي يحتوي علي الجلوكوز moiety.
في تجارب الخلايا الحية ، تم تحقيق استهداف باباتش-عرافه-FITC/هاله إلى خلايا الثدييات مثقف التعبير عن البروتين الانصهار من بروتين HaloTag ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) بنجاح. ولوحظ الفلورية الخضراء من فلوريسئين شارده من باباتش عرافه-fitc/هاله علي غشاء الخلية (الشكل 4). وقد تم التوصل إلى تشكيل التعريب الخلوي للكيناز باستخدام مركب باباتش في قفص. تم الإبلاغ عن النقل من γ كيناز التشكيل (DGKγ) ليتم تنشيطها في وجود حمض الاراكيدوريك (AA)44. تم التعامل مع الخلايا تشو-K1 عابره التعبير عن GFP-DGKγ مع اما AA أو باباتش-AA (5). وتسببت أضافه AA في تحوير التوطين تحت الخلوية من DGKγ (الشكل 5ا ، ب). ولوحظت تغييرات مماثله في توطين DGKγ للخلايا المعالجة باباتش-AA بعد التعرض للضوء فوق البنفسجي (الشكل 5ج ، د).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> الشكل 1: اعداد المركبات الحبيسة القابلة للنقر. (ا) الكواشف والشروط: ا. ايثيل 4-كلورواسيتالوخلات/كونك. ح2حتى4/rt/7 أيام/91 ٪ العائد ، b. 1 م HCl/الجزر/3 أيام/97 ٪ العائد. c. N-ميثيلبروبارجيليمين/Hcho/etoh ، ثم أضافه (1) والحرارة في الجزر ل 17 h/79 ٪ العائد. (ب) التوليفات من أمين قفص القابلة للنقر ، ptx ، وحمض الاراشيدوريك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> الشكل 2: تركيب الوحدات الوظيفية في المركبات الحبيسة القابلة للنقر. (ا) توليف الأقفاص القابلة للذوبان في الماء بواسطة النحاس (I)-يحفز الخلايا الخلوية. (ب) هياكل المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي تحتوي علي الاربطه الخلوية ولاستهداف الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> الشكل 3: التحلل الضوئي لغاربارين (6). عينات (10 μM) في الحل ك-MOPS (pH 7.2) كانت المشع في 350 نانومتر. (ا) اثار hplc النموذجية للتحلل الضوئي ل 6 (مقاسه عند 254 نانومتر). تم تحليل العينات في وقت التشعيع المحدد. (ب) الدورة الزمنيه لتحلل الصور من 6. الدوائر الزرقاء تظهر استهلاك 6. خط الصلبة يظهر منحني الأقل المربعات يصلح لاسي المتحللة بسيطه ل 6. تظهر المربعات الحمراء العائد من PTX. تمثل أشرطه الخطا الانحراف المعياري (± SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> الشكل 4: الصور الفلورية لخلايا الثدييات المثقفة المحتضنة مع باباتش-هيكس-FITC/Halo (8). تم احتضان الخلايا مع pcDNA3-هاله-EGFR مع محلول 2 μM من مجمع 8 في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. تم الحصول علي الصور بعد الغسيل المتكرر مع تلفزيوني +. الخلايا HEK293T المعالجة الصورية (A: صوره تباين التداخل التفاضلي (DIC) و D: صورهمضان). خلايا HEK293T (b و E) والخلايا هيلا (c و F) تعبر بصوره عابره هاله-egfr (B و C: الصور DIC و E و F: الصور الفلورية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> الشكل 5: الصور الفلورية بعد الاشعه فوق البنفسجية للخلايا تشو-K1 حضنت مع bhc في قفص الاراكيدونيك حمض. تم نقل خلايا تشو K1 مع بروتين الانصهار DGKγ-EGFP. (ا) صوره مضانه للخلايا الناقلة. (B) 100 s بعد أضافه محلول 10 μM من حمض الاراكيدوريك. (ج) تم احتضان الخلايا مع محلول 10 ΜM من باباتش-AA (5) عند 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق (د) 100 ثانيه بعد الاشعه فوق البنفسجية 20-s (330-385 نانومتر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>المركبات</td>
			<td>λماكس (nm) (ا )
</td>
			<td>εماكس (م-1 سم-1) (ب )
</td>
			<td>φديسc
</td>
			<td>د
</td>
			<td>الذوبان (μM)ه
</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0.040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-بابهموك-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0.059</td>
			<td>670</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-glc-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0.14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bhc-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0.038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>باباتش-ا</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0.083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية للمركبات المحبوسة القابلة للنقر. ا. امتصاص الحد الأقصى (نانومتر) ، b. امتصاصية المولي في λmax (م− 1 سم− 1) ، c. الغلة الكم من اختفاء مواد البداية في 350 نانومتر ، د. المنتج من امتصاصية المولي والغلة الكم من الاختفاء في 350 نانومتر ، ه. تركيز المحلول المشبع في K-MOPS (pH 7.2) (ميكروغرام mL− 1).

Watch this Scientific Journal Video about Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds at JoVE.com

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

يتم تقديم بروتوكول لتوليف وقياس الخواص الكيميائية الضوئية للمركبات الحبيسة المعيارية مع الجماليات القابلة للنقر.

التصميم والتوليف والخصائص الكيميائية الضوئية لمركبات القفص القابلة للنقر

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو توفير طريقة عملية لإعداد المركبات الضوئية ذات الخصائص الإضافية مثل ذوبان الماء أو القدرة على استهداف الخلايا. باستخدام إجراء تركيبي بسيط، يمكن استخدام هذه التقنية لتوسيع المختبر على المركبات المحبوسة وجعل المركبات في قفص مع خصائص إضافية دون المساس بالحساسية للضوء. يمكن إجراء هذا التوليف في مختبر قياسي حيث أن مركباتنا القفصية القابلة للانقر تكون مستقرة في التشعيع الضوئي عند إذابة المذيبات العضوية غير النيوكلية مثل ثنائي كلورو الميثان أو ثنائي الوثيل سلفوكسيد.ومن خلال عملية البرهان على هذه العملية مع هيرونا ساساكي، سيكون أكينوبو سوزوكي، وهو طبيب ما بعد الدكتوراه، وهانامي أوكي، ووري واتاهيكي، طلاب غراد من المختبر. تبدأ بإضافة 709.6 ملليغرام من الميثانول paBhc و 397.6 ملليغرام من ن-carbonyldiimidazole في قارورة 30 ملليلتر مستديرة القاع. إضافة ستة ملليلتر الجافة من ثنائي كلورو الميثان إلى القارورة ويحرك الحل في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة.في نهاية الحضانة، إضافة 342.8 ملليغرام من 4-Dimethylaminopyridine و 552 ميكرولترات من ثلاثي بوتيل ستة الكاربامات سداسي الأمينية، واثارة الحل في درجة الحرارة المحيطة لمدة ثلاث ساعات إضافية. ثم استخدام المبخر الدوارة تحت فراغ لإزالة المذيبات والمواد المتطايرة الأخرى، واستخدام السيليكا هلام فلاش عمود الكروماتوغرافيا لتنقية المخلفات مباشرة. لتثبيت وحدة وظيفية في مجمع قفص قابل للنقر، حل 249 ملليغرام من النحاس اثنين من كبريتات خماسيات في 10 ملليلتر من المياه تبادل أيون لإعطاء 0.1 مول النحاس حل كبريتات.حل ثمانية ملليغرام من اثنين من رئيس paBhc وهمية paclitaxel، 7.5 ملليغرام من تريس (3-هيدروكسيبروبريالوليميل)أمين، 162.4 ملليغرام من الصوديوم-ل-الأسكوربات، و 3.1 ملليغرام من 15-chloro-3، 6، 9-trioxypentyldecyl أزيديد في مذيبات مختلطة من 2.5 ملليلتر من 0.1 عازل الفوسفات الضروس و 0.5 ملليلتر من سلفوكسيد ثنائي الفينيل. بعد ذلك، إضافة 81.2 ميكرولترات من 0.1 مول النحاس حل كبريتات إلى خليط التفاعل ويحرك الخليط في درجة الحرارة المحيطة لمدة 80 دقيقة، ورصد تقدم التفاعل مع HPLC. في نهاية التفاعل، حل الانفعالات مع 3.5 ملليلتر من 75٪ محلول المياه اسيتيل نيتريل وتطبيق الحل الناتج مباشرة إلى نظام HPLC شبه إعداد لتنقية المنتج المطلوب.لقياسات كفاءة الكم، تحت مصابيح الفلورسنت المغطاة مع الأشعة فوق البنفسجية قطع مرشح، وتمييع محلول المخزون عينة في 10 ميكرولترات من ثنائي الفينيل سلفوكسيد مع 10 ملليلتر من حاجز KMOPS. نقل aliquot من الحل في نفس أنبوب الاختبار المستخدمة في رد فعل الصورة من actinometer الكيميائية. تشعيع حل العينة مع ضوء 350 نانومتر لمدة خمس ثوان، وإزالة 50 aliquoter ميكرولتر من الحل المشعر بشكل دوري لتحليلها من قبل HPLC.ثم تحديد وقت التشعيع في ثوان في 90٪ من المواد بدءا رد فعل من خلال تركيب المؤامرات من اختفاء الوقت تعتمد على المواد بدءا. بالنسبة لاستهداف يغاند HaloTagnd لمركب قابل للانقر على قفص، حصاد السكان الخلية المستهدفة من الفائدة مع كاشف تفكك الخلايا المناسبة وإعادة تعليق الخلايا في 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز DMEM. ثم بذور ما يقرب من 10 إلى الخلايا الخامسة في الطبق الواحد في 35 ملليلتر أطباق القاع الزجاج لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪.في صباح اليوم التالي، تمييع 14 ميكروغرام من الحمض النووي PC ثلاثة تحليلية عامل نمو البشرة مستقبلات الحمض النووي البلازما في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر تحتوي على 700 ميكرولترات من متوسطة المصل منخفضة. بعد ذلك، أضف خمسة ميكرولترات من كاشف الشفط في 150 ميكرولترات من متوسطة المصل المنخفضة لكل من أربعة أنابيب والسماح للأنبوب بالوقوف في درجة الحرارة المحيطة لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة، إضافة 150 ميكرولترات من الحمض النووي البلازما المخفف إلى كل من العينات مفكك الدهون المخففة واحتضان العينات في درجة الحرارة المحيطة لمدة خمس دقائق إضافية.في نهاية الحضانة ، شطف الخلايا مع مليلترين من برنامج تلفزيوني لكل طبق وإضافة 1.5 ملليلتر من متوسطة المصل المخفضة لكل ثقافة. إضافة 150 ميكرولترات من مجمع الكشف شفط البلازميد إلى كل طبق وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة. في نهاية الحضانة، pirnatate االنبات وإضافة ملليلتر واحد من DMEM الطازجة التي تم إعدادها تكملها مع اثنين من paBhc الدقيقة الهك HEX فيتزي هالة لكل طبق.بعد 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، التعرق المتوسطة التي تحتوي على مركب في قفص وشطف الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني زائد لإزالة أي مركبات غير منضمة. إضافة 500 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة لكل طبق وإعادة الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة أخرى لإزالة المركبات التي دخلت الخلايا. في نهاية الحضانة، شطف الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني زائد لكل طبق وإضافة ملليلتر واحد من المتوسطة دون الفينول الأحمر إلى كل ثقافة.ثم تسجيل الصور فلوريسنس عن طريق مسح الليزر المجهر فلورانس confocal. بالنسبة للتشكيل بوساطة الصور لتعريب كيناز باستخدام مركب قابل للانقر على القفص ، بذور ما يقرب من خمس مرات 10 إلى الخلايا الخمس TOC-A-One في ملليلترين من متوسط F12 من هام لكل طبق قاع زجاجي 35 ملليلتر. في اليوم التالي، transfect الخلايا مع ترميز البلازميد لـ GFP diacylglycerol غاما لمدة 48 ساعة كما هو موضح فقط.بعد نهاية transfection، استبدال نابرات transfection مع مليلترين من متوسطة المصل مخفضة. إضافة 20 microliters من 100 مرة paBhcAA حل العمل للخلايا لمدة خمس إلى 60 دقيقة حضانة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة، ضع الطبق على المرحلة الموضوعية من مجهر الفلورسنت المقلوب المجهزة بمصباح فلورينسين مصدر الضوء المزدوج.صورة الخلايا كل 10 ثوان لمدة 10 دقائق أثناء تشعيع الخلايا في الوقت التجريبي المناسب والنقاط طول الموجة وفقا للبروتوكول التجريبي. باستخدام هذه الطريقة كما أظهرت، يمكن تجميع المركبات المحبوسة القابلة للانقر من بعض الجزيئات مثيرة للاهتمام بيولوجيا، بما في ذلك باكليتاكسيل وحمض arachidonic، بنجاح. خصائص إضافية مثل ذوبان المياه وقدرة استهداف الخلوية يمكن أن يتم إدخالها في paBhc نموذج paclitaxel عبر النحاس واحد حفزت الدراجات رد فعل فوق.ويمكن بعد ذلك أن تكون هذه paclitaxels القابلة للانقر على قفص مزيل ضوئي لإنتاج المركبات الأم عند التشعيع في 350 نانومتر. ويرد في الجدول موجز للخصائص الفيزيائية والضوئية الكيميائية للمركبات المحبوسة. في تجارب الخلايا الحية، واستهداف paBhc ست عشري فيتزي هالة ل الخلايا الثديية المستزرعة تعبر بشكل عابر عن البروتين HaloTagged ومستقبلات عامل النمو البشرة يحفز إشارة فلوريسكنس الخضراء من الفلوريسين مويتي PAHBHC hex fitzi الهالة على غشاء الخلية.وعلاوة على ذلك، فإن علاج CHO-K1 الخلايا تعبر بشكل عابر GFP diacyl الجليسرول كيناز غاما مع حمض arachidonic يسبب تعديل التعريب دون الخلوية من جاما diacyl الجليسرول كيناز. كما لوحظت تغيرات مماثلة في diacyl الجليسيرول كيناز جاما توطين في paBhc-AA الخلايا المعالجة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة. عند تنفيذ التجارب caging في المحاليل مائي زيادة ثقافة المتوسطة، تأكد من أن تعمل دائما تحت مصباح الفلورسنت مع موجة قصيرة طول مرشح توج.بعد هذا الإجراء، يمكنك دراسة المركبات المحبوسة التي كانت وفيرة للاستخدام في التجارب البيولوجية بسبب نقص ذوبان الماء، نفاذية الأغشية أو القدرة على استهداف الخلايا.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides (CHIPS)

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides CHIPS

توليف مشتقات المضادة للفيروسات عن طريق Tetrahydrocarbazole الضوئية وحمض حفز-CH Functionalization عبر الوسيط بيروكسيد (شيبس)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order ...

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

Synthesis of Non-uniformly Pr-doped SrTiO3 Ceramics and Their Thermoelectric Properties

توليف غير موحد العلاقات العامة مخدر SrTiO<sub&gt; 3</sub&gt; سيراميك وخصائص الحرارية منها

We demonstrate a novel synthesis strategy for the preparation of Pr-doped SrTiO3 ceramics via a combination of solid state reaction and spark plasma ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

الضوئية مؤكسد نمو إيريديوم أكسيد النانوية على سيلينيد الكادميوم @ أقراص مدمجة نانواعواد

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

توليف وتوصيف المواد الغروية Supramolecular

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

توليف سطحي من المذيلات تشبه دودة من الضوء المرئي وساطة التشتت البلمرة عن طريق Photoredox محفز

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

توليف وتوصيف مخدر الحديد ألومينوسيليكات الأنابيب النانوية مع خصائص موصل الكترون المحسن

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

تركيب أسلاك الاتحاد الأفريقي الركازة زمنياً عبر إليه نمو نشط السطح

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

خصائص سطح المركبة نانوبوروس الكربون ومصفوفات السليكا

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

سباتيوتيمبورالي الخاضعة لسيطرة النووية إزفاء من الضيوف في الخلايا الحية باستخدام الغراء الجزيئية محبوس كالعلامات فوتواكتيفاتابل

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles

تركيب وتوصيف جسيمات نانوية الذهب أمفيفيليك

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of ...